We beschrijven de intraparenchymale transplantatie van menselijke neurale voorlopercellen getransduceerd met een dual reporter vector die luciferase-groen fluorescerend eiwit (GFP) in de hersenen van muizen tot expressie brengt. Na transplantatie wordt het luciferasesignaal herhaaldelijk gemeten met behulp van in vivo bioluminescentie en GFP-tot expressie brengende getransplanteerde cellen geïdentificeerd in hersensecties met behulp van fluorescentiemicroscopie.
Celtherapie is al lang een opkomend behandelingsparadigma in de experimentele neurobiologie. Celtransplantatiestudies zijn echter vaak gebaseerd op eindpuntmetingen en kunnen daarom slechts in beperkte mate longitudinale veranderingen van celmigratie en overleving evalueren. Dit artikel biedt een betrouwbaar, minimaal invasief protocol voor het transplanteren en longitudinaal volgen van neurale voorlopercellen (NPC’s) in het volwassen muizenbrein. Vóór transplantatie worden cellen getransduceerd met een lentivirale vector bestaande uit een bioluminescente (firefly-luciferase) en fluorescerende (groen fluorescerend eiwit [GFP]) reporter. De NPC’s worden getransplanteerd in de rechter corticale hemisfeer met behulp van stereotaxische injecties in de sensomotorische cortex. Na transplantatie werden getransplanteerde cellen gedetecteerd door de intacte schedel gedurende maximaal vijf weken (op dag 0, 3, 14, 21, 35) met een resolutielimiet van 6.000 cellen met behulp van in vivo bioluminescentie beeldvorming. Vervolgens worden de getransplanteerde cellen geïdentificeerd in histologische hersensecties en verder gekarakteriseerd met immunofluorescentie. Dit protocol biedt dus een waardevol hulpmiddel om cellen in het muizenbrein te transplanteren, te volgen, te kwantificeren en te karakteriseren.
Het zoogdierbrein heeft beperkte regeneratieve capaciteiten na letsel of ziekte, waardoor innovatieve strategieën nodig zijn om weefsel- en functioneel herstel te bevorderen. Preklinische strategieën richten zich op verschillende aspecten van hersenregeneratie, waaronder neuroprotectie, neurogenese, angiogenese 1,2, bloed-hersenbarrièreherstel 3,4 of celtherapie 5,6. Celtherapie heeft het voordeel dat het veel van deze pro-reparatieprocessen tegelijkertijd kan bevorderen. In experimenten met transplantatie van cellen heeft weefselherstel plaatsgevonden door (1) directe celvervanging en (2) productie van cytokines die leiden tot angiogenese en neurogenese7. Recente ontwikkelingen in stamceltechnologie hebben de ontwikkeling van schaalbare, goed gekarakteriseerde neurale celbronnen die nu in de pijplijn zitten voor klinische onderzoeken verder vergemakkelijkt (beoordeeld in 7,8,9). Hoewel celtherapieën het klinische stadium hebben bereikt voor een paar neurologische ziekten (bijv. De ziekte van Parkinson10, beroerte11 en dwarslaesie12), is hun werkzaamheid variabel geweest en is meer preklinisch onderzoek nodig om de mechanismen van graft-host interacties te begrijpen.
Een belangrijke beperking van veel preklinische studies is het continu volgen van de getransplanteerde cellen in de gastheer. Vaak worden alleen eindpuntmetingen uitgevoerd, waarbij de dynamische migratie- en overlevingsprocessen in de gastheerworden weggelaten 6,13. Deze beperkingen resulteren in de slechte karakterisering van de getransplanteerde cellen en vereisen hoge dieraantallen om longitudinale veranderingen te begrijpen. Om deze beperkingen te overwinnen, transduceren we in deze studie geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC)-afgeleide neurale voorlopercellen met een commercieel verkrijgbare dual-reporter lentivirale vector bestaande uit rode vuurvlieg luciferase en verbeterd groen fluorescerend eiwit (rFluc-eGFP). Deze cellen worden getransplanteerd via stereotaxische intraparenchymale injectie in de hersenen van de muis en worden longitudinaal gevolgd met behulp van in vivo bioluminescentie beeldvorming gedurende 5 weken. Na het verzamelen van hersenweefsel worden de GFP-tot expressie brengende getransplanteerde cellen geïdentificeerd en verder gekarakteriseerd in histologische hersensecties. Deze methode kan soepel worden aangepast aan alternatieve transduceerbare celbronnen en transplantatieroutes voor in vivo toepassingen in het knaagdierbrein. Over het algemeen is de procedure waardevol om longitudinale informatie te verkrijgen over de overleving en migratie van transplantaten in de hersenen van de muis en vergemakkelijkt de daaropvolgende histologische karakterisering.
Het regenereren van de gewonde hersenen om functioneel herstel mogelijk te maken, blijft een onvervulde uitdaging. Veel innovatieve preklinische benaderingen zijn geëvolueerd gericht op bijvoorbeeld immuunmodulatie19,20, angiogenese 1,21,22,23, bloed-hersenbarrière-integriteit 2,3,24,25 en celvervanging 5,26 . Vooral in de afgelopen jaren zijn celgebaseerde therapieën naar voren gekomen als een veelbelovende behandelingsstrategie voor de hersenen vanwege grote vooruitgang in stamceltechnologie en efficiënte differentiatieprotocollen15,28. Dit artikel biedt een waardevol protocol voor het transplanteren en volgen van neurale cellen in het muizenbrein. De methode is toepasbaar voor alle transduceerbare cellijnen voor in vivo toepassingen in het muizenbrein.
De gepresenteerde opstelling maakt gebruik van transplantaties van menselijke oorsprong in een muis. Deze transplantaties zijn op de lange termijn niet levensvatbaar bij immunocompetente wild-type muizen vanwege immunogeniciteit. Vandaar dat immunodeficiënte NSG-muizen werden gebruikt om deze beperking te overwinnen. Als alternatief kan het gebruik van muistransplantaties de voorkeur krijgen om de immunogene aspecten te overwinnen. Als transplantatie van menselijke cellen nodig is, vormen gehumaniseerde muismodellen een opkomend alternatief om de kans op transplantaatafstoting te verminderen29.
Een commerciële dual-reporter virale vector bestaande uit firefly luciferase en eGFP onder de EF1α promotor werd gebruikt om de transplantaties te visualiseren. Deze promotor werd geselecteerd om een hoge signaalintensiteit15 te bereiken. Afgezien van NPC’s is echter aangetoond dat andere celtypen de hersenfunctie na letsel bevorderen, waaronder pericyten30 en astrocyten31; vandaar dat, afhankelijk van de gebruikte cellijn, andere promotors meer geschikt kunnen zijn om hoge expressieniveaus te bereiken. Bovendien kan het gebruik van transgene promotors, zoals CMV, leiden tot downregulatie, vooral in langetermijnexperimenten32. De transductie-efficiëntie van de lentivirale vector is sterk afhankelijk van de gebruikte cellijn en kan variëren tussen afzonderlijke experimenten. Daarom moet de transductie-efficiëntie worden geëvalueerd voordat met de in vivo experimenten wordt begonnen en om variaties in transductie-werkzaamheid tussen experimenten te corrigeren. Het hersengebied van transplantatie beïnvloedt ook de signaalsterkte. Hoewel een detectielimiet van < 6.000 cellen werd bereikt voor corticale transplantaties, kan het zijn dat er meer cellen nodig zijn om een signaal te detecteren in diepere hersengebieden, bijvoorbeeld striatum of hippocampus.
Transplantatievolumes in de hersenen van de muis zijn beperkt tot 1-2 μL. Daarom is het belangrijk om een geschikt celnummer voor de experimenten te identificeren. Eerder is waargenomen dat toenemende celaantallen leiden tot een verminderde overlevingskans, hoogstwaarschijnlijk als gevolg van beperkte beschikbaarheid van voedingsstoffen en zuurstof in het gebied van transplantatie33. In vivo bioluminescentie beeldvorming biedt een relatief lage ruimtelijke resolutie in vergelijking met andere in vivo beeldvormingsmethoden zoals MRI of CT. Daarom kunnen korte migratieroutes van getransplanteerde cellen alleen betrouwbaar worden beoordeeld in de daaropvolgende post-hocanalyse .
De absolute signaalsterkte van de bioluminescentie is over het algemeen evenredig met het getransplanteerde celnummer. De signaalsterkte kan echter worden verminderd als grafts worden getransplanteerd in diepere hersenstructuren of als de signaalsterkte buiten het lineaire detectiespectrum van het in vivo beeldvormingssysteem ligt. Momenteel worden nieuwe substraten ontwikkeld om te zorgen voor een efficiëntere penetratie over de bloed-hersenbarrière dan D-luciferine, inclusief cycluc1. Deze substraten kunnen de detectiegrens van de getransplanteerde cellen in de toekomst verder verbeteren18. Over het algemeen maakt dit protocol een eenvoudige, minimaal invasieve procedure mogelijk om grafts in de hersenen van de muis te transplanteren en te observeren.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs RR en CT erkennen de steun van de Mäxi Foundation en het 3R Competence Center.
Viral Transduction | |||
pLL-EF1a-rFLuc-T2A-GFP-mPGK-Puro (Lenti-Labeler virus) | Systembio | LL410VA-1 | |
Consumables | |||
Eppendorf microtubes; 1.5 mL | Sigma Aldrich | Z606340 | |
Falcon Tubes; 15 mL | TPP | 91015 | |
Microscope cover slips | Product of choice | ||
Microscope slides | Product of choice | ||
Sterlie cotton swabs | Product of choice | ||
Sutures; 5/0 silk with curved needle | B. Braun | G0762482 | |
Syringe filter; 0.22 µm | TPP | 99722 | |
Syringe; 1 mL and 0.5 mL | B. Braun | 9166017V | |
Tissue culture plate (24-well) | TPP | 92024 | |
Equipment | |||
Automated cell counter (Vi-CELL XR) | Beckmann Coulter Life Science | 383721 | |
Forceps | Fine Science Tools | 11064-07 | |
Forceps, fine | Fine Science Tools | 11412-11 | |
Heating pad | Product of choice | ||
High Speed Brushless Micromotor Kit | Foredom | K.1060-22. | |
Ideal Micro Drill Burr Set Of 5 | Cell Point Specific | 60-1000 | |
In-Vivo imaging system (IVIS Lumina III with Living Imaging 4.2 software package) | Perkin Elmer | CLS136334 | |
Isoflurane vaporizer | Provet AG | 330724 | |
Microinjection Syringe Pump system | World Precision Instruments | UMP3T-1 | |
Microliter syringe; 700-Series; Volume: 5-10 µL | Hamilton | 7635-01 | |
Microtome | Leica | HM430 | |
NanoFill-33 G-Needle (removable and reusable) | World Precision Instruments | NF33BV-2 | |
Needle Holder | Fine Science Tools | 12001-13 | |
Perfusion pump and tubing | Masterflex | HV-77120-42 | |
Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | |
Small bonn scissors, straight | Fine Science Tools | 14184-09 | |
Small spring scissors, straight | Fine Science Tools | 15000-03 | |
Spatula | Merck | Z243213-2EA | |
Stereotaxic frame for rodents; motorized | World Precision Instruments | 99401 | |
Pharmaceuticals and Reagents | |||
Accutase | Invitrogen | A11105-01 | Proteolytic and collagenolytic; cell dissociation reagent |
Anti-Human Nuclei Antibody, clone 235-1, Biotin Conjugate | Merck | MAB1281B | |
B27 – Supplement (50x) | Gibco | 17504-001 | |
Betadine (11 mg Iod als Povidon-Iod pro 1 ml Lösung) | Mundipharma Medical Company | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
Blocking solution (3% donkey serum; 0.1% Triton-X-100 in PBS) | Product of choice; can be homemade | ||
CHIR99021 (10 mM – 2,500x) | StemMACS | 130-103-926 | |
Cryoprotectant solution | Product of choice; can be homemade | ||
DAPI solution (1 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
D-Luciferin Potassium Salt | Perkin Elmer | 122799 | |
DMEM/F12 | Gibco | 11320-074 | |
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-31570 | |
Donkey serum | Product of choice | ||
Esconarcon (Pentobarbitalum natricum 300 mg) | Streuli Pharma AG | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
Ethanol; 70% | Product of choice | ||
FGF Basic recombinant human protein, Animal-origin free | Thermo Fisher Scientific | PHG6015 | |
Glutamax (100x) | Gibco | A12860-01 | |
hLif (10 µg/mL – 1,000x) | PeproTech | AF-300-05-25UG | |
Isoflurane (Isofluran (1-Chlor-2,2,2-trifluorethyl-difluoromethylether) 99.9%) | Provet AG | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
Laminin-L521 (L-521) | Biolaminin LN | LN521 | |
Lidocaine ointment (Lidocain: 25 mg , Prilocain: 25 mg) | Aspen Pharma Schweiz GmbH | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
Mounting Medium | Product of choice; can be homemade | ||
N2- Supplement (100x) | Gibco | 75202-001 | |
Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
Ophtalmic lubricant (Retinol palmitat: 15,000 UI) | Bausch & Lomb Swiss AG | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
Paraformaldehyde solution | Product of choice | ||
PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Can also be homemade |
Poly-L-ornithine Solution (pLO) | Sigma-Aldrich | P4957 | |
Rimadyl (Carprofen 50 mg) | Zoetis Schweiz GmbH | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
Ringer lactate | B. Braun | 3570500 | |
Ringer solution | B. Braun | 3570030 | |
Saline (0.9% NaCl) | B. Braun | 3570160 | |
SB431542 (10 mM – 3,333.3x) | StemMACS | 130-106-543 | |
Tissue Adhesive (Histoacryl) | B. Braun | 1050060 |