OBS: Prover som undersöks med hjälp av iTACS-plattformen är celler som fästs vid ett mjukt substrat. Protokollet för bedömning av mekaniska och kemiska signaler är uppdelat i två sekventiella delar: Förvärvs- och utbildningsmodul (AcTrM) och Analys- och visualiseringsmodul (AnViM). 1. Förvärvs- och utbildningsmodul (AcTrM) OBS: AcTrM automatiserar processen för datainsamling och självutbildning av användare. Innan du anskaffning av data ska du förbereda ett mjukt substrat som kan tillhandahålla information som är nödvändig för att kvantifiera krafter som celler utövar på den. Hydrogel beredningOBS: Målet här är att förbereda en 1 250 Pa skjuvmodul, cirka 100 μm tjocklek och 22 mm diameter polyakrylamid (PAA) hydrogel. Förbered polyakrylamidlösning genom att följa metoden med Yeung et al. och gjut hydrogelerna enligt trepat et al.14,15. Ett undantag från förfarandet är att pärlorna som är inbäddade omedelbart under cellerna är 0,5 μm i diameter och avger gul fluorescens. Hoppa över steget att fästa 2 μm pärlor på täckglaset om visningsområdet förväntas ha en stor cellfri region.OBS: Hydrogel förberedelseprotokoll är nu ganska etablerat i fältet16. Under hela den efterföljande beskrivningen kallas 0,5 μmpärlorna “topppärlor”, och de 2 μm pärlor kallas “bottenpärlor”. De nedre pärlorna är dock valfria där den avbildade regionen innehåller ett stort cellfritt område. Det övre pärlmönstret från en sådan cellfri region kommer att tjäna syftet med det nedre pärlmönstret. Montera hydrogelen med inbäddade fluorescerande pärlor på mikroskopstadiet. Låt 15-20 min för plattans temperatur uppnå ett stabilt tillstånd.OBS: Plattans övre yta är funktionaliserad med extracellulära matrisproteiner, men cellerna är ännu inte sådda på hydrogelen. Förvärv av referensbild Del 1: Skapa en positionslistaManuell inmatning i det här steget inkluderar att följa AcTrM-uppmaningarna att välja platser med den bästa pärldistributionen. Inga tidigare skapade filer används i det här steget. Viktiga nya mappar som produceras i det här steget inkluderar mapparna “t0imgs”, “tnimgs” och “textfiles”, och filen som produceras innehåller positionlistfilen. Se bild 2 för den visuella beskrivningen av följande steg som vägleder skapandet av en positionslista med AcTrM. Det demonstrerade exemplet hämtar data vid 20x förstoring. Start μManager 2.0 – Beta. Kör AcTrM genom att klicka på knappen AcTrM.bsh i fönstret IMBL-resurser . I fönstret Definiera förvärvsegenskaper väljer du lämpligt mål, tolerans för noggrannheten i lateral position (dvs XY) återhämtning, stegstorlek för den grova och raffinerade omfokuseringen (dvs. z) -operationen och värdet av acceptabel bildkorrelationskoefficient för fokusåterställning.OBS: En finare tolerans för lateral position återhämtning kommer att bromsa position återhämtning, men en betydande tolerans kommer att behöva position korrigering under data analys och kan orsaka svårigheter i fokus återhämtning. En mindre stegstorlek saktar ner omfokuseringsoperationen, men en mycket hög stegstorlek kan orsaka snabb rörelse med möjligheter att missa fokus. I fönstret AcTrM – Steg 0 väljer du Nytt förvärv för att skapa en positionslista.FÖNSTRET med titeln AcTrM – Steg 1 listar alla viktiga nästa steg. Dessa steg innebär att flytta scenen, justera fokus och klicka på knappar i μManager. De här stegen vägleder till att konstruera listan över positioner som är lämpliga för datainsamling. Klicka på Live in Micromanager för att visualisera exemplen för manuella justeringar som listas i fönstret AcTrM – Steg 1 . Följ stegen i det här fönstret. Skaffa nu bilden av pärlorna. Välj lämplig kanal för de övre pärlorna. Se till att titta på de nedre pärlor också. För att göra det, välj kanalerna för de nedre pärlorna. En suddig bild av bottenpärlor ses.Kanaler kan växlas från den förinställda rullgardinsmenyn i huvudfönstret i μManager. Om de nedre pärlorna används i experimentet, se till att de finns i den valda positionen. Dessa pärlor kommer att verka suddiga. När du väljer lämplig position klickar du på Markera i fönstret Scenpositionslista för att spara positionen.OBS: Den bästa positionen definieras av en tät och enhetlig fördelning av de övre pärlorna som är inbäddade omedelbart under den övre ytan (dvs. topppärlor) och minst två pärlor fästa vid täckglaset (dvs. bottenpärlor) (kompletterande figur S1). Fokusåterställning är snabbare om de nedre pärlorna visas som stora, out-of-focus ringar. Men om experiment görs i en position utan behov av fokus eller lateral position återhämtning, ignorera instruktioner relaterade till bottenpärlor bilden. Följ steg 6–9 som beskrivs i figur 2 för att inkludera ytterligare positioner i listan.OBS: Välj några ytterligare positioner så att en elimineringsrunda kan möjliggöra de bästa positionerna som valts på plattan. Del 2: Förvärv av referensbilderOBS: Det här steget innebär ingen manuell inmatning. Tidigare skapade nyckelfiler som användes i det här steget inkluderar “textfiler/*.pos”. Viktiga nya filer och mappar som produceras i det här steget inkluderar mapparna “t0imgs” och “tnimgs”. Se figur 3 och kompletterande figur S2 för visuell beskrivning av följande steg som vägleder förvärvet av referensbilder med AcTrM. Fönstret AcTrM – Steg 2 listar också alla viktiga steg. Gör valen i fönstret Flerdimensionellt förvärv efter stegen i fönstret AcTrM – Steg 2. Om du till exempel vill utföra en lång tidsfördröjning, ange ett antal bilder som ska tas, välj den första kanalen som faskanal och välj sedan nästa för de övre pärlorna och den efter det är för bottenpärlor. Klicka på Stäng i fönstret Flerdimensionellt förvärv och klicka sedan på OK i fönstret ActrM – Steg 2. I fönstret AcTrM – Steg 3 väljer du att aktivera den referensbildbaserade XYZ-positionsåterställningen. Valet är i allmänhet ja. Men om bilder förvärvas på en position utan utrymme för fokus eller scendrift, kommer valet i AcTrM – Steg 3-fönstret att vara Nej. I fönstret AcTrM – XYZ Återställningsalternativ ställer du in kanalen för grov XYZ-återställning, om förfinad XYZ-återställning, region och kanal för förfinad XYZ-återställning och riktningen för att börja fokusera om (kompletterande figur S4). När actrm är klart kommer de att få referensbilder.Obs: Typiska val för kanalen kommer att vara den nedre pärlor kanalen. XYZ-återställning fungerar bäst när den utförs med den fullständiga bilden i den aktuella implementeringen. Referensbilder innehåller vanligtvis en överförd ljusbild av hydrogelen, en fluorescerande bild av topppärlor och en fluorescerande bild av de nedre pärlor. Varje bilduppsättnings innehåll kan variera beroende på de val som gjorts i fönstret Flerdimensionellt förvärv . Ändå kommer programvaran att förvärva referensbilduppsättningen på varje position som bestäms i figur 2. I slutet av det här steget skapas tre mappar i den valda katalogen: “t0imgs”, “tnimgs” och “textfiles”. Mappen “t0imgs” innehåller referensbilder i det format som känns igen av μManager och används i efterföljande steg. Mappen “tnimgs” innehåller separata TIFF-bilder med filnamnen “c0_p0_t0.tif”, “c1_p0_t0.tif” osv. Här står “c” för kanalen, “p” står för positionen och “t” står för tiden. Följande bokstäver är kanalnumret, positionnumret respektive bildrutenumret. Mappen “textfiler” innehåller positionslistan i XML-format och användarval för bildförvärv och positionsåterställning. Cellsådd och tillväxtOBS: ITACS-plattformen har flexibiliteten att tillgodose provberedningsprotokoll som används vid vanlig in vitro-bedömning av mekaniskt beteende hos vidhäftande celler, inklusive glesa celler, helt sammanflytande monoskikt, nätverksbildningsanalys och monoskikt med hål eller betydande luckor. Kultur råtta pulmonell mikrovaskulära endotelceller att sammanflöde i en kolv17,18. Lossa cellerna med trypsin. Återsuspend cellerna i ett odlingsmedium som innehåller 10% fetala nötkreatur serum till en koncentration 1 x 106 celler/ml. Placera en 5 μL droppe av de återanvända cellerna på en delvis torr hydrogelyta och placera den i cellodlingsinkubatorn.OBS: Efter 2 dagar i odlingsmediet som innehåller 10% fetala nötkreatur serum, cellerna i den droppen bildar en fullsatt ö av celler1. Automatiserat bildförvärv för det återstående experimentetManuell inmatning för det här steget inkluderar att följa AcTrM-uppmaningarna att återuppta bildförvärvet. Viktiga tidigare skapade filer som används av detta steg inkluderar “textfiler/*.pos” och nedersta pärla bildfiler i mappen ‘t0imgs’. Viktiga nya filer som produceras i detta steg inkluderar uppdaterade position listfiler och bilder “tnimgs /*_t *.tif”. Se till att mikroskopets miljökontrollsystem når stabila vävnadsodlingsförhållanden. Montera försiktigt plattan som innehåller odlade celler på mikroskopstadiet. Låt temperaturen och luftfuktigheten stabiliseras 15-20 minuter.OBS: Se bild 4 för den visuella beskrivningen av följande steg som vägleder förvärvet av bilder för det återstående experimentet med AcTrM. Start μManager 2.0 – Beta. Kör AcTrM genom att klicka på knappen AcTrM.bsh i fönstret IMBL-resurser .Ignorera de val som gjorts i fönstret Definiera förvärvsegenskaper men använd de val som gjordes i föregående steg. Välj Fortsätt pausad anskaffning i fönstret AcTrM – Steg 0. Välj den förstoring och katalog som identifierades i fönstret Flerdimensionellt förvärv i det tidigare steget där datamappar (t0imags”, “tnimgs” och “textfiler”) sparades.Fönstrets rubrik vägleder användaren att välja lämplig katalog. I fönstret Flytta plattan väljer du alternativ för ompositionering av plattan (tre icke-kollinea positioner) tillsammans med kanalen som används för ompositionering.Obs: Sparade bilder visas i kameran. Om överlappande bilder visas som en röd, grön och svart färgbild utför du manuell justering. Klicka på Acceptera för att fortsätta med förvärvet.OBS: Detta steg övervinner de små förskjutningarna från irreproduktiviteten av plattjusteringen när plattan återmonteras på mikroskopstadiet. Följ AcTrM-uppmaningar för att påskynda justeringen vid var och en av de tre positionerna genom att visa en sammansatt bild av referensbilden som visas i rött (vanligtvis av de nedre pärlorna) och bilden som för närvarande observeras genom det mål som visas i grönt. Att få det gröna tillräckligt nära rött lämnar mindre arbete för programvaran. När överlappningen är perfekt visas den sammansatta bilden gul och svart. Tillräckligt nära är vanligtvis när samma bottenpärlor är synliga i både röda och gröna bilder, och motsvarande röda och gröna out-of-focus ringar berör varandra. När plåtompositionering är klar tar AcTrM scenen till varje vald position och återställer XYZ-positionen genom att matcha referensbilden med vad som för närvarande ses genom kameran. Den första laterala (XY) positionen matchas och sedan matchas fokus (Z). Grov återhämtning följs av förfinad återhämtning av position och fokus. Uppdateringar av experimentets aktuella status visas på skärmen genom ett fönster i fyra delar som visas i kompletterande figur S3. De förvärvade bilderna sparas i mappen “tnimgs” efter “*_t1.tif”, “*_t2.tif”, vilket anger tidsräkningen för bilduppsättningen. Om XYZ-återställning identifierar en uppdaterad position genereras och sparas den nya positionslistan i mappen “textfiler”. 2. Analys- och visualiseringsmodul (AnViM) Ställa in automatiserad dataanalysObs: Manuell inmatning i det här steget inkluderar identifiering av platsen för mappen “tnimgs”. Viktiga tidigare skapade filer som används i det här steget inkluderar ‘tnimgs/*.tif’. Viktiga nya filer och mappar som produceras i det här steget inkluderar “analys” -mappen i samma överordnade mapp som “tnimgs” och mappar för varje position “analys /p*”. Inom varje “analys/p*” skapar detta steg en ny “*.tif” bildfiler i “phs” och “tny” mappar. Dessa bilder är beskurna och avdriftade bilder av celler och topppärlor. De andra filer som skapas inkluderar “analys/analysChoices.txt” som listar analysval, “analys/p*/skipAnalysis.txt”, som listar fall där analysen hoppas över på grund av betydande befintlig drift, och “analys/p*/part_shift_values_pixel_degree.dat” som listar uppskattade driftvärden. AnViM ändrar inte rådata i mappen “tnimgs”. Se bild 5 för visuell beskrivning av följande steg som vägleder inrättandet av automatiserad dataanalys med AnViM. Starta Fiji-programvaran och välj det första alternativet i den rullgardinsmenyn MSM märkt som MSM – förbehandling. Med hjälp av dialogrutan för filwebbläsaren väljer du mappen som innehåller mappen “tnimgs”, som innehåller analyserade data. Definiera kanalen för bilderna. Enligt riktlinjerna från kompletterande figur S5, identifiera kanalnumren på den överförda ljusbilden av cellerna (faskontrastbild av cellerna), bottenpärlor bild och topppärlor bild. Följande tre kryssrutor (“Flytta filer till positionmappen”, “Gör ytterligare korrigering för styv rörelse” och “Beskär data och spara i positionsmapp”) markeras vanligtvis. Slutligen definierar du tolerans för att avvisa kraftigt drivna data, pixelstorlek och sidor av bilden där cellerna korsar. Svara på uppmaningen för att förbättra ljusstyrkan och kontrasten hos de nedre pärlbilderna så att pärlorna visas framträdande. Justera detta med skjutreglaget på menyn och klicka på OK. Utför nu positionskorrigering för att bli av med skiften, om några. När du är klar skapas en analysmapp.Kontrast förbättring behövs vanligtvis inte, men den här bestämmelsen är tillgänglig för experiment där exponeringen för lasrar måste minimeras. Efter det valet kopierar AnViM filerna från mappen “tnimgs” till mappen “analys”. Filerna som motsvarar varje position sparas i mapparna “analys/p0, analys/p1”, etc. I var och en av dessa positionsmappar gör AnViM mapparna “cels”, “defs” och “refs” som innehåller den ursprungliga överförda ljusbilden, bilder av topppärlor respektive bilder av nederkantpärlor (kompletterande figur S6). AnViM analyserar sedan styv rörelse i bilderna av de nedre pärlorna och skapar en “phs” mapp som innehåller en korrigerad överförd ljusbild av cellerna och en “tny” mapp som innehåller uppdaterade topppärlor bilder. Slutligen sparas användarval för kanaler, operationer, tolerans, pixelstorlek och gränsövergång i filen “analysisChoices.txt” (kompletterande figur S6). Kvantifiering av deformation av hydrogel och monoskiktOBS: Det är viktigt att notera att kvantifiering av rörelse från en sekvens av bilder är ett snabbt föränderligt fält19. Tekniken är ständigt optimerad för funktioner, inklusive hastighet, noggrannhet, specifika funktioner i de råa bilderna och specifika deformationsmönster. Därför är det troligt att vissa användare kan använda en annan deformationskvantifieringsmetod än den som presenteras här. Del 1: Kvantifiering av hydrogeldeformationManuella indata i det här steget inkluderar identifiering av datakatalog och val av rutnätsupplösning. Viktiga tidigare skapade filer som används i det här steget inkluderar “p*/tny/*.tif”. Viktiga nya filer som produceras i detta inkluderar “p */displacement/*_disp.dat” som listar deplacementvektorer av hydrogelens övre yta. Se figur 6 för visuell beskrivning av följande steg för att via AnViM engagera partikelbilds velocimetry-analysen på de övre pärlornas bilder20. Starta Fiji-programvaran och välj MSM – Gel Deformation från rullgardinsmenyn MSM . Härifrån väljer du det alternativ som är lämpligt för experimentet. Med hjälp av dialogrutan filwebbläsaren väljer du den överordnade katalogen för “analysmappen” som innehåller analyserade data. I fönstret Parametrar för beräkning av geldeformation väljer du lämplig fönsterstorlek, ljudnivå och tröskelvärde (kompletterande figur S7)20.OBS: Resultaten sparas i en nyskapad “förskjutningskatalog” i varje positionmapp “analys/p0, analys/p1”, etc. Det är här alla utdatafiler lagras. Del 2: Kvantifiering av monoskiktsdeformationManuella indata i det här steget inkluderar identifiering av datakatalogen och val av rutnätsupplösning. Viktiga tidigare skapade filer som används i det här steget inkluderar “p*/tny/*.tif”. Viktiga nya filer som produceras i detta inkluderar “p */velocity/*_vel.dat” som listar rörelsevektorer i cellerna. Se figur 7 för den visuella beskrivningen av stegen för att via AnViM engagera partikelbilds velocimetry-analysen på de översta pärlornas bilder20. Proceduren liknar den som följs för kvantifiering av hydrogeldeformation och väljer MSM – Cellular Motion från MSM-rullgardinsmenyn. Resultaten sparas i en nyskapad hastighetskatalog i varje positionsmapp “analys/p0”, “analys/p1”, etc. Kvantifiering av cell-ECM och cell-cell krafterManuell inmatning i det här steget inkluderar identifiering av datakatalogen, indikerar hydrogelstelhet och svar på cellulära klustersegmenteringsmeddelanden för att identifiera celler från området utan celler. Viktiga tidigare skapade filer som används i det här steget inkluderar “p*/displacement/*_disp.dat”. Viktiga nya filer som produceras i detta steg inkluderar: “p*/traction/*_trac.dat”, som listar krafter som utövas av cellerna på hydrogelen; “p*/traction/*_domain.dat”, som anger placeringen av rutnätspunkter som innehåller celler. och mata in filer ‘p*/traction.in, p*/clusterInput.txt’ och ‘p*/prestress.in’ som registrerar användarval för det här steget. Efter den första kvantitativa bedömningen av cell-ECM och cell-cell krafter, flera variationer till tekniken har utvecklats1,15. Variationerna fokuserar på särskilda fall av substrat, celler, experimentella förhållanden eller numeriska verktyg7,8,21,22. Se figur 8 för den visuella beskrivningen att aktivera via AnViM, Fourier Transform Traction Microscopy och Monolayer Stress Microscopy analys på hydrogel deformation data1,2,15. Starta Fiji-programvaran och välj MSM – Cell-ECM och Cell-Cell Forces (tredje alternativet i rullgardinsmenyn) på den nedrullningsbara menyn MSM – Cell-ECM och Cell-Cell Forces (tredje alternativet i den nedrullningsbara menyn). Med hjälp av dialogrutan filwebbläsaren väljer du den överordnade katalogen för “analysmappen” som innehåller mapparna “tnimgs” och “analys” som innehåller analyserade data. Klicka på Välj. I fönstret Parametrar för beräkning av cellulära krafter anger du skjuvmodulen, tjockleken på hydrogelen och den förväntade ljudnivån. Välj OK. Detta gör att den kan utföra dragkraft via MATLAB-funktionen.Efter dessa indata beräknar AnViM cell-ECM-krafter. Därefter anger du om monolagret är sammanflöde. Om hela cellbilden är täckt med celler är svaret Ja. I så fall beräknas cellcellskrafterna över hela ramen. Å andra sidan, om en del av bilden inte har celler, är svaret Nej. I så fall följer du AnViM-uppmaningar för att underlätta segmentering av bildområdet som innehåller celler. Om svaret är nej ritar du en polygon manuellt runt icke-cellobjektet när programvaran uppmanas att göra det och väljer sedan en lämplig metod för segmentering. Programvaran kommer att be om färgen (svart eller vit) på cellerna. Markera alternativet Fyllningsfläckar automatiskt i programvaran och klicka på OK.OBS: Stegen för segmentering av ett icke-sammanflödesmonolayer kommer att omfattas av den första delen av avsnitt 2.4. Cell-ECM-krafter lagras i “*_trac.dat” filer i en nyskapad katalog “traction” i varje positionsmapp, och indata till cell-ECM-kraftberäkningsprogrammet sparas i filen “traction.in” (kompletterande figur S8). Cellcellskrafter lagras i *_prestress.dat-filer i en nyskapad katalog “prestress” i varje position mapp, och indata till cell-cell kraftberäkningsprogramvaran sparas i filen “prestress.in” (kompletterande figur S9). Mappa rutnätspunktvärden på enskilda cellerOBS: Ett av iTACS nuvarande fokus är att införa ett enkelt tillvägagångssätt för att tolka de uppmätta mekaniska signalerna i fältet. Detta tillvägagångssätt är fördelaktigt för att undersöka mekaniska interaktioner mellan närliggande celler i ett kluster18. Sammantaget finns de egenskaper som kvantifierats hittills på regelbundet åtskilda rutnätspunkter över cellklustret. Dessa data identifierar median-, medelvärdes- och standardavvikelse för valda egenskaper inom den morfologiska gränsen för enskilda celler och tilldelar dem som cellulära fysiska egenskaper/signaler. Från dessa används standardavvikelsen för att ange variabilitet, skillnaden mellan medelvärde och median används för att ange fördelningens art och medianvärdet används för att ange cellernas totala tillstånd för de valda egenskaperna.Del 1: Segmentering av bildområdet som innehåller cellerManuell inmatning till det här steget inkluderar identifiering av datakatalog och svar på segmenteringsmeddelandena för att identifiera celler från området utan celler. Viktiga tidigare skapade filer som används i det här steget inkluderar “p*/phs/*.tif”. Viktiga nya filer som produceras i det här steget inkluderar “p*/phs/bwImages/*.tif” som är binära bilder som skiljer cellområden från celler, “p*/phs/textResults/frameNum_percentHealed.txt”, som listar procent bildområde som täcks av celler i varje enskilt fall, och “p*/clusterInput.txt”, som registrerar användargränssnitt som anges i AcTRM-gränssnittet. Se bild 9 för den visuella beskrivningen av följande steg för att segmentera bildområdet som innehåller celler. Den här delen måste slutföras innan cellcellskrafterna datorförs. I så fall behöver dessa steg inte upprepas. Om dessa steg utförs före cell-cellkraftberäkningarna begärs de inte i början av kraftberäkningarna. Starta Fiji-programvaran och välj Segmentering – Cellular Cluster på den nedrullningsbara MSM-menyn. Med hjälp av dialogrutan för filwebbläsaren väljer du positionskatalogen “analys/p0”, “analys/p1” etc., som innehåller egenskaper som kvantifierats på regelbundet fördelade rutnätspunkter. Ange om monolagret är sammanflöde.STEGEN nedan anropas endast när monolagret inte är sammanflöde. Följ AnViM-uppmaningar om att tillämpa den nya flerdelade metoden för att identifiera de bildregioner som innehåller celler. Processen involverar fyra metoder – var och en närmar sig segmentering på ett annat sätt. En eller flera av dessa metoder som används i kombination täcker en mängd olika bilder av cellerna. Prova därför olika metoder för att hitta vilken kombination som fungerar bäst för deras data. Justera “Domänanslutningsfaktorn” och “Smear-faktorn” för att uppnå optimal segmentering.OBS: “Utstryksfaktorn” gör de regioner som innehåller celler större. Ange om cellerna visas svartvitt i den binära bilden. I fönstret Vägbeskrivning för att rensa gränsbilden väljer du om bilden ska rensas automatiskt eller manuellt.Oönskade funktioner i bilderna är svarta fläckar på pixlarna som upptas av celler och vita fläckar på pixlarna som är frånkopplade från cellklustret som ska analyseras. Analys kan endast göras på de regioner som är anslutna. Så flera frånkopplade regioner måste analyseras separat. Del 2: Segmentering av de enskilda cellerna i bildernaManuella indata till det här steget inkluderar identifiering av datakatalogen och svar på segmenteringsmeddelandena för att identifiera enskilda celler i bilden. Viktiga tidigare skapade filer som används i det här steget inkluderar “p*/phs/*.tif” och “p*/phs/bwImages/*.tif”. Viktiga nya filer som produceras inkluderar “p*/phs/textResults/*.csv”, som innehåller cellulära morfologiska egenskaper. Se bild 10 för visuell beskrivning av följande steg för att segmentera enskilda celler i monolagret. Starta Fiji-programvaran och välj Segmentering – enskilda celler på den nedrullningsbara MSM-menyn. Med hjälp av dialogrutan för filwebbläsaren väljer du positionskatalogen “analys/p0”, “analys/p1” etc., som innehåller egenskaper som kvantifierats på regelbundet fördelade rutnätspunkter. I fönstret Välj indataparametrar anger du det maximala bildförhållandet, framträdandet för hur mycket cellcentret sticker ut jämfört med cellgränsen och två suddiga parametrar för att styra identifieringen av cellerna (kompletterande figur S10). Rita en polygon på den minsta normala cellen i bildstacken för varje position. Detta används för att beräkna området. Allt mindre än detta kommer inte att betraktas som en cell av programvaran. Rita sedan en polygon runt den största normala cellen och ange om cellcentret eller cellcellsgränssnittet är ljusare.AnViM skapar sedan filer “phs/textResults/0001.csv”, “phs/textResults/0002.csv” , etc., för varje bildruta som innehåller information om celler inom ramen. I detta skede innehåller denna fil morfologisk information om cellerna, inklusive område, centroid, omkrets, orientering, cirkularitet, bildförhållande, avrundadhet, soliditet, avstånd från no-cell-regionen. Längdenheten i dessa egenskaper är pixlar och vinkeln är i grader. Slutligen uppdateras den här filen så att den innehåller cellulär pixelintensitet, rörelse och krafter i de efterföljande stegen. Del 3: Kartläggning av pixelintensiteterna på cellernaManuella indata i det här steget inkluderar identifiering av datakatalogen och val av mappningsegenskaper och parametrar. Viktiga tidigare skapade filer som används i det här steget inkluderar “p*/phs/*.tif” (eller “p*/fluo/*.tif” och “p*/phs/bwImages/*.tif”. Viktiga nya filer som produceras i det här steget inkluderar “p*/phs/textResults/*.csv”, som listar cellulära morfologiska egenskaper. Se bild 11 för visuell beskrivning av följande steg för att bedöma pixelintensiteterna i regionen som omfattas av enskilda celler och deras närliggande region och definiera dem som cellers egenskaper. Starta Fiji-programvaran och välj Karta på celler – intensiteter på den nedrullningsbara MSM-menyn. Med hjälp av dialogrutan för filwebbläsaren väljer du positionskatalogen “analys/p0”, “analys/p1” etc., som innehåller egenskaper som kvantifierats på regelbundet fördelade rutnätspunkter. Välj Identifiera celldelning eller kvantifiera cellulär fluorescens när du uppmanas av programvaran. Definiera storleken på grannregionen. Markera både insamlingsegenskaper för grannregionen och Samla in egenskaper för cellerna. Klicka på OK. I fönstret Spela in cellintensiteten anger du vilken typ av bild som ska användas för intensitetsmappning, storleken på grannregionen och om data samlas in för enskilda celler eller båda cellerna och deras angränsande regioner (kompletterande figur S11).OM du mappar pixelintensiteten i en faskontrastbild kan du identifiera celldelningshändelser. Kartläggning av fluorescerande bildintensiteter gör det möjligt att upptäcka fluktuationer i de fluorescerande taggade cytoplasmiska molekylerna. Utdata för ovanstående steg är medelvärdet, medianvärdet, standardavvikelsen, minimi- och maximivärdena för pixelintensitet för enskilda celler. Dessa siffror anges som nya kolumner i filerna “phs/textResults/0001.csv”, “phs/textResults/0002.csv” , etc. Del 4: Kartläggning av krafter och rörelse på cellernaManuella indata till det här steget inkluderar identifiering av datakatalogen och val av mappningsegenskaper och parametrar. Viktiga tidigare skapade filer som används i det här steget inkluderar “p*/phs/textResults/*.csv”, “p*/velocity/*_vel.dat”, “p*/displacement/*_disp.dat”, “p*/traction/*_trac.dat”, “p*/prestress/*_prestress.dat” och “p*/phs/bwImages/*.tif”. Inga nya filer skapas under det här steget. I stället läggs den nya informationen (cellulär kraft och rörelseegenskaper) till i filerna “p*/phs/textResults/*.csv”. Se figur 12 för visuell beskrivning av stegen för att bedöma krafter och rörelser i regionen som omfattas av enskilda celler och deras närliggande region och definiera dem som cellers egenskaper. Välj mellan den nedrullningsbare MSM-menyn Karta över celler – rörelse/kraftdata (kompletterande figur S12). Följ sedan stegen i steg 2.4.3.OBS: Nya kolumner läggs till i filerna “phs/textResults/0001.csv”, “phs/textResults/0002.csv”, etc. och inkluderar medelvärdet, medianen och standardavvikelsen för hastighet, hastighetsorientering, genomsnittlig cytoskeletalspänning, spänningsanisotropi, belastningsenergi i hydrogelen, orienteringen av den högsta spänningen och storleken på cell-ECM-dragkraft (Kompletterande figur S13). Visualisering av resultat Del 1: Spårning av de cellulära identiteterna i experimentetManuella indata till det här steget inkluderar identifiering av datakatalogen och val av mappade egenskaper för att visualisera. Viktiga tidigare skapade filer som används i det här steget inkluderar “p*/phs/textResults/*.csv”. Viktiga nya filer som produceras under detta steg inkluderar “p*/phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv”, som innehåller en tidsspårning av mobildata. Se bild 13 för visuell beskrivning av följande steg för att spåra egenskaperna hos enskilda celler under hela experimentets varaktighet. Starta Fiji-programvaran och välj Resultat – Spåra data på den nedrullningsbara MSM-menyn. Med hjälp av dialogrutan för filwebbläsaren väljer du positionskatalogen “analys/p0”, “analys/p1” osv., som innehåller cellulära egenskaper som ska spåras. När du är klar klickar du på Välj. I fönstret Välj startpunkt för spårning väljer du startramen för övervakning och antalet bildrutor som spåras samtidigt (kompletterande figur S14). Börja alltid från bildruta 2 eftersom hastigheten inte kan bestämmas för bildruta nummer 1. När du är klar klickar du på OK. I fönstret Markera variablerna för att göra spår väljer du variablerna antingen genom att skriva variabelnamnen eller välja termer i kryssrutorna (Kompletterande figur S15). Klicka sedan på OK.Observera: Spårning genererar “phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv”-filer där varje kolumn innehåller ett unikt cellnummer och varje rad som representerar den på varandra följande tidsinstansen. Del 2: Generering av tidsspår av de bedömda cellulära egenskapernaManuella indata till det här steget inkluderar identifiering av datakatalogen och val av mappade egenskaper för att visualisera. Viktiga tidigare skapade filer som används i det här steget inkluderar “p*/phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv”. Viktiga nya filer som produceras under detta steg inkluderar “p*/phs/trackedDataPlots/*.tif”, som innehåller tidsspårsdiagram och “p*/phs/trackedDataPlots/*.csv”, som innehåller diagramdata. Se bild 14 för visuell beskrivning av följande steg för att generera tidsspår för de bedömda cellulära egenskaperna. Starta Fiji-programvaran och välj Resultat – plot på den nedrullningsbara MSM-menyn. Med hjälp av dialogrutan för filwebbläsaren väljer du positionskatalogen “analys/p0”, “analys/p1” etc., som innehåller spårade cellulära egenskaper som ska ritas. Välj om du vill begränsa intrigen till celler med obrutna spår genom att klicka på knappen Ja eller Nej .Det här alternativet ignorerar cellerna, som inte kunde identifieras i en eller flera tidsinstanser. Välj antalet variabler som ska ritas samtidigt och klicka på OK.Obs: För närvarande tillåter AnViM att högst tre variabler visas i samma diagram. Välj enskilda variabler för att rita med en rullgardinsmeny.Obs: De här stegen skapar en TIFF-fil (Tagged Image File Format) och en kommaavgränsad datafil i mappen ‘phs/trackedDataPlots/’. Filnamnet består av variabelnamn avgränsade med ett understreck och slutar med ett cellnummer. Del 3: Generering av värmekartor över de bedömda cellulära egenskapernaManuella indata i det här steget inkluderar identifiering av datakatalogen och val av mappade egenskaper för att visualisera. Viktiga tidigare skapade filer som används i det här steget inkluderar “p*/phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv”. Viktiga nya filer som genereras i det här steget inkluderar ‘p*/phs/segmentedImages/cellPropMaps/*.tif’, som är värmekartor för cellulära egenskaper. Se figur 15 för visuell beskrivning av stegen för att generera värmekartor över de bedömda cellulära egenskaperna. Välj på den nedrullningsbare MSM-menyn Resultat – Bild. Följ stegen i steg 2.5.2.Utdata lagras som TIFF-filfiler i mappen ‘phs/segmentedImages/cellPropMaps/’. Filnamnen är tidsinstansnumret och variabelnamnet avgränsade med ett understreck.