BEMÆRK: Prøver, der undersøges ved hjælp af iTACS-platformen, er celler, der klæbes til et blødt substrat. Protokollen til vurdering af mekaniske og kemiske signaler er opdelt i to sekventielle dele: Anskaffelses- og træningsmodul (AcTrM) og Analyse- og Visualiseringsmodul (AnViM). 1. Erhvervelse og uddannelse modul (AcTrM) BEMÆRK: AcTrM automatiserer processen med dataindsamling og bruger selvtræning. Før dataindsamling skal du forberede et blødt substrat, der er i stand til at give de oplysninger, der er nødvendige for at kvantificere de kræfter, som celler udøver på det. Hydrogel forberedelseBEMÆRK: Målet her er at forberede en 1.250 Pa forskydning modulus, ca 100 μm tykkelse, og 22 mm diameter polyacrylamid (PAA) hydrogel. Forbered polyacrylamidopløsning ved at følge metoden Yeung et al. og støbt hydrogelerne følgende trin beskrevet af Trepat et al.14,15. En undtagelse fra proceduren er, at perlerne indlejret umiddelbart under cellerne er 0,5 μm i diameter og udsender gul fluorescens. Spring trinnet med at fastgøre 2 μm perler til dækglasset, hvis visningsområdet forventes at have et stort cellefrit område.BEMÆRK: Hydrogel forberedelse protokol er nu temmelig etableret i marken16. I hele den efterfølgende beskrivelse omtales de 0,5 μm perler som »topperler«, og de 2 μm perler betegnes som »bundperler«. De nederste perler er dog valgfrie, hvor det afbildede område indeholder et stort cellefrit område. Den øverste perle mønster fra en sådan cellefri region vil tjene formålet med den nederste perle mønster. Monter hydrogel med indlejrede fluorescerende perler på mikroskopstadiet. Tillad 15-20 min for temperaturen på pladen for at opnå en steady-state.BEMÆRK: Pladens øverste overflade er funktionaliseret med ekstracellulære matrixproteiner, men cellerne er endnu ikke sået på hydrogelen. Erhvervelse af referencebillede Del 1: Oprette en stillingslisteBEMÆRK: Manuel input i dette trin omfatter at følge AcTrM-prompterne om at vælge placeringer med den bedste perlefordeling. Der bruges ingen tidligere oprettede filer i dette trin. De vigtigste nye mapper, der produceres i dette trin, omfatter mapperne ‘t0imgs’, ‘tnimgs’ og ‘textfiles’, og den producerede fil indeholder positionlistefilen. Se figur 2 for den visuelle beskrivelse af følgende trin, der styrer oprettelsen af en stillingsliste ved hjælp af AcTrM. Det demonstrerede eksempel indsamler data ved 20x forstørrelse. Start μManager 2.0 – Beta. Kør AcTrM ved at klikke på knappen AcTrM.bsh i vinduet IMBL Resources . I vinduet Definer anskaffelsesegenskaber skal du vælge det relevante mål, tolerance for nøjagtigheden af lateral position (dvs. XY) opsving, trinstørrelse af grov og raffineret refokusering (dvs. z) operation og værdien af acceptabel billedkorrelationskoefficient for fokusgendannelse.BEMÆRK: En finere tolerance for lateral position opsving vil bremse position opsving, men en betydelig tolerance vil kræve position korrektion under dataanalyse og kan forårsage vanskeligheder i fokus opsving. En mindre trinstørrelse vil bremse refokuseringsoperationen, men en meget høj trinstørrelse kan forårsage hurtig bevægelse med muligheder for at gå glip af fokus. Vælg Frisk anskaffelse i vinduet AcTrM – Trin 0 for at oprette en stillingsliste.BEMÆRK: Vinduet med titlen AcTrM – Trin 1 viser alle de næste vigtige trin. Disse trin omfatter flytning af scenen, justering af fokus og klik på knapper i μManager. Disse trin er en rettesnor for opbygningen af listen over stillinger, der er egnede til dataindsamling. Klik på Live in Micromanager for at visualisere prøverne til manuelle justeringer, der er angivet i vinduet AcTrM – Trin 1 . Følg trinnene i dette vindue. Nu erhverve billedet af perlerne. Vælg den relevante kanal til de øverste perler. Sørg for at se på de nederste perler så godt. For at gøre dette skal du vælge kanalerne til de nederste perler. Et sløret billede af bundperler ses.BEMÆRK: Kanaler kan skiftes fra den forudindstillede rullemenu i hovedvinduet i μManager. Hvis de nederste perler anvendes i eksperimentet, skal du sikre dig, at de er til stede i den valgte position. Disse perler vil virke slørede. Når du vælger den relevante placering, skal du klikke på Marker i vinduet Placeringsliste for at gemme placeringen.BEMÆRK: Den bedste position defineres ved en tæt og ensartet fordeling af de øverste perler, der er indlejret umiddelbart under den øverste overflade (dvs. topperler) og mindst to perler fastgjort til dækglasset (dvs. bundperler) (supplerende figur S1). Fokus opsving er hurtigere, hvis de nederste perler vises som store, out-of-fokus ringe. Men hvis eksperimenter udføres i en position uden behov for fokus eller lateral position opsving, ignorere instruktioner relateret til de nederste perler billede. Følg trin 6-9, der er beskrevet i figur 2 , for at medtage yderligere placeringer på listen.BEMÆRK: Vælg et par ekstra positioner, så en runde eliminering kan give mulighed for de bedste positioner valgt på pladen. Del 2: Erhvervelse af referencebillederBEMÆRK: Dette trin omfatter ikke nogen manuel input. Tidligere oprettede nøglefiler, der bruges i dette trin, omfatter ‘textfiles/*.pos’. De vigtigste nye filer og mapper, der produceres i dette trin, omfatter dem i mapperne ‘t0imgs’ og ‘tnimgs’. Se figur 3 og supplerende figur S2 for den visuelle beskrivelse af følgende trin, der styrer erhvervelsen af referencebilleder ved hjælp af AcTrM. Vinduet AcTrM – Trin 2 viser også alle de vigtigste trin. Følg de trin, der er angivet i vinduet AcTrM – Trin 2 , skal du foretage valgmulighederne i vinduet Flerdimensional anskaffelse . For eksempel, for at udføre en lang tid bortfalder, angive et antal billeder, der skal tages, skal du vælge den første kanal som fase kanal, og derefter vælge den næste for de øverste perler og den ene efter det er for bund perler. Klik på Luk i vinduet Flerdimensionel anskaffelse , og klik derefter på OK i vinduet ActrM – Trin 2 . I vinduet AcTrM – Trin 3 skal du vælge at aktivere den referencebilledebaserede XYZ-positionsgendannelse. Valget er generelt ja. Men hvis billeder erhverves på en position uden plads til fokus eller fase drift, vil valget i AcTrM – Trin 3 vindue være Nej. I vinduet AcTrM – XYZ Recovery Options skal du indstille kanalen til grov XYZ-gendannelse, om du vil udføre raffineret XYZ-gendannelse, region og kanal til raffineret XYZ-gendannelse og retningen til at begynde at fokusere igen (supplerende figur S4). Når acTrM er færdig, vil den anskaffe referencebilleder.BEMÆRK: Typiske valg for kanalen vil være den nederste perler kanal. XYZ opsving fungerer bedst, når de udføres med det fulde billede i den aktuelle implementering. Referencebilleder vil typisk omfatte et transmitteret lysbillede af hydrogel, et fluorescerende billede af topperler og et fluorescerende billede af de nederste perler. Hvert billedsæts indhold kan variere afhængigt af de valg, der er foretaget i vinduet Flerdimensional anskaffelse . Alligevel vil softwaren erhverve referencebilledet, der er indstillet på hver position bestemt i figur 2. I slutningen af dette trin oprettes der tre mapper i den valgte mappe: ‘t0imgs’, ‘tnimgs’ og ‘textfiles’. Mappen ‘t0imgs’ indeholder referencebilleder i det format, der genkendes af μManager og bruges i efterfølgende trin. Mappen ‘tnimgs’ indeholder separate TIFF-billeder med filnavnene ‘c0_p0_t0.tif’, ‘c1_p0_t0.tif’ osv. Her står ‘c’ for kanalen, ‘p’ står for positionen, og ‘t’ står for tiden. Efter disse bogstaver følger henholdsvis kanalnummeret, positionnummeret og rammenummeret. Mappen ‘textfiles’ indeholder placeringslisten i XML-format og brugervalg til billedopsamling og placeringsgenoprettelse. Cellesåning og vækstBEMÆRK: iTACS-platformen har fleksibilitet til at rumme prøveforberedelsesprotokoller, der anvendes til fælles in vitro-vurdering af klæbende cellers mekaniske adfærd, herunder sparsomme celler, fuldt sammenflydende monolag, netværksdannelsesanalyse og monolag med huller eller betydelige huller. Kultur rotte lungemikrovaskulære endotelceller til sammenløb i en kolbe17,18. Tag cellerne af ved hjælp af trypsin. Brug cellerne i et kulturmedium, der indeholder 10 % føtalt kvægserum, til en koncentration på 1 x 106 celler/mL. Placer en 5 μL dråbe af de ophængte celler på en delvist tør hydrogel overflade og placere den i cellekultur inkubatoren.BEMÆRK: Efter 2 dage i kulturmediet, der indeholder 10% fosterkvægsserum, danner cellerne i dråben en overfyldt ø af celler1. Automatiseret billedopsamling for det resterende eksperimentBEMÆRK: Manuel input til dette trin omfatter at følge AcTrM-prompterne for at genoptage afbildningsopsamlingen. De tidligere oprettede filer, der bruges af dette trin, omfatter ‘textfiles/*.pos’ og bundperlebilledfiler i mappen ‘t0imgs’. De vigtigste nye filer, der produceres i dette trin, omfatter opdaterede positionlistefiler og billeder ‘tnimgs/*_t* .tif’. Sørg for, at mikroskopets miljøkontrolsystem når stabile vævskulturforhold. Monter forsigtigt pladen med dyrkede celler på mikroskopstadiet. Tillad 15-20 min for temperatur og fugtighed til at stabilisere.BEMÆRK: Se figur 4 for den visuelle beskrivelse af følgende trin, der styrer erhvervelsen af billeder til det resterende eksperiment ved hjælp af AcTrM. Start μManager 2.0 – Beta. Kør AcTrM ved at klikke på knappen AcTrM.bsh i vinduet IMBL Resources .BEMÆRK: Ignorer de valg, der er foretaget i vinduet Definer egenskaber for anskaffelse, men brug de valg, der blev foretaget i forrige trin. Vælg Fortsæt midlertidigt afbrudt anskaffelse i vinduet AcTrM – Trin 0. Vælg den forstørrelse og mappe, der er identificeret i vinduet Multidimensionel anskaffelse i det tidligere trin, hvor datamapper (‘t0imags’, ‘tnimgs’ og ‘textfiles’ blev gemt.BEMÆRK: Titlen på vinduet hjælper brugeren med at vælge den relevante mappe. I vinduet Omplacering af pladen skal du vælge valg til omplacering af pladen (tre ikke-lineære positioner) sammen med den kanal, der bruges til at flytte.BEMÆRK: Gemte billeder vil blive set i kameraet. Hvis overlappende billeder vises som et rødt, grønt og sort farvebillede, skal du udføre manuel justering. Klik på Accepter for at fortsætte med købet.BEMÆRK: Dette trin overvinder de små skift fra uigenkaldeligheden af pladejustering, når pladen monteres igen på mikroskopstadiet. Følg AcTrM beder om at fremskynde justering på hver af de tre positioner ved at vise et sammensat billede af referencebilledet vist med rødt (typisk af de nederste perler) og billedet i øjeblikket observeret gennem målet vist med grønt. Kom den grønne tilstrækkeligt tæt på røde blade mindre arbejde for softwaren. Når overlapningen er perfekt, vises det sammensatte billede gult og sort. Tilstrækkelig tæt er typisk, når de samme bundperler er synlige i både røde og grønne billeder, og de tilsvarende røde og grønne out-of-focus ringe rører hinanden. Når pladens repositionering er færdig, tager AcTrM scenen til hver valgt position og genopretter XYZ-positionen ved at matche referencebilledet med det, der i øjeblikket ses gennem kameraet. Den første laterale (XY) position matches, og derefter er fokus (Z) matchet. Hård genopretning efterfølges af raffineret genopretning af positionen og fokus. Opdateringer af eksperimentets aktuelle status vises på skærmen via et vindue i fire dele, der vises i supplerende figur S3. De erhvervede billeder gemmes i mappen ‘tnimgs’ efter ‘*_t1.tif’, ‘*_t2.tif’, hvilket angiver tidstallet for billedsættet. Hvis XYZ-gendannelse identificerer en opdateret placering, genereres og gemmes den nye placeringsliste i mappen ‘textfiles’. 2. Analyse og Visualisering Modul (AnViM) Opsætning af automatiseret dataanalyseBEMÆRK: Manuel input i dette trin omfatter identifikation af placeringen af mappen ‘tnimgs’. De tidligere oprettede filer, der bruges i dette trin, omfatter ‘tnimgs/*.tif’. De vigtigste nye filer og mapper, der produceres i dette trin, omfatter mappen ‘analyse’ i samme overordnede mappe som ‘tnimgs’ og mapper for hver position ‘analyse/p*’. Inden for hver ‘analyse /p*’ opretter dette trin en ny ‘* .tif’ billedfiler inden for ‘phs’ og ‘tny’ mapper. Disse billeder er beskåret og afdriftet billeder af celler og top perler. De andre oprettede filer omfatter ‘analyse/analyseValg.txt’, som viser analysevalg, ‘analyse/p*/skipAnalysis.txt’, som viser tilfælde, hvor analysen springes over på grund af betydelig allerede eksisterende drift, og ‘analyse/p*/part_shift_values_pixel_degree.dat’, som viser anslåede driftsværdier. AnViM ændrer ikke de rå data i mappen ‘tnimgs’. Se Figur 5 for at få en visuel beskrivelse af følgende trin, der styrer oprettelsen af automatiseret dataanalyse ved hjælp af AnViM. Start Fiji-softwaren, og vælg den første mulighed i rullemenuen MSM , der er mærket som MSM – forbehandling. Brug filbrowserdialogboksen til at vælge den mappe, der indeholder mappen ‘tnimgs’, som indeholder de analyserede data. Definer kanalen for billederne. I kølvandet på retningslinjerne fra supplerende figur S5 skal du identificere kanalnumrene på cellernes transmitterede lysbillede (cellernes fasekontrastbillede), bundperlers billede og billedet af topperler. Følgende tre afkrydsningsfelter (‘Flyt filer til positionsmappen’, ‘Do additional correction for rigid motion’ og ‘Crop data and save in position folder’) kontrolleres typisk. Endelig definere tolerance for at afvise stærkt drev data, pixel størrelse, og sider af billedet, hvor cellerne krydser. Svar på prompten for at øge lysstyrken og kontrasten i de nederste perlebilleder, så perlerne vises fremtrædende. Juster dette ved hjælp af skyderen i menuen, og klik på OK. Udfør nu position korrektion for at slippe af med skift, hvis nogen. Når det er gjort, oprettes der en analysemappe.BEMÆRK: Kontrastforbedring er typisk ikke nødvendig, men denne bestemmelse er tilgængelig for eksperimenter, hvor eksponering for lasere skal minimeres. Efter dette valg kopierer AnViM filerne fra mappen ‘tnimgs’ til mappen ‘analyse’. De filer, der svarer til hver position, gemmes i mapperne ‘analyse/p0, analyse/p1’ osv. Inden for hver af disse position mapper, AnViM gør ‘cels’, ‘defs’, og ‘refs’ mapper, der indeholder den oprindelige transmitterede lys billede, top perler billeder, og bund perler billeder, henholdsvis (supplerende figur S6). AnViM analyserer derefter stiv bevægelse i billederne af de nederste perler og skaber en ‘phs’ mappe, der indeholder et korrigeret transmitteret lysbillede af cellerne og en ‘tny’ mappe, der indeholder opdaterede topperler billeder. Endelig gemmes brugervalg af kanaler, operationer, tolerance, pixelstørrelse og grænsekrydsning i filen ‘analysisChoices.txt’ (supplerende figur S6). Kvantificering af deformation af hydrogel og monolayerBEMÆRK: Det er vigtigt at bemærke, at kvantificering af bevægelse fra en sekvens af billeder er et hurtigt udviklende felt19. Teknologien er konstant optimeret til funktioner, herunder hastighed, nøjagtighed, specifikke funktioner i de rå billeder og specifikke deformationsmønstre. Derfor er det sandsynligt, at nogle brugere kan bruge en anden deformation kvantificering tilgang end den, der præsenteres her. Del 1: Kvantificering af hydrogel deformationBEMÆRK: Manuelle input i dette trin omfatter identifikation af datamappe og valg af gitteropløsning. De tidligere oprettede filer, der bruges i dette trin, omfatter ‘p*/tny/*.tif’. De vigtigste nye filer, der er produceret i dette, omfatter ‘p*/displacement/*_disp.dat’, der viser forskydningsvektorer på hydrogelens øverste overflade. Se figur 6 for den visuelle beskrivelse af følgende trin til at engagere, via AnViM, partikelbilledet Velocimetry analyse på toppen perler billeder20. Start Fiji-softwaren, og vælg MSM – Gel Deformation i rullemenuen MSM. Herfra skal du vælge den indstilling, der passer til eksperimentet. Brug dialogboksen filbrowser til at vælge den overordnede mappe i den ‘analyse’-mappe, der indeholder de analyserede data. Vælg den relevante vinduesstørrelse, støjniveau og tærskel (supplerende figur S7)20 i vinduet Parametre til beregning af geldeformation.BEMÆRK: Resultaterne gemmes i en nyoprettet ‘forskydningsmappe’ i hver positionsmappe ‘analyse/p0, analyse/p1’ osv. Det er her, alle outputfilerne er gemt. Del 2: Kvantificering af monolagsdeformationBEMÆRK: Manuelle input i dette trin omfatter identifikation af datamappen og valg af gitteropløsning. De tidligere oprettede filer, der bruges i dette trin, omfatter ‘p*/tny/*.tif’. De vigtigste nye filer, der produceres i dette, omfatter ‘p*/hastighed/*_vel.dat’, der viser cellernes bevægelsesvektorer. Se figur 7 for den visuelle beskrivelse af de trin, der via AnViM skal aktivere partikelbilledanalysen velocimetri på de øverste perler billeder20. Proceduren svarer til den, der følges for kvantificering af hydrogeldeformation og vælger MSM – Cellular Motion fra MSM-rullemenuen . Resultaterne gemmes i en nyoprettet ‘hastighed’ mappe inden for hver position mappe ‘analyse / p0’, ‘analyse / p1’, osv. Kvantificering af celle-ECM og cellecellekræfterBEMÆRK: Manuel input i dette trin omfatter identifikation af datamappen, angivelse af hydrogelstivhed og reaktion på cellulære klyngesegmenteringsmeddelelser for at registrere celler fra no-cell-området. De tidligere oprettede filer, der bruges i dette trin, omfatter ‘p*/displacement/*_disp.dat’. De vigtigste nye filer, der er udarbejdet i dette trin, omfatter: »p*/traction/*_trac.dat«, som opregner de kræfter, som cellerne udøver på hydrogelen; »p*/traction/*_domain.dat«, som viser placeringen af gitterpunkter, der indeholder celler og inputfiler ‘p*/traction.in, p*/clusterInput.txt’ og ‘p*/prestress.in’, der registrerer brugervalg for dette trin. Efter den første kvantitative vurdering af celle-ECM og cellecellekræfter er der udviklet flere variationer af teknikken1,15. Variationerne fokuserer på særlige tilfælde af substrater, celler, eksperimentelle tilstande eller numeriske værktøjer7,8,21,22. Se figur 8 for den visuelle beskrivelse til at engagere via AnViM, Fourier Transform Traction Microscopy, og Monolayer Stress Mikroskopi analyse på hydrogel deformation data1,2,15. Start Fiji-softwaren, og vælg MSM – Cell-ECM og Cell-Cell Forces (tredje mulighed i rullemenuen) fra rullemenuen MSM . Brug filbrowserdialogboksen til at vælge den overordnede mappe i mappen ‘analyse’, der indeholder mapperne ‘tnimgs’ og ‘analyse’, der indeholder analyserede data. Klik på Vælg. I vinduet Parametre for Beregning af cellulære kræfter skal du indtaste forskydningsmodulus , tykkelsen af hydrogelen og det forventede støjniveau. Vælg OK. Dette gør det muligt at udføre trækkraft via MATLAB-funktionen.BEMÆRK: Efter disse input beregner AnViM celle-ECM-kræfter. Derefter skal du angive, om monolag er sammenflyttet. Hvis hele cellebilledet er dækket af celler, er svaret Ja. I så fald beregnes cellecellekræfterne på tværs af hele rammen. På den anden side, hvis en del af billedet ikke har celler, er svaret nej. I så fald skal du følge AnViM-prompter for at lette segmentering af det billedområde, der indeholder celler. Hvis svaret er nej, skal du manuelt tegne en polygon rundt om det ikke-celleobjekt, når softwaren beder om det, og derefter vælge en eller flere metoder til segmentering. Softwaren vil bede om farven (sort eller hvid) af cellerne. Markér indstillingen Udfyld pletter automatisk i softwaren, og klik på OK.BEMÆRK: Trinene til segmentering af et ikke-sammenflydende monolag vil blive dækket i første del af ‘afsnit 2.4. Celle-ECM-kræfter gemmes i ‘*_trac.dat’ filer i en nyoprettet mappe ‘trækkraft’ i hver position mappe, og input til celle-ECM kraft beregning software gemmes i filen ‘traction.in’ (supplerende figur S8). Cellecellekræfter gemmes i ‘*_prestress.dat’ filer i en nyoprettet mappe ‘prestress’ i hver positionsmappe, og inputtet til cellecellekraftberegningssoftwaren gemmes i filen ‘prestress.in’ (supplerende figur S9). Tilknytning af gitterpunktværdier på individuelle cellerBEMÆRK: Et af de nuværende fokuspunkter i iTACS er at indføre en enkel tilgang til fortolkning af de målte mekaniske signaler i marken. Denne tilgang er gavnlig for at undersøge mekaniske interaktioner mellem naboceller i en klynge18. Samlet set er de egenskaber, der er kvantificeret indtil nu, på regelmæssigt fordelte gitterpunkter på tværs af celleklyngen. Disse data identificerer median-, middel- og standardafvigelse af udvalgte egenskaber inden for de enkelte cellers morfologiske grænse og tildeler dem som cellulære fysiske egenskaber/signaler. Fra disse bruges standardafvigelsen til at angive variabilitet, forskellen mellem middelværdi og median bruges til at angive fordelingens art, og medianværdien bruges til at angive cellernes overordnede tilstand for de valgte egenskaber.Del 1: Segmentering af det billedområde, der indeholder cellerBEMÆRK: Manuel input til dette trin omfatter identifikation af datamappe og svar på segmenteringsmeddelelserne for at registrere celler fra området uden celler. De tidligere oprettede filer, der bruges i dette trin, omfatter ‘p*/phs/*.tif’. De vigtigste nye filer, der produceres i dette trin, omfatter ‘p*/phs/bwImages/*.tif’, som er binære billeder, der adskiller celleområder fra områder uden celler, ‘p*/phs/textResults/frameNum_percentHealed.txt’, som viser procent billedareal, der er dækket af celler i hver forekomst, og ‘p*/clusterInput.txt’, som registrerer brugervalg, der er angivet i AcTrM-grænsefladen. Se Figur 9 for at få en visuel beskrivelse af følgende trin for at segmentere det billedområde, der indeholder celler. Denne del skal udfyldes, før cellecellekræfterne beregnes. I så fald behøver disse trin ikke at blive gentaget. Hvis disse trin udføres før cellecellekraftberegningerne, anmodes der heller ikke om dem i begyndelsen af kraftberegningerne. Start Fiji-softwaren, og vælg Segmentering – Cellulær klynge i rullemenuen MSM. Ved hjælp af filbrowserdialogen skal du vælge positionsmappen ‘analyse/p0’, ‘analyse/p1’ osv., der indeholder egenskaber, der er kvantificeret på regelmæssigt fordelte gitterpunkter. Angiv, om monolag er sammenflyttet.BEMÆRK: Nedenstående trin aktiveres kun, når monolag ikke er sammenflyttet. Følg AnViM beder om at anvende den nye flerstrengede tilgang til at identificere de billedområder, der indeholder celler. Processen involverer fire metoder – hver nærmer segmentering på en anden måde. En eller flere af disse metoder, der anvendes i kombination, dækker en bred vifte af billeder af cellerne. Prøv derfor forskellige tilgange for at finde ud af, hvilken kombination der fungerer bedst for deres data. Juster ‘Domæneforbindelsesfaktoren’ og ‘Smear-faktoren’ for at opnå optimal segmentering.BEMÆRK: ‘Smear-faktoren’ gør de områder, der indeholder celler større. Angiv, om cellerne ser sorte eller hvide ud i det binære billede. I vinduet Rutevejledning til rensning af grænsebilledet skal du vælge, om billedet skal renses automatisk eller manuelt.BEMÆRK: Uønskede funktioner i billederne er sorte pletter på pixels besat af celler og hvide pletter på pixels afbrudt fra celleklyngen, der skal analyseres. Analyse kan kun foretages på de områder, der er tilsluttet. Så flere afbrudte områder skal analyseres separat. Del 2: Segmentering af de enkelte celler i billederneBEMÆRK: Manuelle input til dette trin omfatter identifikation af datamappen og reaktion på segmenteringsmeddelelserne for at registrere individuelle celler i billedet. De tidligere oprettede filer, der bruges i dette trin, omfatter ‘p*/phs/*.tif’ og ‘p*/phs/bwImages/*.tif’. De vigtigste nye filer, der produceres, omfatter ‘p*/phs/textResults/*.csv’, som indeholder cellulære morfologiske egenskaber. Se figur 10 for at få en visuel beskrivelse af følgende trin for at segmentere monolagens individuelle celler. Start Fiji-softwaren, og vælg Segmentering – individuelle celler i rullemenuen MSM. Ved hjælp af filbrowserdialogen skal du vælge positionsmappen ‘analyse/p0’, ‘analyse/p1’ osv., der indeholder egenskaber, der er kvantificeret på regelmæssigt fordelte gitterpunkter. Angiv det maksimale højde-bredde-forhold i vinduet Vælg inputparametre , hvor meget cellecentret skiller sig ud i forhold til cellegrænsen, og to sløringsparametre, der styrer påvisning af cellerne (supplerende figur S10). Tegn en polygon på den mindste normale celle på billedstakken for hver placering. Dette bruges til at beregne området. Noget mindre end dette vil ikke blive betragtet som en celle af softwaren. Træk derefter en polygon rundt om den største normale celle og angiv, om cellecentret eller cellecellegrænsefladen er lysere.BEMÆRK: AnViM opretter derefter filer ‘phs/textBehør/0001.csv’, ‘phs/textResultater/0002.csv’ osv., for hver ramme, der indeholder oplysninger om celler inden for den pågældende ramme. På dette stadium indeholder denne fil morfologiske oplysninger om cellerne, herunder område, centroid, perimeter, orientering, cirkularitet, billedformat, afrundethed, soliditet, afstand fra no-cell-regionen. Længdeenheden i disse egenskaber er pixel, og vinklen er i grader. Endelig opdateres denne fil, så den indeholder mobil pixelintensitet, bevægelse og kræfter i de efterfølgende trin. Del 3: Kortlægning af pixelintensiteterne på cellerneBEMÆRK: Manuelle input i dette trin omfatter identifikation af datamappen og valg af tilknytningsegenskaber og -parametre. De tidligere oprettede filer, der bruges i dette trin, omfatter ‘p*/phs/*.tif’ (eller ‘p*/fluo/*.tif’) og ‘p*/phs/bwImages/*.tif’. De vigtigste nye filer, der produceres i dette trin, omfatter ‘p*/phs/textResults/*.csv’, som viser cellulære morfologiske egenskaber. Se figur 11 for den visuelle beskrivelse af følgende trin til vurdering af pixelintensiteterne i området, der er omfattet af individuelle celler og deres naboområde, og definere dem som egenskaber for cellerne. Start Fiji-softwaren, og vælg Kort på Celler – intensiteter i rullemenuen MSM. Ved hjælp af filbrowserdialogen skal du vælge positionsmappen ‘analyse/p0’, ‘analyse/p1’ osv., der indeholder egenskaber, der er kvantificeret på regelmæssigt fordelte gitterpunkter. Vælg Find celledeling eller Kvantificer cellulær fluorescens, når du bliver bedt om det af softwaren. Definer størrelsen på det nærliggende område. Markér både indsamleegenskaberne for naboområdet og indsamle egenskaber for cellerne. Klik på OK. I vinduet Formål at registrere vinduet Cellulær intensitet skal du angive, hvilken type billede der skal bruges til intensitetstilknytning, størrelsen af det nærliggende område, og om der indsamles data for individuelle celler eller begge celler og deres tilstødende områder (supplerende figur S11).BEMÆRK: Kortlægning af pixelintensiteterne i et fasekontrastbillede gør det muligt at registrere celledelingshændelser. Kortlægning af fluorescerende billedintensiteter vil gøre det muligt at påvise udsving i de fluorescerende mærkede cytoplasmaiske molekyler. Outputtet af ovenstående trin er middel-, median-, standardafvigelses-, minimum- og maksimumpixets intensitetsværdier for de enkelte celler. Disse tal indtastes som nye kolonner i filerne ‘phs/textResults/0001.csv’, ‘phs/textResults/0002.csv’ osv. Del 4: Kortlægning af kræfter og bevægelse på cellerneBEMÆRK: Manuelle input til dette trin omfatter identifikation af datamappen og valg af tilknytningsegenskaber og -parametre. De tidligere oprettede filer, der bruges i dette trin, omfatter ‘p*/phs/textResults/*.csv’, ‘p*/velocity/*_vel.dat’, ‘p*/displacement/*_disp.dat’, ‘p*/traction/*_trac.dat’, ‘p*/prestress/*_prestress.dat’ og ‘p*/phs/bwImages/*.tif’. Der oprettes ingen nye filer i dette trin. I stedet føjes de nye oplysninger (cellulære kraft- og bevægelsesegenskaber) til filerne ‘p*/phs/textResults/*.csv ‘. Se figur 12 for den visuelle beskrivelse af de trin til vurdering af de kræfter og bevægelser i området, der er omfattet af de enkelte celler og deres naboområde, og definere dem som cellers egenskaber. Vælg mellem rullemenuen MSM Kort over celler – Bevægelses-/kraftdata (supplerende figur S12). Følg derefter trinnene i trin 2.4.3.BEMÆRK: Der tilføjes nye kolonner til filerne »phs/textResults/0001.csv«, »phs/textResults/0002.csv« osv. og omfatter middel-, median- og standardafvigelsen af hastighed, hastighedsretningen, den gennemsnitlige cytoskeletale spænding, spændingsangisotropi, stammeenergi i hydrogelen, retningen af højeste spænding og størrelsen af celle-ECM-trækkraften (supplerende figur S13). Visualisering af resultater Del 1: Sporing af de cellulære identiteter på tværs af eksperimentetBEMÆRK: Manuelle input til dette trin omfatter identifikation af datamappen og valg af tilknyttede egenskaber, der skal visualiseres. De tidligere oprettede filer, der bruges i dette trin, omfatter ‘p*/phs/textResults/*.csv’. De vigtigste nye filer, der produceres i løbet af dette trin, omfatter ‘p*/phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv’, som indeholder et tidsspor af mobildataene. Se figur 13 for den visuelle beskrivelse af følgende trin for at spore de enkelte cellers egenskaber i hele eksperimentets varighed. Start Fiji-softwaren, og vælg Resultater – Spor data i rullemenuen MSM. Ved hjælp af filbrowserdialogboksen skal du vælge positionsmappen ‘analyse/p0’, ‘analyse/p1’ osv., der indeholder cellulære egenskaber, der skal spores. Når du er færdig, skal du klikke på Vælg. Vælg startrammen til overvågning i vinduet Vælg udgangspunkt for sporing , og antallet af rammer spores samtidigt (supplerende figur S14). Start altid fra ramme nummer 2, da hastigheden ikke kan bestemmes for ramme nummer 1. Når du er færdig, skal du klikke på OK. I vinduet Kontroller variablerne for at oprette spor skal du vælge variablerne enten ved at skrive variabelnavnene eller markere betingelserne i afkrydsningsfelterne (supplerende figur S15). Klik derefter på OK.BEMÆRK: Sporing genererer filer med ‘phs/textResultater/cellTimeTrace_*.csv’ med hver kolonne, der indeholder et entydigt cellenummer, og hver efterfølgende række, der repræsenterer den fortløbende tidsforekomst. Del 2: Generering af tidsspor af de vurderede cellulære egenskaberBEMÆRK: Manuelle input til dette trin omfatter identifikation af datamappen og valg af tilknyttede egenskaber, der skal visualiseres. De tidligere oprettede nøglefiler, der bruges i dette trin, omfatter ‘p*/phs/textResultater/cellTimeTrace_*.csv’. De vigtigste nye filer, der produceres i løbet af dette trin, omfatter ‘p*/phs/trackedDataPlots/*.tif’, som indeholder time track plots og ‘p*/phs/trackedDataPlots/*.csv’, som indeholder plotdata. Se figur 14 for den visuelle beskrivelse af følgende trin til generering af tidsspor af de vurderede cellulære egenskaber. Start Fiji-softwaren, og vælg Resultater – plot i rullemenuen MSM. Ved hjælp af filbrowserdialogboksen skal du vælge positionsmappen ‘analyse/p0’, ‘analyse/p1’ osv., der indeholder sporede cellulære egenskaber, der skal afbildes. Vælg, om du vil begrænse plottet til celler med ubrudte spor ved at klikke på knappen Ja eller Nej .BEMÆRK: Denne indstilling ignorerer cellerne, som ikke kunne registreres i en eller flere tidsforekomster. Vælg det antal variabler, der skal afbildes samtidigt, og klik på OK.BEMÆRK: AnViM tillader i øjeblikket maksimalt tre variabler i det samme plot. Vælg individuelle variabler til plotning ved hjælp af en rullemenu.BEMÆRK: Disse trin opretter en TIFF-fil (Tagged Image File Format) og en kommasepareret datafil i mappen ‘phs/trackedDataPlots/’. Filnavnet består af variabelnavne adskilt af et understregningstegn og slutter med et cellenummer. Del 3: Generering af varmekort over de vurderede cellulære egenskaberBEMÆRK: Manuelle input i dette trin omfatter identifikation af datamappen og valg af tilknyttede egenskaber, der skal visualiseres. De tidligere oprettede nøglefiler, der bruges i dette trin, omfatter ‘p*/phs/textResultater/cellTimeTrace_*.csv’. De vigtigste nye filer, der genereres i dette trin, omfatter ‘p*/phs/segmentedImages/cellPropMaps/*.tif’, som er heatmaps for cellulære egenskaber. Se figur 15 for den visuelle beskrivelse af trinene til generering af varmekort over de vurderede cellulære egenskaber. Vælg mellem rullemenuen MSM – Billede. Følg de trin, der er beskrevet i trin 2.5.2.BEMÆRK: Outputtet gemmes som TIFF-filfiler i mappen ‘phs/segmentedImages/cellPropMaps/’. Filnavnene er tidsforekomstnummeret og variabelnavnet adskilt af et understregningstegn.