Summary
細胞信号を分析する統合ツールキット(iTACS)プラットフォームは、接着細胞内の多種多様な化学および機械的信号を同時に測定するプロセスを自動化します。iTACSは、コミュニティ主導の開発を容易にし、研究者が学歴に関係なくすべてのプラットフォーム機能を使用できるように設計されています。
Abstract
細胞の力と運動の定量的評価は、過去40年間で大幅に進歩しました。これらの進歩は、細胞培養システムにおける洞察に満ちた機械的シグナル伝達プロセスを調べるフレームワークを提供した。しかし、この分野は現在、取得したデータの品質標準化の欠如、データ分析と可視化における技術的な誤り、そしておそらく最も重要なのは、この技術が一般的な細胞生物学研究所にとってほとんど手の届かないところにあるという3つの問題に直面しています。これらの制限を克服するために、我々は新しい実験プラットフォームを開発しました - 細胞信号を分析するための統合ツールキット(iTACS)。iTACSは、取得およびトレーニングモジュール(AcTrM)と分析および可視化モジュール(AnViM)の2つのコンポーネントで構成されています。AcTrMは、NIH-ImageJベースの顕微鏡制御ソフトウェアであるμManagerに基づいており、一般的な画像取得プロトコルのユーザーセルフトレーニングと自動化を容易にします。AnViMはNIH-ImageJに基づいており、データ分析と洞察に富んだ結果の可視化のユーザーフレンドリーな自動化を容易にします。これらの実験は、ヒドロゲル上の付着細胞の培養、ヒドロゲルに埋め込まれた受託マーカーのイメージング、および最後にこれらの画像から細胞の包括的な機械的特徴付けを抽出することを含む。現在、iTACSは、形態、運動、細胞骨格力、個々の細胞とその周辺領域の蛍光を含む幅広い特性を分析し、追跡することを可能にします。品質標準化の問題は、参照画像誘導再焦点化技術であるAcTrMで取り上げられました。AnViMでは、データ分析の技術的な問題に対処し、多面的な画像セグメンテーション手順、境界条件を特定するためのユーザーフレンドリーなアプローチ、および新しい細胞特性ベースのデータビジュアライゼーションを行いました。AcTrMは、基本的な蛍光顕微鏡を実験用細胞力学リグに簡単に変換できるように設計されており、AnViMは、ユーザーが工学的な背景を必要とせずに細胞の機械的信号を測定できるように装備されています。iTACSは、コミュニティ主導の開発機能を備えたオープンソーススイートとして、研究コミュニティに提供されます。
Introduction
一般的に使用される光学イメージングおよびデータ解析ツールは、ほとんど時代遅れであるハードウェアおよびソフトウェア技術を採用しています。電子デバイスの翻訳と進歩の遅れ、計算手法、および一般的な実験細胞生物学ツールへの数学的解析は、細胞生理学の知識の成長ペースに大きな制約を与えています。現在、細胞生物学の研究者は、手の届くところに分子生物学ツールを見つけますが、工学原理に基づくツールは手の届かないところにあります。このような工学原理ベースのツールの1つは、単層応力顕微鏡(MSM)1,2です。MSMは世界中の様々な研究所で適応および研究されていますが、その使用は主に工学の専門知識を持つラボに限定されています3、4,5,6,7,8,9。
NIH-ImageJは、細胞生物学研究者の間で最も人気のあるオープンソースツールの1つです。ユーザーコミュニティの貢献主導の進歩は、その人気の中心となっています11,12。ImageJ には、高度なプログラミング言語と簡略化されたスクリプトアプローチを組み合わせてアプリケーションを開発できる機能があります。これらの機能は、ソフトウェアへの新たな貢献を実装、適応、および進歩するための基本的なプログラミング知識を持つユーザーを容易にします。NIH-ImageJのこれらの特性をベースに、我々は、接着セル11,12全体で多種多様な化学および機械信号の測定を自動化するために、所望のハードウェアおよびソフトウェアツールの低コストの統合を可能にする細胞信号を分析するための統合ツールキット(iTACS)を開発しました。
iTACSは、取得およびトレーニングモジュール(AcTrM)と分析および可視化モジュール(AnViM)の2つのコンポーネントで構成されています。AcTrMは、NIH-ImageJベースの画像取得アプリケーションであるμManagerに基づいて構築されており、ユーザーは従来の光学特性のタイムラプス測定と複数サンプル12の付着細胞の様々な物理的特性を設定できます。AcTrMは、グラフィカルインターフェイスに含まれる簡潔な指示を通じてユーザーのトレーニングを容易にします。さらに、物理力のリアルタイム測定を容易にし、取得したデータの品質標準化を可能にするように設計された、参照画像ベースの自動焦点の新しい機能を備えています。
AnViMは、ImageJプラグイン、迅速なソフトウェア、およびファイル処理スクリプト上に構築されており、細胞の形状、サイズ、向き、速度、動きの方向、細胞外マトリックス(ECM)での牽引力、および隣接する細胞、個々の接着細胞とその近隣地域の収縮とせん断の瞬間を含む50以上のプロパティを定量的に評価することができます。AnViMは、基礎となる技術的背景11を習得することなく、細胞の物理的特性を定量化するユーザーを容易にします。さらに、インタラクティブまたはバッチ処理モードでデータ分析が可能です。空間変動を明らかにするヒートマップと、個々の細胞の特性の時間的変動を示すグラフを生成します。
典型的な実験では、ユーザーは、上面に適切な細胞外マトリックスタンパク質と2種類の埋め込まれた蛍光マーカーを有する弾性ヒドロゲル上の細胞を培養する。基本的に、細胞を培養する前後のこれらの蛍光マーカーの画像は、個々の細胞内および周囲の力を定量化するのに十分です2,13。AnViMはこれらの結果を付着クラスターの個々のセルにマッピングし、洞察力のある画像とグラフを生成します。
Protocol
メモ:iTACSプラットフォームを使用して調べたサンプルは、ソフト基板に接着されたセルです。機械的および化学的信号を評価するためのプロトコルは、集録およびトレーニングモジュール(AcTrM)と分析および可視化モジュール(AnViM)の2つの連続した部分に分かれています。
1. 取得・トレーニングモジュール(AcTrM)
注: AcTrM は、データ収集とユーザーのセルフトレーニングのプロセスを自動化します。データ取得の前に、細胞が発揮する力を定量化するために必要な情報を提供できるソフト基材を用意してください。
- ヒドロゲル調製物
注:ここでの目標は、1,250 Paせん断弾性率、約100 μmの厚さ、および直径22mmのポリアクリルアミド(PAA)ヒドロゲルを準備することです。- Yeung et al. の方法に従ってポリアクリルアミド溶液を調製し、トレパトらら 14,15 で説明したステップに従ってヒドロゲルをキャストする。この手順の例外の 1 つは、細胞のすぐ下に埋め込まれたビーズの直径が 0.5 μm で、黄色の蛍光を発することです。
- 表示領域に大きな無細胞領域があると予想される場合は、カバーグラスに2μmビーズを取り付ける手順をスキップします。
注: ヒドロゲル調製プロトコルは、field16 でかなり確立されました。その後の説明を通して、0.5 μmビーズは「トップビーズ」と呼ばれ、2 μmビーズは「ボトムビーズ」と呼ばれます。ただし、下のビーズは、イメージ領域に大きな無細胞領域が含まれている場合はオプションです。このような無細胞領域からのトップビーズパターンは、ボトムビーズパターンの目的を果たします。 - 埋め込み蛍光ビーズを用いたヒドロゲルを顕微鏡ステージに取り付けます。
- プレートの温度が定常状態になるのに15~20分を許します。
注:プレートの表面は細胞外マトリックスタンパク質で機能していますが、細胞はまだヒドロゲルに播種されていません。
- 参照画像取得
- パート 1: 職位リストの作成
注: このステップの手動入力には、最適なビード分布の場所を選択する AcTrM プロンプトに従う必要があります。この手順では、以前に作成されたファイルは使用されません。このステップで生成される主要な新しいフォルダには、't0imgs'、'tnimgs'、および'textfiles'フォルダがあり、生成されるファイルにはポジションリストファイルが含まれています。AcTrM を使用したポジションリストの作成をガイドする以下の手順の視覚的な説明については、 図 2 を参照してください。デモの例では、20倍の倍率でデータを取得します。- μManager 2.0 - ベータ版を起動します。
- IMBL リソース ウィンドウの AcTrM.bsh ボタンをクリックして AcTrM を実行します。
- 「 取得プロパティを定義」というタイトルのウィンドウで、適切な目的、横方向位置(すなわち、XY)回復の精度に対する許容値、ラフおよび精製再焦点のステップサイズ(すなわち、z)の動作、およびフォーカス回復のための許容可能な画像相関係数の値を選択します。
注: 横位置の回復に対する許容度が高いほど位置の回復は遅くなりますが、データ分析中に位置を補正する必要があり、フォーカス回復が困難になる可能性があります。ステップサイズを小さくすると再焦点の動作が遅くなりますが、ステップサイズが非常に高いと、フォーカスを逃す機会を持つ急速な動きが発生する可能性があります。 - 「AcTrM - ステップ 0」ウィンドウで「新規取得」を選択してポジション・リストを作成します。
注: AcTrM - ステップ 1 というタイトルのウィンドウには、次の主要な手順がすべて一覧表示されます。これらのステップには、ステージの移動、フォーカスの調整、μManagerのボタンのクリックが含まれます。これらのステップガイドは、データ収集に適したポジションのリストを構築する際に役立つガイドです。 - 「ライブインマイクロマネージャー」をクリックして、AcTrM - ステップ1ウィンドウに表示される手動調整のサンプルを視覚化します。
- このウィンドウに表示されている手順に従います。
- 今ビーズのイメージを取得します。上部のビーズに適したチャネルを選択します。
- 下のビーズも確認してください。これを行うには、下部のビーズのチャンネルを選択します。下のビーズのぼやけた画像が見えます。
メモ:チャンネルは、μManagerのメインウィンドウのプリセットドロップダウンメニューから切り替えることができます。実験で下のビーズを使用する場合は、選択した位置に存在することを確認します。これらのビーズはぼやけて表示されます。 - 適切な位置を選択したら、「ステージ位置リスト」ウィンドウで「マーク」をクリックして、位置を保存します。
注:最良の位置は、上部表面のすぐ下に埋め込まれた上部ビーズ(すなわち、上のビーズ)とカバーガラス(すなわち、底ビーズ)に取り付けられた少なくとも2つのビーズ(補足図S1)の密で均一な分布によって定義される。底のビーズが大きく、焦点が合っていないリングとして見える場合、フォーカス回復が速くなります。ただし、実験がフォーカスや横位置の回復を必要としない1つの位置で行われる場合は、下部のビーズ画像に関連する指示を無視してください。 - 図 2 で説明するステップ 6 ~ 9 に従って、追加の位置をリストに含めます。
注: 除去のラウンドがプレート上で選択された最良の位置を可能にできるように、いくつかの追加の位置を選択します。
- パート2:参照画像の取得
注: この手順では、手動入力は行いません。この手順で使用される以前に作成されたキー ファイルには、'textfiles/*.pos' が含まれます。このステップで生成される重要な新しいファイルとフォルダには、't0imgs' フォルダと 'tnimgs' フォルダ内のものが含まれます。AcTrM を使用した参照イメージの取得をガイドする次の手順の視覚的な説明については、 図 3 および 補助図 S2 を参照してください。 AcTrM - ステップ 2 ウィンドウには、すべての主要なステップも表示されます。- AcTrM - ステップ 2 ウィンドウに表示される手順に従って、多次元取得ウィンドウで選択を行います。たとえば、長時間経過するには、撮影する画像の数を指定し、最初のチャンネルをフェーズチャネルとして選択し、次に上のビーズとそれ以降の次のビーズを選択します。[多次元集録]ウィンドウで[閉じる]をクリックし、[ActrM - ステップ2]ウィンドウで[OK]をクリックします。
- [AcTrM - ステップ 3]ウィンドウで、参照画像ベースの XYZ 位置回復を行うことを選択します。選択は一般的にイエスです。ただし、フォーカスやステージドリフトの余地のない1つの位置で画像が取得された場合、AcTrM - ステップ3ウィンドウでの選択はNoになります。
- [ AcTrM - XYZ リカバリ オプション] ウィンドウで、XYZ リカバリの調整、リージョン、および調整された XYZ 回復の方向、および再フォーカスの開始方向を実行する場合の、大まかな XYZ リカバリのチャネルを設定します(補助図 S4)。完了すると、AcTrMは参照画像を取得します。
注: チャネルの典型的な選択肢は、下部のビーズ チャネルです。XYZ リカバリは、現在の実装で完全なイメージを使用して実行する場合に最適です。参考画像には、通常、ヒドロゲルの透過光画像、上部ビーズの蛍光像、およびボトムビーズの蛍光画像が含まれる。各画像セットの内容は、[ 多次元取得 ]ウィンドウでの選択によって異なる場合があります。それでも、ソフトウェアは 図2で決定された各位置で設定された参照画像を取得します。このステップの最後に、選択したディレクトリに「t0imgs」「tnimgs」「テキストファイル」という3つのフォルダが作成されます。't0imgs' フォルダには、μManager によって認識され、後続のステップで使用される形式の参照イメージが含まれています。'tnimgs' フォルダには、ファイル名 'c0_p0_t0.tif' や "c1_p0_t0.tif" などの別々の TIFF イメージが含まれています。ここで'c'はチャンネルを表し、'p'はポジションを表し、't'は時間を表します。これらの文字の後には、それぞれチャネル番号、位置番号、およびフレーム番号が続きます。フォルダ'textfiles'には、画像取得と位置回復のためのXML形式の位置リストとユーザー選択が含まれています。
- パート 1: 職位リストの作成
- 細胞の播種と増殖
注:iTACSプラットフォームは、まばらな細胞、完全に合流単層、ネットワーク形成アッセイ、穴や大きなギャップを持つ単層を含む、接着細胞の機械的挙動の一般的な in vitro評価で 使用されるサンプル調製プロトコルに対応する柔軟性を備えています。- フラスコで合流させる培養ラット肺微小血管内皮細胞17,18.
- トリプシンを使用してセルを取り外します。10%のウシ胎児血清を含む培地中の細胞を1 x 106 細胞/mL濃度に再懸濁させる。
- 再懸濁した細胞の液滴を部分的に乾燥したヒドロゲル表面に置き、細胞培養インキュベーターに入れる。
注:10%のウシ胎児血清を含む培養培地中で2日後、その液滴中の細胞は細胞1の混雑した島を形成する。
- 残りの実験のための自動画像取得
注: このステップの手動入力には、画像取得を再開するための AcTrM プロンプトに従う必要があります。このステップで以前に作成されたファイルには、'textfiles/*.pos' とフォルダ 't0imgs' の下のビードイメージファイルがあります。このステップで生成される重要な新しいファイルには、更新された位置リストファイルとイメージ 'tnimgs/*_t*.tif' が含まれます。- 顕微鏡環境制御システムが安定した組織培養条件に達することを確認します。
- 培養細胞を含むプレートを顕微鏡ステージにそっと取り付けます。
- 温度と湿度が安定するまで15〜20分かかります。
注: AcTrM を使用した残りの実験のイメージの取得をガイドする次の手順の視覚的な説明については 、図 4 を参照してください。 - μManager 2.0 - ベータ版を起動します。
- IMBL リソース ウィンドウの AcTrM.bsh ボタンをクリックして AcTrM を実行します。
注: [ 取得プロパティの定義] ウィンドウでの選択は無視しますが、前の手順で行った選択を使用します。 - [AcTrM - ステップ 0] ウィンドウで、[一時停止された取得を続行] を選択します。
- 前の手順で、データフォルダ('t0imags'、'tnimgs'、および'textfiles')が保存された「 多次元取得 」ウィンドウで識別される倍率とディレクトリを選択します。
注: ウィンドウのタイトルは、ユーザーが適切なディレクトリを選択するようにガイドします。 - 「 プレートの位置変更 」ウィンドウで、プレートの位置変更に使用するチャネルと一緒にプレートの位置を変更するオプション(3つの非線形位置)を選択します。
注:保存した画像はカメラに表示されます。重なり合う画像が赤、緑、黒のカラーイメージとして表示される場合は、手動調整を行います。 - [同意する] をクリックして、取得を続行します。
注:このステップは、プレートが顕微鏡ステージに再マウントされたときのプレートの位置合わせの再現性からのわずかなシフトを克服します。赤で表示される参照画像(通常は下のビーズ)と現在緑色で示された目的を通して観察されている画像の合成画像を表示することにより、AcTrMプロンプトに従って3つの位置のそれぞれで整列を促進します。緑を赤に十分近づけることは、ソフトウェアの作業が少なくなります。オーバーラップが完全な場合、合成画像は黄色と黒で表示されます。通常、同じ下のビーズが赤と緑の両方の画像に表示され、対応する赤と緑の焦点外のリングが互いに接触している場合は、十分に近い値になります。プレートの位置変更が完了すると、AcTrMは選択した各位置にステージを取り、カメラを通して現在見られるものと基準画像を一致させることによってXYZ位置を回復します。最初の横 (XY) 位置が一致し、次にフォーカス (Z) が一致します。大まかな回復は位置および焦点の洗練された回復によって続く。実験の現在の状態の更新は、 補助図S3に示す4つの部分のウィンドウを通して画面に表示されます。取得した画像は、イメージセットの時間カウントを示す'*_t1.tif'、"*_t2.tif'の後の「tnimgs」フォルダに保存されます。XYZリカバリで更新されたポジションが識別されると、新しいポジションリストが生成され、'textfiles'フォルダに保存されます。
2. 分析・可視化モジュール(AnViM)
- 自動データ分析の設定
注: このステップでの手動入力には、'tnimgs' フォルダの場所を特定する必要があります。このステップで以前に作成されたファイルには、"tnimgs/*.tif' があります。このステップで生成される重要な新しいファイルとフォルダには、'tnimgs' と同じ親フォルダの 'analysis' フォルダと、各位置 'analysis/p*' のフォルダが含まれます。各 '分析/p*' 内で、この手順は 'phs' と 'tny' フォルダ内に新しい '*.tif' イメージ ファイルを作成します。これらの画像は、細胞とトップビーズのトリミングされ、漂流解除された画像です。作成されるその他のファイルには、分析の選択肢をリストする「analysis/analysisChoices.txt」、有意な既存のドリフトのために分析がスキップされたインスタンスを一覧表示する「分析/p*/skipAnalysis.txt」、推定ドリフト値をリストする「分析/p*/part_shift_values_pixel_degree.dat」などがあります。AnViM は'tnimgs' フォルダ内の生データを変更しません。AnViM を使用した自動データ分析の設定をガイドする次の手順の視覚的な説明については 、図 5 を参照してください。- フィジーソフトウェアを起動し、 MSM のドロップダウンメニューで[ MSM - 前処理]というラベルの付いた最初のオプションを選択します。
- ファイルブラウザダイアログを使用して、分析されたデータを含む'tnimgs'フォルダを含むフォルダを選択します。
- 画像のチャンネルを定義します。 補助図S5のガイドラインに従って、細胞の透過光画像(細胞の位相コントラスト画像)、下部ビーズ画像および上ビーズ画像のチャネル番号を特定する。次の 3 つのチェックボックス(「ファイルを位置フォルダに移動する」「リジッド モーションの補正を行う」、および「データを切り取って位置フォルダに保存する」)は、通常オンになります。最後に、大きくドリフトしたデータ、ピクセル サイズ、およびセルが交差する画像の側面を拒否するための許容値を定義します。
- 下のビーズのイメージの明るさとコントラストを高めるプロンプトに応答して、ビーズが目立つようにします。メニューのスライダーバーを使用して調整し、[OK] をクリックします。
- 位置補正を実行して、シフトがあれば、シフトを取り除きます。完了すると、分析フォルダーが作成されます。
注: 通常、コントラストの強化は必要ありませんが、この規定はレーザーへの露出を最小限に抑える必要がある実験で使用できます。その選択の後、AnViMは'tnimgs'フォルダから'分析'フォルダにファイルをコピーします。各位置に対応するファイルは、フォルダ'分析/p0、分析/p1'などに保存されます。これらの各位置フォルダ内で、AnViMはオリジナルの透過光画像、上部ビーズ画像、およびボトムビーズ画像を含む'cels'、'defs'、および'refs'フォルダをそれぞれ作成します(補助図S6)。AnViMは、下部ビーズの画像の剛性運動を分析し、セルの修正された送信光画像と更新されたトップビーズ画像を含む「tny」フォルダを含む「phs」フォルダを作成します。最後に、チャネル、操作、許容値、ピクセル サイズ、および境界交差のユーザー選択は'analysisChoices.txt ファイルに保存されます (補助図 S6)。
- ヒドロゲルと単層の変形の定量化
注: 一連の画像からの移動の定量化は、急速に進化する field19 であることに注意してください。この技術は、速度、精度、生画像内の特定の特徴、特定の変形パターンなどの機能に対して常に最適化されています。したがって、一部のユーザーはここで示したものとは異なる変形定量方法を使用する可能性があります。-
パート1:ヒドロゲル変形の定量化
注: このステップでの手動入力には、データディレクトリの識別とグリッド解像度の選択が含まれます。この手順で以前に作成されたファイルには、'p*/tny/*.tif' があります。この中で生成される主要な新しいファイルには、ヒドロゲルの上面の変位ベクトルをリストする「p*/ディスプレイスメント/*_disp.dat」が含まれます。図 6 を参照して、AnViM を介して 、上部のビーズ 画像20上のパーティクル画像 Velocimetry 解析を行う次の手順の視覚的な説明を参照してください。- フィジーソフトウェアを起動し、 MSM ドロップダウンメニューから[ MSM - ゲル変形]を選択します。
- ここで、実験に適したオプションを選択します。
- ファイルブラウザダイアログを使用して、分析されたデータを含む'analysis'フォルダの親ディレクトリを選択します。
- [ ゲル変形計算パラメータ]ウィンドウで 、適切な相互相関ウィンドウサイズ、ノイズレベル、およびしきい値(補足図S7)20を選択します。
注: 結果は、各位置フォルダ '分析/p0、分析/p1'内に新しく作成された'変位'ディレクトリに保存されます。これは、すべての出力ファイルが格納される場所です。
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パート2:単層変形の定量化
注: この手順での手動入力には、データ ディレクトリの識別とグリッド解像度の選択が含まれます。この手順で以前に作成されたファイルには、'p*/tny/*.tif' があります。この中で生成される主要な新しいファイルには、セルの動きベクトルをリストする「p*/velocity/*_vel.dat」が含まれます。上部のビーズ画像20上の粒子画像Velocmetry解析をAnViMを介して関与するステップの視覚的な説明については、図7を参照してください。手順は、ハイドロゲルの変形を定量化するために続くものと同様であり、MSMドロップダウンメニューからMSM - セルラーモーションを選択します。結果は、各位置フォルダ'分析/p0'、'分析/p1'内に新しく作成された'velocity'ディレクトリに保存されます。
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パート1:ヒドロゲル変形の定量化
- 細胞-ECMおよび細胞-細胞力の定量化
注: このステップの手動入力には、データディレクトリの識別、ヒドロゲルの剛性の示し、セルラークラスタセグメンテーションプロンプトへの応答が含まれ、無細胞領域からセルを検出します。この手順で以前に作成されたファイルには、「p*/ディスプレイスメント/*_disp.dat」があります。このステップで生成される主要な新しいファイルには、ヒドロゲル上の細胞によって加えられる力をリストする「p*/トラクション/*_trac.dat」が含まれます。セルを含むグリッドポイントの位置をリストする「p*/トラクション/*_domain.dat」。このステップのユーザー選択を記録する入力ファイル 「p*/トラクション.in、p*/clusterInput.txt および 'p*/prestress.in'細胞-ECMおよび細胞-細胞力の最初の定量的評価に続いて、この技術に対するいくつかのバリエーションが開発された1,15。このバリエーションは、基質、細胞、実験条件、または数値ツールの特定のケースに焦点を当てています7,8,21,22。図 8 を参照して、アンヴィム、フーリエ変換トラクション顕微鏡、およびハイドロゲル変形データに関する単層応力顕微鏡解析を介して関与する視覚的説明 1,2,15 を参照してください。- フィジーソフトウェアを起動し、 MSM ドロップダウンメニューから[ MSM - セル-ECMおよびセルセル力 ]を選択します(ドロップダウンメニューの3番目のオプション)。
- ファイルブラウザダイアログを使用して、分析されたデータを含む「tnimgs」と「分析」フォルダを含む'分析'フォルダの親ディレクトリを選択します。[選択]をクリック します。
- [ セルラー フォース計算パラメータ] ウィンドウで、せん断係数、ハイドロゲルの厚さ、予想されるノイズ レベルを入力します。[ OK] を選択します。これにより、MATLAB 関数を 介して トラクションを実行できます。
注: これらの入力に従って、AnViM はセル ECM 力を計算します。 - その後、単層がコンフルエントであるかどうかを示す。セル全体の画像がセルで覆われている場合、答えは 「はい」です。その場合、セルの力はフレーム全体にわたって計算されます。一方、画像の一部にセルがない場合、答えは No です。その場合は、AnViM のプロンプトに従って、セルを含むイメージ領域のセグメンテーションを容易にします。
- 答えが「いいえ」の場合は、ソフトウェアでプロンプトが表示されたときにセル以外のオブジェクトの周囲にポリゴンを手動で描画し、セグメンテーションに適した方法を選択します。ソフトウェアは、セルの色(黒または白)を求めます。
- ソフトウェアの [スポットを自動的に埋める ]オプションをオンにし、[ OK]をクリックします。
注: 非コンフルエント単一層をセグメント化する手順は、'セクション 2.4 の最初の部分で説明します。セル-ECMフォースは、各位置フォルダ内の新しく作成されたディレクトリ'トラクション'に'*_trac.dat'ファイルに格納され、セルECM力計算ソフトウェアへの入力はファイル'traction.in'に保存されます(補足図S8)。セルセルの力は、各ポジションフォルダ内の新しく作成されたディレクトリ'prestress'の'*_prestress.dat'ファイルに格納され、セルセル力計算ソフトウェアへの入力はファイル'prestress.in'に保存されます(補足図S9)。
- 個々のセルのグリッドポイント値のマッピング
注: iTACS の現在の焦点の 1 つは、現場で測定された機械的信号を解釈する簡単なアプローチを導入することです。このアプローチは、クラスターの隣接する細胞間の機械的相互作用を調べるのに役立ちます18.全体として、これまで定量化されたプロパティは、セルラー クラスター全体に定期的に配置されたグリッド ポイントにあります。このデータは、個々の細胞の形態学的境界内で選択されたプロパティの中央値、平均値、標準偏差を識別し、それらを細胞の物理的特性/信号として割り当てます。これらのことから、標準偏差は変動性を示すために使用され、平均と中央値の差は分布の性質を示すために使用され、中央値は選択されたプロパティの細胞の全体的な状態を示すために使用されます。- パート 1: セルを含むイメージ領域のセグメンテーション
注: このステップへの手動入力には、データディレクトリの識別と、無細胞領域からのセルを検出するためのセグメンテーションプロンプトへの応答が含まれます。この手順で以前に作成されたファイルには、'p*/phs/*.tif' があります。このステップで生成される主な新しいファイルには、セル領域を非細胞領域から分離するバイナリ画像である「p*/phs/bwImages/*.tif」、各インスタンスのセルでカバーされるパーセント画像領域をリストする「p*/phs/textResults/frameNum_percentHealed.txt」、AcTrMインターフェースに入力されたユーザーの選択を記録する「p*/clusterInput.txt」などがあります。セルを含むイメージ領域をセグメント化する次の手順の視覚的な説明については、 図 9 を参照してください。セルの力を計算する前に、この部分を完了する必要があります。その場合、これらのステップを繰り返す必要はありません。また、セルの力の計算の前にこれらの手順を実行した場合、これらのステップは、力の計算の開始時に要求されません。- フィジー ソフトウェアを起動し、 MSM ドロップダウン メニューから [セグメンテーション - セルラー クラスター] を選択します。
- ファイルブラウザダイアログを使用して、定期的に間隔を置いたグリッドポイントで定量化されたプロパティを含む位置ディレクトリ'analysis/p0'、'analysis/p1'などを選択します。
- 単層がコンフルエントであるかどうかを示します。
注: 以下の手順は、単層がコンフルエントでない場合にのみ呼び出されます。AnViM プロンプトに従って、セルを含むイメージ領域を識別する新しい多面的アプローチを適用します。このプロセスには、4つの方法が含まれています - それぞれが異なる方法でセグメンテーションに近づいています。これらの方法の1つまたは複数を組み合わせて使用すると、細胞の多種多様な画像をカバーする。したがって、データに最適な組み合わせを見つけるために、さまざまな方法を試してください。 - 最適なセグメンテーションを得るために、「ドメイン接続係数」と「スミア係数」を調整します。
注: 「スミアファクター」を使用すると、セルを含む領域が大きくなります。 - バイナリ イメージ内のセルが黒か白かを示します。
- [ 境界イメージをクリーニングする方向 ]ウィンドウで、イメージを自動的にクリーニングするか手動でクリーニングするかを選択します。
注:画像の不要な特徴は、セルが占めるピクセル上の黒い斑点と、分析対象のセルクラスタから切断されたピクセル上の白い斑点です。解析は、接続されているリージョンでのみ実行できます。したがって、複数の切断されたリージョンを個別に分析する必要があります。
- パート2:画像内の個々のセルのセグメンテーション
注: この手順への手動入力には、データ ディレクトリの識別と、イメージ内の個々のセルを検出するためのセグメンテーション プロンプトへの応答が含まれます。このステップで以前に作成されたファイルには、'p*/phs/*.tif'と'p*/phs/bwImages/*.tif'があります。生産された主な新しいファイルには、細胞形態学的特性を含む「p*/phs/textResults/*.csv」が含まれます。単層の個々のセルをセグメント化する次の手順の視覚的な説明については 、図 10 を参照してください。- フィジーソフトウェアを起動し、 MSM ドロップダウンメニューから セグメンテーション - 個々のセルを選択します。
- ファイルブラウザダイアログを使用して、定期的に間隔を置いたグリッドポイントで定量化されたプロパティを含む位置ディレクトリ'analysis/p0'、'analysis/p1'などを選択します。
- [ 入力パラメータの選択] ウィンドウで、最大アスペクト比、セルの中心がセル境界と比べてどの程度目立っているか、およびセルの検出を導く 2 つのぼかしパラメータを指定します(補助図 S10)。
- 各位置のイメージ スタックで、最小の法線セルにポリゴンを描画します。面積の計算に使用されます。これより小さいものは、ソフトウェアによってセルとして考慮されません。
- 次に、最大の法線セルの周囲にポリゴンを描画し、セルの中心またはセルのインタフェースが明るいかどうかを示します。
注: AnViM は、そのフレーム内のセルに関する情報を含む各フレームに対して、"phs/textResults/0001.csv'、'phs/textResults/0002.csv' などのファイルを作成します。この段階では、このファイルは、領域、中心、周長、向き、円形度、アスペクト比、丸み、固さ、非細胞領域からの距離を含む細胞に関する形態学的情報を含む。これらのプロパティの長さの単位はピクセルで、角度は度単位です。最後に、このファイルは、後続の手順でセルラーピクセルの強度、モーション、および力を含む更新されます。
- パート 3: セルのピクセル強度のマッピング
注: この手順での手動入力には、データ ディレクトリの識別とマッピング プロパティとパラメータの選択が含まれます。このステップで以前に作成されたファイルには、「p*/phs/*.tif」(または'p*/fluo/*.tif ')と'p*/phs/bwImages/*.tif'があります。このステップで生成される主要な新しいファイルには、細胞形態学的特性をリストする「p*/phs/textResults/*.csv」が含まれます。個々のセルとその隣接領域に包含される領域のピクセルの強度を評価し、それらをセルのプロパティとして定義する次の手順の視覚的な説明については 、図 11 を参照してください。- フィジー ソフトウェアを起動し、 MSM ドロップダウン メニューから [セルのマップ - 強度] を選択します。
- ファイルブラウザダイアログを使用して、定期的に間隔を置いたグリッドポイントで定量化されたプロパティを含む位置ディレクトリ'analysis/p0'、'analysis/p1'などを選択します。
- ソフトウェアのプロンプトで「細胞分裂を検出」または「細胞蛍光を定量化」を選択します。隣接する領域のサイズを定義します。[隣接領域のプロパティを収集] と [セルのプロパティを収集] の両方をオンにします。 [OK] をクリックします。
- [細胞強度の記録の目的] ウィンドウで、強度マッピングに使用する画像の種類、隣接領域のサイズ、および個々のセルまたは両方のセルとそれらの隣接領域についてデータが収集されるかどうかを示します (補助図 S11)。
注: 位相コントラスト画像のピクセル強度をマッピングすると、細胞分割イベントを検出できます。蛍光画像強度をマッピングすることで、蛍光タグ付き細胞質分子の変動を検出できます。上記のステップの出力は、個々のセルの平均値、中央値、標準偏差、最小、最大ピクセル強度の値です。これらの数値は、ファイル 'phs/textResults/0001' .csv'、 'phs/textResults/0002.csv に新しい列として入力されます。
- パート4:細胞の力と運動のマッピング
注: このステップへの手動入力には、データディレクトリの識別とマッピングのプロパティとパラメータの選択が含まれます。このステップで使用される主なファイルには、「p*/phs/textResults/*.csv」、「p*/velocity/*_vel.dat」、「p*/ずれ/_disp.dat」、「p*/トラクション/*_trac.dat」、「p*/プリストレス/*_prestress.dat」、および「p*/phs/bwImages/.tif」が含まれます。この手順では、新しいファイルは作成されません。代わりに、新しい情報(セルラー力と動きのプロパティ)がファイル'p*/phs/textResults/*.csv'に追加されます。個々のセルとその隣接領域に含まれる領域の力と動きを評価し、それらをセルのプロパティとして定義する手順の視覚的な説明については、 図 12 を参照してください。- [MSM] ドロップダウン メニューの [セルのマップ - モーション/フォース データ(補助図 S12)] から選択します。
- 次に、ステップ 2.4.3 に示されている手順に従います。
注:新しい列は、ファイル'phs/textResults/0001.csv'、'phs/textResults/0002.csv'などに追加され、平均値、中央値、速度の標準偏差、速度の向き、平均細胞骨格張り、緊張異方性、ヒドロゲル内のひずみエネルギー、高い張力の向き、セルECM-図S13の大きさが含まれます。
- パート 1: セルを含むイメージ領域のセグメンテーション
- 結果の可視化
- パート 1: 実験全体での細胞のアイデンティティの追跡
注: この手順への手動入力には、データ ディレクトリの識別と、視覚化するマップされたプロパティの選択が含まれます。この手順で以前に作成されたファイルには、'p*/phs/textResults/*.csv' があります。このステップで生成される主な新しいファイルには、携帯電話のデータの時間トレースを含む「p*/phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv」が含まれます。実験の全期間にわたって個々のセルのプロパティを追跡する次の手順の視覚的な説明については 、図 13 を参照してください。- フィジーソフトウェアを起動し、 MSM ドロップダウンメニューから [結果 - データの追跡]を選択します。
- ファイルブラウザダイアログを使用して、追跡するセルラープロパティを含む位置ディレクトリ'analysis/p0'、'analysis/p1'などを選択します。完了したら、 選択をクリックします。
- [ トラッキングの開始点を選択 ]ウィンドウで、監視する開始フレームと同時に追跡されるフレーム数を選択します(補助図S14)。フレーム番号 1 では速度を決定できないため、フレーム番号 2 から常に開始します。完了したら、[OK] をクリックします。
- 「 トラックを作成する変数を確認」 ウィンドウで、変数名を入力するか、またはチェックボックスから項を選択して変数を選択します (補足図 S15)。次に、[OK] をクリック します。
注: 追跡は、一意のセル番号と連続した時間インスタンスを表す各行を含む各列を含む「phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv」ファイルを生成します。
- パート2:評価された細胞特性のタイムトラックの生成
注: この手順への手動入力には、データ ディレクトリの識別と、視覚化するマップされたプロパティの選択が含まれます。この手順で以前に作成されたファイルには、'p*/phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv' があります。このステップで生成された主な新しいファイルには、タイムトラックプロットを含む「p*/phs/trackedDataPlot/*.tif」とプロットデータを含む「p*/phs/trackedDataPlots/*.csv」があります。評価されたセルラー プロパティのタイム トラックを生成する次の手順の視覚的な説明については、 図 14 を参照してください。- フィジーソフトウェアを起動し、 MSM ドロップダウンメニューから [結果 - プロット]を選択します。
- ファイルブラウザダイアログを使用して、プロットする追跡されたセルラープロパティを含む位置ディレクトリ'analysis/p0'、'analysis/p1'などを選択します。
- [ はい ]または[ いいえ ]ボタンをクリックして、トラックが切れなくなったセルにプロットを制限するかどうかを選択します。
注: このオプションは、1 つ以上の時間インスタンスで検出できなかったセルを無視します。 - 同時にプロットする変数の数を選択し、[ OK]をクリックします。
注: 現在、AnViM では、最大 3 つの変数を同じプロットに表示できます。 - ドロップダウン メニューを使用して、プロットする個々の変数を選択します。
注: これらの手順では、タグ付きイメージ ファイル形式 (TIFF) ファイルとコンマ区切りのデータ ファイルを作成する、phs/trackedDataPlots/' フォルダー内。ファイル名は、アンダースコアで区切られた変数名で構成され、セル番号で終わります。
- パート3:評価された細胞特性のヒートマップの生成
注: このステップでの手動入力には、データディレクトリの識別と、視覚化するマップされたプロパティの選択が含まれます。この手順で以前に作成されたファイルには、'p*/phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv' があります。このステップで生成される主な新しいファイルには、セルラープロパティのヒートマップである「p*/phs/segmentedImages/cellPropMaps/*.tif」が含まれます。評価されたセルラー プロパティのヒート マップを生成する手順の視覚的な説明については 、図 15 を参照してください。- MSM ドロップダウン メニューの結果 - 画像から選択します。
- ステップ 2.5.2 で説明されている手順に従います。
注: 出力は、TIFF ファイル ファイルとして 'phs/セグメントイメージ/セルプロップマップ/' フォルダーに格納されます。ファイル名は、時間インスタンス番号と変数名をアンダースコアで区切ったものです。
- パート 1: 実験全体での細胞のアイデンティティの追跡
Representative Results
ここでは、例の 2 つの主要な出力を示します。最初の出力は、セルのセル速度と細胞番号1の細胞細胞の緊張の時間トレースです(図16)。プロパティは、プロパティ間の視覚的な関連付けを容易にするために、共有垂直軸に表示され、横軸は時間インスタンス番号を示します。この実験では、連続したフレームを15分間隔で取得した。2番目の出力は、実験に1時間のヒートマップの配列です(図17)。ここに示す特性は、広域、向き、円形度、速度、運動方向、最大張力方向、細胞骨格張力、基質牽引力、および個々の細胞の張力異方性を含む。
図1:細胞信号を解析するための統合ツールキットの構造(iTACS) iTACSの2つの主要なコンポーネントは、取得およびトレーニングモジュール(AcTrM)と分析および可視化モジュール(AnViM)です。AcTrMは、顕微鏡ステージ上でしっかりと保持できるヒドロゲル、任意の細胞播種、および細胞を1つの焦点面に保持する成長プロトコルを調製するために現在存在する様々なヒドロゲル調製技術を使用することができる。AnViMは、ヒドロゲルおよび単層変形、細胞-ECM力、および細胞細胞力を定量化するために様々な技術を使用することができます。力の測定の議定書のこれらのユーザー好ましいすべての部品はiTACSで収容することができ、それらは破線の箱で識別された。固体箱で識別される部品は、細胞力測定技術への新しい貢献である。AnViM の視覚化では、個々のセルのプロパティの中央値と変動性に焦点を当てています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:参照画像取得- パート1。 AcTrM を使用してポジションリストを作成する手順。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:参照画像取得- パート2 AcTrMを使用して参照画像を取得するためのステップ。ステップ 2、4、および 6 の詳細なビューは、それぞれ 補足図 S2、 S3、および S4 に示されています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:残りの実験のための自動画像取得。 AcTrMを用いて細胞行動を評価するために画像取得を再開するためのステップ。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5: 自動データ分析の設定 AnViM を使用して自動画像解析を開始する手順。ソフトウェアは、AcTrMで使用される画像形式を認識します。ステップ 3 および 5 のパネルの詳細なビューは、それぞれ 補足図 S5 および 補足 図 S6 に示されています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:ヒドロゲルと単層の変形の定量化-パート1。AnViMを 介して 、粒子画像Velocimetry実装をTseng、Q.ら、PNAS(2012)20 に従事させるステップは、ヒドロゲルの上面の変形を定量化する。ユーザーは、ハイドロゲルの変形を定量化するために、AnViMの他のアプローチを実装することもできます。ステップ 3 の詳細なビューは 、補助図 S7 に示されています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7:ヒドロゲル及び単層の変形の定量化-部2. AnViMを 介して 、個々の細胞の局所運動を定量化するTseng、Q.ら、PNAS(2012)20 の粒子画像Velocimetry実装を介して関与するステップ。ユーザーは、細胞の動きを定量化する AnViM の他のアプローチ内で実装することもできます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図8:細胞-ECMおよび細胞-細胞力の定量化。AnViM、トレパトらのフーリエ変換トラクション顕微鏡の実装、ヒドロゲル上の細胞が及ぶ力を定量化する自然物理学(2009)15、タンベらの単層応力顕微鏡実装、自然材料(2011)1を介して関与する画像解析を行うステップは、個々の細胞内および隣接する細胞間の力を定量化する。また、AnViM内で、細胞-ECMおよび細胞の力を定量化する他のアプローチを実装することもできます。ステップ 6 の詳細なビューは、補助図 S8 および補助図 S9 に示されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 9: 個々のセルにグリッド ポイント値をマッピングする - パート 1. 新しい多面的アプローチを使用して、セルを含む画像領域をセグメント化する手順。このアプローチは、細胞の位相コントラスト、明視野、または蛍光画像をセグメント化するために使用できます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 10: 個々のセルにグリッドポイント値をマッピングする - パート 2. AnViMで開発された新しい多面的アプローチを用いて、単層の個々の細胞をセグメント化するステップ。このアプローチは、細胞の位相コントラスト、明視野、または蛍光画像をセグメント化するために使用できます。ステップ 2 の詳細なビューは 、補足図 S10 に示されています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 11: 個々のセルにグリッドポイント値をマッピングする - パート 3. AnViM を使用して、個々のセル内および個々のセルの隣接領域内の領域内のピクセル強度を評価する手順。評価される強度には、透過光強度および蛍光強度が含まれる。この部分は、個々のセル内および個々のセルの隣接領域内のピクセル強度の中央値と標準偏差をマッピングします。ステップ 2 の詳細なビューは 、補足図 S11 に示されています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 12: 個々のセルにグリッドポイント値をマッピングする - パート 4. AnViM を使用して、個々のセル内および隣接するセル領域内のグリッド ポイントの力と運動特性を評価する手順。この部分は、個々のセル内および個々のセルの隣接領域内のプロパティの中央値と標準偏差をマッピングします。ステップ 2 と 3 の詳細なビューは、 補足図 S12 および補足図 S13 に 示されています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図13:結果の可視化 - パート1AnViM を使用して、実験の全期間にわたって個々のセルのプロパティを追跡する手順。ステップ 2 と 3 の詳細なビューは、補足図 S14 および補足図 S15 に示されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図14:結果の可視化 - パート2. AnViM を使用して評価されたプロパティの時間トレースを生成する手順。ユーザーは、1 つのグラフで最大 3 つのプロパティをプロットするオプションがあります。時間トレースは、すべてのセルに対して生成されるか、または実験全体で追跡が成功したセルに対してのみ生成されます。ステップ 5 の詳細なビューは 、補足図 S16 および補助図 S17 に示 されています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図15:結果の可視化 - パート3. AnViM を使用して評価されたプロパティのヒート マップを生成する手順。ヒート マップは、開始フレームに続くすべてのフレームと選択したすべてのプロパティに対して生成されます。ステップ 3 の詳細図は、補足 図 S18 に示されています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 16: セル ID 1 のタイム トレース 表示される2つのプロパティは、細胞細胞質緊張(「avgtenMedian」)および細胞速度(「speedMedian」)です。細胞細胞の緊張と細胞速度の両方が、細胞内のグリッドポイント全体の中央値として定量化されます。評価されたプロパティ間の関係を視覚化するために、2 つのプロパティは任意の単位を持つ同じ軸上にプロットされます。追加の変数名は 補足表 S1 にリストされています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 17: 解析対象の単層全体にわたる個々のセルの特性のヒートマップ。 各セルは、パネルに示されたプロパティの中央値で色付けされます。従って、深い赤は色スペクトルの最大細胞値を示し、深い青色は分析された単層全体の最小細胞価値を示す。Tambeらで説明したように、PLoS One(2013)2)は、境界に近い位置にある細胞が、画像外の細胞の未知の特性によって影響を受ける機械的力を有する。したがって、ヒート マップは境界から遠く離れたセルに対して生成されます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図S1:上と下の蛍光ビーズのサンプル画像。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
図 S2: 図 3 のステップ 2 の詳細図。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
図 S3: 図 3 のステップ 4 の詳細図。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
図S4 A:図3のステップ6の詳細図。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
図 S5: 図 5 からのステップ 3 の詳細図。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
図 S6: 図 5 からのステップ 5 の詳細図。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
図 S7: 図 6 のステップ 3 の詳細図。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
図S8:図8からのステップ6のセル-ECM力出力の詳細図。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
図S9:図8からのステップ6の細胞力出力の詳細図。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
図S10:図10のステップ2の詳細図。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
図S11:図11からのステップ2の詳細図。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
図 S12: 図 12 のステップ 2 の詳細図。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
図S13: 図12からのステップ3の出力の詳細図。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
図 S14: 図 13 のステップ 2 の詳細図。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
図 S15: 図 13 のステップ 3 の詳細図。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
図 S16: 図 14 のステップ 5 で生成されたデータ ファイルの詳細図。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
図S17:図14のステップ5で生成されたプロットの詳細図。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
図S18:図15からステップ4で生成されたカラースペクトルの範囲を含むヒートマップとファイルの詳細図。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表 S1: iTACS によって定量化された選択されたプロパティのリスト。このテーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Discussion
接着細胞は、生き残るために機械的および化学的信号の両方を使用して、成長し、機能します。多種多様な顕微鏡ソフトウェアは、蛍光ベースのイメージングを通じて、化学的シグナルを評価する際のユーザエクスペリエンスを最適化します。ただし、機械的信号の評価には、標準の顕微鏡ソフトウェアでは使用できない機能が含まれます。さらに、データ取得とデータ分析を統合する場合、機械的信号の評価が最も効率的です。機械的信号評価の独自のニーズを満たす統一されたプラットフォームの欠如は、実験細胞生物学における主要な技術的ギャップとなっています。細胞信号を分析する統合ツールキット (iTACS) は、このギャップを満たすように設計されています。ITACSの2つのコンポーネント、AnViMとAcTrMは、4つの大きなカテゴリーの細胞特性を定量化するために必要な機能をユーザーに提供します:力、運動、形態、蛍光/輝度。これらのカテゴリー全体で、iTACSは現在、個々の接着細胞の50以上のユニークな側面を明らかにすることができます。これらのアスペクトは、各カテゴリの特定の特性を含み、その代表的な値およびセル全体の変動性を含む(補足表S1)。例えば、力の中には、細胞骨格全体の引張力、この張力の異方性、最大張力の向き、および接着性細胞1,3,6の挙動に大きな影響を与える細胞-ECM界面のせん断応力があります。
単層の個々の細胞の機械的挙動を調べる新しいアプローチ
単層の個々の細胞は、化学的および機械的性質のシグナルの交換に従事している3。これら2種類の信号は、細胞単層を介して異なる方法で送信される23。しかし、機械的信号伝達の知識は、化学信号伝達の知識に遅れをとっている。この知識のギャップは、細胞の機械的信号を評価するための単純で直感的なアプローチの持続的な欠如と一致します。ここで説明する新しいデータ マッピングアプローチは、このギャップを埋めるために装備されています。このようなマッピングは、細胞の隣接領域における固有の細胞骨格張力の変動が、細胞の形状、大きさ、およびセル18の速度の変化を調節する緩和、流動化、およびアンカー信号として機能することを明らかにする。隣接領域の特性の地図は、サブディビジョン内の細胞が比較的均一な微小環境にさらされ、サブディビジョンの境界にある細胞が著しく不均一な微小環境18にさらされる「多細胞サブディビジョン」パターンを示す。
力測定技術のアクセシビリティ
PAAヒドロゲルを作り、ヒドロゲルの変形と細胞運動を分析し、細胞-ECMおよび細胞細胞力を定量化するための様々なプロトコルが存在します1,2,7,8,9,13,14,15,18,20,21,24,25,26,27,28,29,30,31,32.しかし、これらの開発は、一般的な細胞生物学研究所の手の届かないところに残っており、工学の専門知識を持つ研究室に限定されています。これらのアプローチの技術的側面を自動化し、統一されたユーザーフレンドリーなプラットフォームの下で統合することで、iTACSの目標は、機械的信号の評価を実験細胞生物学の研究と教育における日常的な活動にすることです。
ImageJを使用すると、トレーニングをほとんど必要としないアプローチを使用してアプリケーションを開発できます。iTACS は、コミュニティ主導型の継続的な開発を容易にするために、簡単なスクリプト手法を使用して構築されています。AcTrMの大部分は BeanShell スクリプトを使用してプログラムされ、AnViM の大部分は ImageJ マクロを使用してプログラムされています。これらのスクリプトとユーザーの顕微鏡でこれらの機能を実装するためのガイダンスは、GitHub (https://github.com/IntegrativeMechanobiologyLaboratory/iTACS) を通じて入手できます。
取得した画像の品質標準化
接着細胞の物理的な力を定量化する弾性基材ベースの技術は、様々なラボで開発され、実装されていますが、プロトコルはまだ標準化に欠けています。最も標準化が必要な分野の1つは、取得したトップビーズ画像の品質です(補助図S1)。実験を通じて焦点を当てたドリフトから重大な問題が生じます。私たちの新しい参照画像ベースの再焦点化アプローチは、このような焦点を合わせるのが客観的なプロセスになります。AcTrMの最初のステップで定義されたパラメータは、必要な客観的な品質制限を課します。その他の標準化措置は、AcTrMの将来のバージョンでプログラムすることができます。
iTACSの広範な適用性
iTACS構造は、接着細胞の多くの側面を定量化することに加えて、様々な実験的なプロトコルやニーズに対する使用を容易にします。AcTrMはソフトウェアガイドによるユーザーの自己訓練を可能にする。例えば、細胞質カルシウム変動の同時評価によって必要とされる高速イメージングは、現在、ハードウェアの位置変更と再焦点の速度によって制限され、一度に1つの場所で行われるのが最善です。しかし、現在の実装は、実験の全期間にわたってサンプルを顕微鏡ステージに保持することができない、長期イメージング、中断されたイメージングのために十分に装備されています。実験の開始時に参照画像が取得されるため、iTACSは機械的信号のリアルタイムイメージングを可能にし、薬物スクリーニングアプリケーションの新しい道を開きます。AnViMは、ユーザーが素人の言葉で高度な技術情報を提供することができます。広い範囲の細胞特性を定量化し、実験全体を通して追跡する能力は、新しい細胞間通信メカニズムを発見するために必要な重要な機能を構成します。
iTACSの今後の開発のために、(1)データ取得とデータ分析速度の向上、(2)新しいセルラー信号を評価するアプローチの実施、(3)iTACSベースの細胞信号評価に関するワークショップと教育モジュールの開発、(4)低コストの自動化ソリューションの開発の4つの重点分野を特定しました。
Disclosures
著者らは利益相反を宣言しない。
Acknowledgments
D.T.T.は、実験的な細胞生物学研究のニーズに関する議論を刺激してくれた南アラバマ大学肺生物学センターに所属するスタッフに感謝します。これらの議論は、iTACSの開発を推進する上で極めて重要でした。
この研究は、国立衛生研究所/国立心臓肺血液研究所からの助成金によって部分的に支えられました。 P01 HL66299およびR37 HL60024(スティーブンス)、R01-HL118334(アルバレス)、F32-HL144040-01、南アラバマ大学からエイブラハム・ミッチェルがん研究基金(シン、パランキ、タンベ)、研究・学術助成金(タンベ)、研究・学術助成金(タンベ)、名誉大学、研究助成金(タンベ)、サマー・カレッジ、サマー・グラント・リサーチ・フェロー(N)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and components used in prepare glass surface for hydrogel coating | |||
| (3-Aminopropyl)trimethoxysilane, 97% | Aldrich chemistry | 13822565 | |
| 2% Bis Solution | Bio-rad | 1610142 | |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate,98% | Acros organics | 2530850 | |
| 40% Acrylamide Solution | Bio-rad | 1610140 | |
| Glass bottom 35 mm dish/ 6 or 12 or 24 well plates | MatTek or CellVis | ||
| Glutaraldehyde, EM Grade, 25% | Polysciences | 1909100 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-aldrich | 1002074706 | |
| Reagents and components used in preparing suitable hydrogel | |||
| 2% Bis Solution | Bio-rad | 1610142 | |
| 40% Acrylamide Solution | Bio-rad | 1610140 | |
| Ammonium Persulfate | Bio-rad | 1610700 | |
| Cover Slips | Electron Microscopy Sciences | 7222301 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1M) | Gibco | 14190136 | |
| FluoSpheres carboxylate 0.2 um, yellow-green(505/515) | Invitrogen | F8811 | |
| FluoSpheres carboxylate 0.5 um, red(580/605) | Invitrogen | F8812 | |
| FluoSpheres carboxylate 2.0 um, red(580/605) | Invitrogen | F8826 | |
| Rain-X | |||
| TEMED | Bio-rad | 1610801 | |
| Reagents used in coating extracellular matrix on the hydrogel | |||
| Collagen Type I Rat Tail | Corning | 354236 | |
| HEPES(1M) | Gibco | 15630080 | |
| Phosphate Buffered Saline (1M) | Gibco | 10010023 | |
| Sulfo-SANPAH | CovaChem | 102568434 | |
| Microscope hardware used in the current study | |||
| Camera | Hamamatsu Flash 4.0 LT sCMOS Camera | C11440-42U | |
| H117 ProScanTM Stages | Prior Scientific | ||
| Light source- Lambda DG4 and Lambda DG5 | Sutter instrument company | ||
| Microscope | Nikon eclipse TE2000-S | 550372 | |
| ProScan III Universal Microscope Automation Controller | Prior Scientific | ||
| Stagetop incubator | ibidi | 11922 | |
| Stepper Motor Focus Drive | Prior Scientific |
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