यह अध्ययन माइटोकॉन्ड्रियल वॉल्यूम, माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के स्तर, माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन श्रृंखला संरचना और माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए में परिवर्तन का पता लगाने के लिए दो फ्लोरोसेंट रिपोर्टरों या एंटीबॉडी के साथ फ्लो साइटोमेट्री और डबल स्टेनिंग के आधार पर कई माइटोकॉन्ड्रियल कार्यात्मक मापदंडों को मापने के लिए एक नया दृष्टिकोण बताता है।
माइटोकॉन्ड्रिया कई न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के पैथोफिज़ियोलॉजी में महत्वपूर्ण हैं। माइटोकॉन्ड्रियल वॉल्यूम में परिवर्तन, माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता (एमएमपी), प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) के माइटोकॉन्ड्रियल उत्पादन, और माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए (एमटीडीएनए) कॉपी नंबर अक्सर इन प्रक्रियाओं की विशेषताएं होती हैं। यह रिपोर्ट विभिन्न सेल प्रकारों में कई माइटोकॉन्ड्रियल मापदंडों को मापने के लिए एक नवीन प्रवाह साइटोमेट्री-आधारित दृष्टिकोण का विवरण देती है, जिसमें मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) और आईपीएससी-व्युत्पन्न तंत्रिका और ग्लियल कोशिकाएं शामिल हैं। यह प्रवाह-आधारित रणनीति माइटोकॉन्ड्रियल वॉल्यूम, एमएमपी और आरओएस स्तरों को मापने के लिए जीवित कोशिकाओं का उपयोग करती है, साथ ही माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन श्रृंखला (एमआरसी) और एमटीडीएनए से जुड़े प्रोटीन जैसे माइटोकॉन्ड्रियल ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर ए (टीएफएएम) के घटकों का अनुमान लगाने के लिए निश्चित कोशिकाओं का उपयोग करती है।
फ्लोरोसेंट संवाददाताओं के साथ सह-धुंधला करके, जिसमें माइटोट्रैकर ग्रीन (एमटीजी), टेट्रामिथाइलरोडामाइन एथिल एस्टर (टीएमआरई), और माइटोसॉक्स रेड शामिल हैं, माइटोकॉन्ड्रियल वॉल्यूम, एमएमपी और माइटोकॉन्ड्रियल आरओएस में परिवर्तन को निर्धारित किया जा सकता है और माइटोकॉन्ड्रियल सामग्री से संबंधित किया जा सकता है। एमआरसी कॉम्प्लेक्स सबयूनिट्स के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ डबल धुंधलापन और बाहरी माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली 20 (टीओएमएम 20) के ट्रांसलोकेस एमआरसी सबयूनिट अभिव्यक्ति के मूल्यांकन की अनुमति देता है। चूंकि टीएफएएम की मात्रा एमटीडीएनए कॉपी संख्या के आनुपातिक है, इसलिए प्रति टीओएमएम 20 टीएफएएम का माप प्रति माइटोकॉन्ड्रियल वॉल्यूम में एमटीडीएनए का अप्रत्यक्ष माप देता है। पूरे प्रोटोकॉल को 2-3 घंटे के भीतर किया जा सकता है। महत्वपूर्ण रूप से, ये प्रोटोकॉल फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल मापदंडों के माप की अनुमति देते हैं, दोनों कुल स्तर पर और माइटोकॉन्ड्रियल वॉल्यूम के विशिष्ट स्तर पर।
माइटोकॉन्ड्रिया लगभग सभी यूकेरियोटिक कोशिकाओं में मौजूद आवश्यक अंग हैं। माइटोकॉन्ड्रिया ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन के माध्यम से एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) का उत्पादन करके ऊर्जा आपूर्ति के लिए जिम्मेदार हैं और जैवसंश्लेषण और चयापचय के लिए चयापचय मध्यस्थों के रूप में कार्य करते हैं। माइटोकॉन्ड्रिया कई अन्य महत्वपूर्ण सेलुलर प्रक्रियाओं में गहराई से शामिल हैं, जैसे कि आरओएस पीढ़ी, कोशिका मृत्यु, और इंट्रासेल्युलर सीए2 + विनियमन। माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन विभिन्न न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों से जुड़ा हुआ है, जिसमें पार्किंसंस रोग (पीडी), अल्जाइमर रोग (एडी), हंटिंगटन रोग (एचडी), फ्रीड्रेच की गतिभंग (एफआरडीए), और एमियोट्रोफिक लेटरल स्केलेरोसिस (एएलएस) 1 शामिल हैं। माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन और एमटीडीएनए असामान्यता में वृद्धि को भी मानव उम्र बढ़ने में योगदान करने के लिए माना जाता है 2,3.
न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों में विभिन्न प्रकार के माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन होते हैं, और माइटोकॉन्ड्रियल वॉल्यूम में परिवर्तन, एमएमपी विध्रुवण, आरओएस का उत्पादन, और एमटीडीएनए कॉपी नंबर में परिवर्तन आमहैं 4,5,6,7। इसलिए, रोग तंत्र का अध्ययन करते समय और संभावित चिकित्सीय एजेंटों का परीक्षण करते समय इन और अन्य माइटोकॉन्ड्रियल कार्यों को मापने की क्षमता बहुत महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, पशु मॉडल की कमी को ध्यान में रखते हुए जो मानव न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों को ईमानदारी से दोहराते हैं, मस्तिष्क कोशिकाओं में मानव रोग को पुन: उत्पन्न करने वाले उपयुक्त इन विट्रो मॉडल सिस्टम स्थापित करना इन बीमारियों की अधिक समझ और नएउपचारों के विकास की दिशा में एक महत्वपूर्ण कदम है।
मानव आईपीएससी का उपयोग न्यूरोनल और गैर-न्यूरोनल कोशिकाओं (यानी, ग्लियल कोशिकाओं) सहित विभिन्न मस्तिष्क कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है, और न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग से जुड़े माइटोकॉन्ड्रियल क्षति दोनों सेलप्रकारों 3,10,11,12,13 में पाई गई है। तंत्रिका और ग्लियल वंशों में आईपीएससी भेदभाव के लिए उपयुक्त तरीकेउपलब्ध हैं 14,15,16. ये कोशिकाएं इन विट्रो रोग मॉडलिंग और दवा स्क्रीनिंग के लिए एक अद्वितीय मानव / रोगी मंच प्रदान करती हैं। इसके अलावा, जैसा कि ये रोगियों से प्राप्त होते हैं, आईपीएससी-व्युत्पन्न न्यूरॉन्स और ग्लियल कोशिकाएं रोग मॉडल प्रदान करती हैं जो मनुष्यों में क्या हो रहा है, इसे अधिक सटीक रूप से दर्शाती हैं।
आज तक, आईपीएससी में कई माइटोकॉन्ड्रियल कार्यात्मक मापदंडों को मापने के लिए कुछ सुविधाजनक और विश्वसनीय तरीके उपलब्ध हैं, विशेष रूप से जीवित न्यूरॉन्स और ग्लियल कोशिकाएं, उपलब्ध हैं। फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग वैज्ञानिक को एकल कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन सहित जैविक मापदंडों को मापने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है। यह प्रोटोकॉल विभिन्न प्रकार की मस्तिष्क कोशिकाओं की पीढ़ी के लिए विवरण प्रदान करता है, जिसमें तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी), न्यूरॉन्स और आईपीएससी से ग्लियल एस्ट्रोसाइट्स शामिल हैं, साथ ही आईपीएससी और आईपीएससी-व्युत्पन्न तंत्रिका और ग्लियल कोशिकाओं सहित विभिन्न सेल प्रकारों में कई माइटोकॉन्ड्रियल मापदंडों को मापने के लिए उपन्यास प्रवाह साइटोमेट्री-आधारित दृष्टिकोण भी शामिल हैं। प्रोटोकॉल माइटोकॉन्ड्रियल वॉल्यूम, एमएमपी, माइटोकॉन्ड्रियल आरओएस स्तर, एमआरसी कॉम्प्लेक्स और टीएफएएम को मापने के लिए फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करने के लिए एक सह-धुंधला रणनीति भी प्रदान करता है। माइटोकॉन्ड्रियल मात्रा या द्रव्यमान के उपायों को शामिल करके, ये प्रोटोकॉल प्रति माइटोकॉन्ड्रियल इकाई कुल स्तर और विशिष्ट स्तर दोनों के माप की अनुमति देते हैं।
यहां आईपीएससी-व्युत्पन्न न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स उत्पन्न करने और प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन के कई पहलुओं का मूल्यांकन करने के लिए प्रोटोकॉल हैं। ये प्रोटोकॉल मान…
The authors have nothing to disclose.
हम नॉर्वे में बर्गन विश्वविद्यालय में आणविक इमेजिंग सेंटर और फ्लो साइटोमेट्री कोर सुविधा को धन्यवाद देते हैं। इस काम को नॉर्वेजियन रिसर्च काउंसिल (अनुदान संख्या: 229652), राकेल ओगो ओटो क्र ब्रून्स लेगाट और चीन छात्रवृत्ति परिषद (परियोजना संख्या: 201906220275) से वित्त पोषण द्वारा समर्थित किया गया था।
anti-Oct4 | Abcam | ab19857, RRID:AB_445175 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody. |
anti-SSEA4 | Abcam | ab16287, RRID:AB_778073 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody. |
anti-Sox2 | Abcam | ab97959, RRID:AB_2341193 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody. |
anti-Pax6 | Abcam | ab5790, RRID:AB_305110 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody. |
anti-Nestin | Santa Cruz Biotechnology | sc-23927, RRID:AB_627994 | Primary Antibody; use as 1:50, 20 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody. |
anti-GFAP | Abcam | ab4674, RRID:AB_304558 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-chicken IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11042) as secondary antibody. |
anti-S100β conjugated with Alexa Fluor 488 | Abcam | ab196442, RRID:AB_2722596 | Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; |
anti-TH | Abcam | ab75875, RRID:AB_1310786 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody. |
anti-Tuj 1 | Abcam | ab78078, RRID:AB_2256751 | Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody. |
anti-Synaptophysin | Abcam | ab32127, RRID:AB_2286949 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody. |
anti-PSD-95 | Abcam | ab2723, RRID:AB_303248 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-chicken IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11042) as secondary antibody. |
anti-TFAM conjugated with Alexa Fluor 488 | Abcam | ab198308 | Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; use mouse monoclonal IgG2b Alexa Fluor® 488 as an isotype control. |
anti-TOMM20 conjugated with Alexa Fluor 488 | Santa Cruz Biotechnology | Cat# sc-17764 RRID:AB_628381 | Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; use mouse monoclonal IgG2a Alexa Fluor® 488 as an isotype control. |
anti-NDUFB10 | Abcam | ab196019 | Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody; use rabbit monoclonal IgG as an isotype control. |
anti-SDHA | Abcam | ab137040 | Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody; use rabbit monoclonal IgG as an isotype control. |
anti-COX IV | Abcam | ab14744, RRID:AB_301443 | Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-mouse IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11001) as secondary antibody; use mouse monoclonal IgG as an isotype control. |
Activin A | PeproTech | 120-14E | Astrocyte differentiation medium ingredient |
ABM Basal Medium | Lonza | CC-3187 | Basal medium for astrocyte culture |
AGM SingleQuots Supplement Pack | Lonza | CC-4123 | Supplement for astrocyte culture |
Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | CDM ingredient |
Advanced DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | Basal medium for dilute Geltrex |
Bovine Serum Albumin | Europa Bioproducts | EQBAH62-1000 | Blocking agent to prevent non-specific binding of antibodies in immunostaining assays and CDM ingredient |
BDNF | PeproTech | 450-02 | DA neurons medium ingredient |
B-27 Supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | Astrocyte differentiation medium ingredient |
BD Accuri C6 Plus Flow Cytometer | BD Biosciences, USA | ||
Chemically Defined Lipid Concentrate | Thermo Fisher Scientific | 11905031 | CDM ingredient |
Collagenase IV | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | Reagent for gentle dissociation of human iPSCs |
CCD Microscope Camera Leica DFC3000 G | Leica Microsystems, Germany | ||
Corning non-treated culture dishes | Sigma-Aldrich | CLS430589 | Suspension culture |
DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | Used for a variety of cell culture wash |
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 10565018 | Astrocyte differentiation basal Medium |
EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | Reagent for gentle dissociation of human iPSCs |
Essential 8 Basal Medium | Thermo Fisher Scientific | A1516901 | Basal medium for iPSC culture |
Essential 8 Supplement (50X) | Thermo Fisher Scientific | A1517101 | Supplement for iPSC culture |
EGF Recombinant Human Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0314 | Supplement for NSC culture |
FGF-basic (AA 10–155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0024 | Supplement for NSC culture |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12103C | Medium ingredient |
FGF-basic | PeproTech | 100-18B | Astrocyte differentiation medium ingredient |
FCCP | Abcam | ab120081 | Eliminates mitochondrial membrane potential and TMRE staining |
Fluid aspiration system BVC control | Vacuubrand, Germany | ||
Formaldehyde (PFA) 16% | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Cell fixation |
Geltrex | Thermo Fisher Scientific | A1413302 | Used for attachment and maintenance of human iPSCs |
GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Supplement for NSC culture |
GDNF | Peprotech | 450-10 | DA neurons medium ingredient |
Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | Used for blocking buffer |
Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 31765027 | Basal medium for CDM |
Heregulin beta-1 human | Sigma-Aldrich | SRP3055 | Astrocyte differentiation medium ingredient |
Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H1399 | Stain the nuclei for confocal image |
Heracell 150i CO2 Incubators | Fisher Scientific, USA | ||
IMDM | Thermo Fisher Scientific | 21980032 | Basal medium for CDM |
Insulin | Roche | 1376497 | CDM ingredient |
InSolution AMPK Inhibitor | Sigma-Aldrich | 171261 | Neural induction medium ingredient |
Insulin-like Growth Factor-I human | Sigma-Aldrich | I3769 | Astrocyte differentiation medium ingredient |
KnockOut DMEM/F-12 medium | Thermo Fisher Scientific | 12660012 | Basal medium for NSC culture |
Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Promotes attachment and growth of neural cells in vitro |
Leica TCS SP8 STED confocal microscope | Leica Microsystems, Germany | ||
Monothioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | CDM ingredient |
MitoTracker Green FM | Thermo Fisher Scientific | M7514 | Used for mitochondrial volume indicator |
MitoSox Red | Thermo Fisher Scientific | M36008 | Used for mitochondrial ROS indicator |
N-Acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | Neural induction medium ingredient |
N-2 Supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | Astrocyte differentiation medium ingredient |
Normal goat serum | Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | Used for blocking buffer |
Orbital shakers – SSM1 | Stuart Equipment, UK | ||
Poly-L-ornithine solution | Sigma-Aldrich | P4957 | Promotes attachment and growth of neural cells in vitro |
Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P7405 | Promotes attachment and growth of neural cells in vitro |
Purmorphamine | STEMCELL Technologies | 72204 | Promotes DA neuron differentiation |
ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36930 | Mounting the coverslip for confocal image |
PBS 1x | Thermo Fisher Scientific | 18912014 | Used for a variety of wash |
Recombinant Human/Mouse FGF-8b Protein | R&D Systems | 423-F8-025/CF | Promotes DA neuron differentiation |
SB 431542 | Tocris Bioscience | TB1614-GMP | Neural Induction Medium ingredient |
StemPro Neural Supplement | Thermo Fisher Scientific | A10508-01 | Supplement for NSCs culture |
TrypLE Express Enzyme | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | Cell dissociation reagent |
Transferrin | Roche | 652202 | CDM ingredient |
TRITON X-100 | VWR International | 9002-93-1 | Used for cells permeabilization in immunostaining assays |
TMRE | Abcam | ab113852 | Used for mitochondrial membrane potential staining |
Water Bath Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant Instruments | Grant Instruments, USA |