Обработка образцов протеомики дробовика автоматизирована лабораторным роботом с открытым исходным кодом
Summary
Подробный протокол и три скрипта Python предоставляются для работы роботизированной системы обработки жидкостей с открытым исходным кодом для выполнения полуавтоматизированной подготовки образцов белка для экспериментов масс-спектрометрии, охватывающих удаление моющих средств, переваривание белка и этапы обессоливания пептидов.
Abstract
Эксперименты по протеомике дробовика на основе масс-спектрометрии требуют нескольких этапов подготовки образцов, включая ферментативное переваривание и очистку белка, что может занять значительные человеко-часы труда на скамейке и представлять собой источник изменчивости от партии к партии. Автоматизация лабораторий с помощью роботов-пипеток может сократить ручную работу, максимизировать пропускную способность и повысить воспроизводимость исследований. Тем не менее, высокие стартовые цены на стандартные станции автоматизации делают их недоступными для многих академических лабораторий. В этой статье описывается рабочий процесс пробоподготовки протеомики с использованием доступной системы автоматизации с открытым исходным кодом (The Opentrons OT-2), включая инструкции по настройке полуавтоматических этапов восстановления белка, алкилирования, пищеварения и очистки; а также сопутствующие скрипты Python с открытым исходным кодом для программирования системы OT-2 через интерфейс прикладного программирования.
Introduction
Протеомика дробовика на основе масс-спектрометрии является мощным инструментом для измерения обилия многих белков в биологических образцах одновременно. Эксперименты по протеомике с анализом биоинформатики обычно используются для выявления биомаркеров и обнаружения связанных биологических комплексов и путей, лежащих в основе патологических механизмов. Обладая высокой аналитной специфичностью и потенциальной количественной точностью, протеомика дробовика также имеет отличный потенциал для принятия исследовательскими учреждениями и диагностическими лабораториями для анализа клинических образцов без необходимости полагаться на антитела1,2.
Чтобы подготовить образцы белка для анализа протеомики дробовика, белки, извлеченные из биологических образцов (например, клеток и тканей), обычно сначала должны быть обработаны с использованием длительных протоколов, включая измерение концентрации белка в образце, снижение белка и алкилирование, а также ферментативное переваривание в пептиды. Кроме того, белки, извлеченные в общих буферах лизиса, содержащих моющие средства, часто требуют дополнительных этапов буферного обмена или удаления моющего средства перед анализом, поскольку моющее средство может мешать пищеварению трипсина и значительно ухудшать производительность последующего анализа жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии (LC-MS / MS)3. Пептиды обычно дополнительно обессолены, высушены и восстановлены в LC-MS/MS совместимых растворителях после ферментативного сбраживания. Эти процедуры биохимии белка могут быть трудоемкими и трудоемкими. Таким образом, они продолжают ограничивать пропускную способность рабочих процессов протеомики и способствуют изменчивости получаемых данных4,5. Человеческие ошибки и предубеждения были признаны в качестве решающих факторов, влияющих на дисперсию и воспроизводимость данных6,7. Чтобы свести к минимуму человеческие ошибки в рабочих процессах масс-спектрометрической пробоподготовки, автоматизированные роботизированные системы пипетирования были использованы для повышения пропускной способности и воспроизводимости идентификации и количественной оценки белка с помощью протеомики дробовика и целевого масс-спектрометрического анализа, где такие достижения были высоко оценены как инструменты для продолжения стремления к широкому внедрению технологий протеомики в критических исследованиях и клинических условиях8, 9,10,11,12,13. Тем не менее, большинство существующих протоколов используют роботизированные платформы обработки жидкостей, которые требуют значительных инвестиций и обучения, ограничивая их полезность во многих лабораториях в академической среде или иным образом с ограниченным бюджетом.
В этой статье описывается протокол, который использует недорогую роботизированную систему обработки жидкостей с открытым исходным кодом, OT-2, для полуавтоматизации типичного рабочего процесса пробоподготовки протеомики дробовика. OT-2 имеет более низкую стоимость, чем многие другие роботизированные системы обработки жидкостей, и на момент написания статьи стоил примерно 5000 долларов США. Если учесть цены на различные модули и лабораторное полотно, общая стоимость проведения экспериментов по этому протоколу на момент написания статьи составляет около 10 000 долларов США, что делает его более доступным для значительно более широкого круга лабораторий по сравнению с более дорогими вариантами. OT-2 совместим с программированием с открытым исходным кодом с помощью скриптов Python и предлагает большую гибкость в разработке пользовательского протокола DIY. Используя три собственных сценария, приведенные ниже протоколы охватывают выполнение типичного рабочего процесса пробоподготовки протеомики дробовика на станции OT-2 с архетипичным стандартом белка (бычий сывороточный альбумин; BSA) и сложный образец белка нормального лизата сердца человека (рисунок 1). Процедуры обработки (1) образца BSA и (2) сложного образца лизата сердца подробно описаны в разделах Протокола 1, 2, 5, 6 и 3, 4, 5, 6 соответственно. Модифицированные карбоксилатом магнитные шарики Sera-Mag используются в однофазной твердофазной пробоподготовке (SP3) для удаления моющих средств и солей из белковых и пептидных образцов. Триптические дигесты из бычьего сывороточного альбумина и сердечных белков человека дополнительно очищаются шариками SP3 и представляются для анализа LC-MS / MS. Затем масс-спектры анализируются с использованием программного обеспечения MaxQuant для идентификации пептидов и белков. Репрезентативные результаты, выполненные нами, показывают, что протокол достигает отличных технических коэффициентов вариации (CV) при экономии времени стенда и не уступает ручному дайджесту.
Protocol
Representative Results
Discussion
Критические шаги в рамках протокола
Для достижения наилучшей производительности следует использовать проверенную Opentrons лабораторную посуду, модули и расходные материалы, совместимые с OT-2. Пользовательское лабораторное ПО может быть создано в соответствии с инструкцией Open…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была частично поддержана наградами NIH F32-HL149191 YH; R00-HL144829 в EL; R21-HL150456, R00-HL127302, R01-HL141278 в MPL. Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3 создаются с помощью веб-инструмента научной иллюстрации, BioRender.com.
Materials
| 300 µL pipette tips | Opentrons | ||
| 4-in-1 tube rack set | Opentrons | Each set includes 2 base stands and 4 tube holder tops 1.5mL, 2mL, 15mL + 50mL, 15mL, and 50mL. We use 2mL and 15 mL + 50 mL tops in this study. | |
| Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Column | Thermo Scientific | #164568 | 3 μm particle; 100 Å pore; 75 μm x 150 mm |
| Acetonitrile LC-MS grade | VWR | #JT9829 | |
| Aluminum block set | Opentrons | This block set includes 3 tops that are compatible with 96-well, 2.0 mL tubes and a PCR strip to use with the OT-2 temperature module. We use the 2.0mL tube holder in this manuscript. | |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | # A6141 | |
| Bovine Serum Albumin Standard, 2 mg/mL | Thermo Scientific | #23210 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) LC-MS grade | Thermo Scientific | #85190 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | #D5545 | |
| EASY-Spray HPLC Columns | Thermo Scientific | #ES800A | |
| EasynLC 1200 Nano LC | Thermo Scientific | #LC140 | |
| Ethanol Proof 195-200 | Fisher | #04-355-720 | |
| Formic Acid LC-MS grade | Thermo Scientific | #85178 | |
| Human heart lysate | Novus Biologicals | NB820-59217 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | #I1149 | |
| Magnetic tube rack | Thermo Scientific | #MR02 | |
| MAXQuant v.1.6.10.43 | Tyanova et al., 2016 (https://www.maxquant.org/) | ||
| mySPIN 6 Mini Centrifuge | Thermo Scientific | #75004061 | benchtop mini centrifuge for quick spin |
| NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom | Opentrons | ||
| OT-2 magnetic module | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 P300 single channel pipette | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 P50 single channel pipette | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 robot pipetting robot | Opentrons | OT-2 | |
| OT-2 temperature module | Opentrons | GEN1 | |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | #23275 | |
| Protein LoBind tubes 2.0 mL | Eppendorf | #022431102 | |
| Protein Sequence Database | UniProt/SwissProt | https://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640% 20reviewed:yes |
|
| Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophobic | Cytiva | #65152105050250 | |
| Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophylic | Cytiva | #45152105050250 | |
| SpeedVac | Thermo Scientific | Vacuum evaporator | |
| Thermo Q Exactive HF Mass Spectrometer | Thermo Scientific | #IQLAAEGAAPFALGMBFZ | |
| Trypsin MS Grade | Thermo Scientific | #90057 | |
| Water LC-MS grade | VWR | #BDH83645.400 |
References
- Geyer, P. E., et al. Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics. Molecular Systems Biology. 13 (9), 942 (2017).
- Coscia, F., et al. A streamlined mass spectrometry-based proteomics workflow for large-scale FFPE tissue analysis. The Journal of Pathology. 251 (1), 100-112 (2020).
- Yeung, Y. -. G., Neives, E., Angeletti, R., Stanley, E. R., et al. Removal of detergents from protein digests for mass spectrometry analysis. Analytical Biochemistry. 382 (2), 135-137 (2008).
- Addona, T. A., et al. Multi-site assessment of the precision and reproducibility of multiple reaction monitoring-based measurements of proteins in plasma. Nature Biotechnology. 27 (7), 633-641 (2009).
- Lowenthal, M. S., Liang, Y., Phinney, K. W., Stein, S. E. Quantitative bottom-up proteomics depends on digestion conditions. Analytical Chemistry. 86 (1), 551-558 (2014).
- Elliott, K. C., Resnik, D. B. Scientific reproducibility, human error, and public policy. Bioscience. 65 (1), 5-6 (2015).
- Brown, A. W., Kaiser, K. A., Allison, D. B. Issues with data and analyses: Errors, underlying themes, and potential solutions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (11), 2563-2570 (2018).
- van den Broek, I., et al. Automated multiplex LC-MS/MS assay for quantifying serum apolipoproteins A-I, B, C-I, C-II, C-III, and E with qualitative apolipoprotein E phenotypic. Clinical Chemistry. 62 (1), 188-197 (2016).
- Müller, T., et al. Automated sample preparation with SP3 for low-input clinical proteomics. Molecular Systems Biology. 16 (1), 9111 (2020).
- Fu, Q., et al. Highly reproducible automated proteomics sample preparation workflow for quantitative mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 17 (1), 420-428 (2018).
- Liu, X., Gygi, S. P., Paulo, J. A. A semiautomated paramagnetic bead-based platform for isobaric tag sample preparation. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (6), 1519-1529 (2021).
- Poulsen, K. M., Pho, T., Champion, J. A., Payne, C. K. Automation and low-cost proteomics for characterization of the protein corona: experimental methods for big data. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 6543-6551 (2020).
- Liang, Y., et al. Fully automated sample processing and analysis workflow for low-input proteome profiling. Analytical Chemistry. 93 (3), 1658-1666 (2021).
- . Web URL Available from: https://opentrons.com/ot-app/ (2021)
- . Web URL Available from: https://docs.opentrons.com/v2/ (2021)
- . Web URL Available from: https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/genomics/knowledge-center/cleanup-for-mass-spectrometry (2021)
- . Web URL Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23275#/23275 (2021)
- Han, Y., Wright, J. M., Lau, E., Lam, M. P. Y. Determining alternative protein isoform expression using RNA sequencing and mass spectrometry. STAR Protocols. 1 (3), 100138 (2020).
