Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerde Multipl Mitokondriyal Parametrelerin ve Nöral ve Glial Türevlerinin Akış Sitometrik Analizi

Published: November 8, 2021 doi: 10.3791/63116
Automatic Translation
*1,2, *1,2,3,4, 1,2, 1,2
1Department of Clinical Medicine (K1), University of Bergen, 2Neuro-SysMed, Center of Excellence for Clinical Research in Neurological Diseases, Haukeland University Hospital, 3Department of Neurosurgery, Qilu Hospital and Institute of Brain and Brain-Inspired Science, Cheeloo College of Medicine, Shandong University, 4Shandong Key Laboratory of Brain Function Remodeling
* These authors contributed equally

Summary

Bu çalışma, mitokondriyal hacim, mitokondriyal membran potansiyeli, reaktif oksijen türleri seviyesi, mitokondriyal solunum zinciri bileşimi ve mitokondriyal DNA'daki değişiklikleri tespit etmek için iki floresan muhabir veya antikor ile akış sitometrisine ve çift boyamaya dayalı çoklu mitokondriyal fonksiyonel parametreleri ölçmek için yeni bir yaklaşım sunmaktadır.

Abstract

Mitokondri birçok nörodejeneratif hastalığın patofizyolojisinde önemlidir. Mitokondriyal hacimdeki değişiklikler, mitokondriyal membran potansiyeli (MMP), reaktif oksijen türlerinin mitokondriyal üretimi (ROS) ve mitokondriyal DNA (mtDNA) kopya sayısı genellikle bu süreçlerin özellikleridir. Bu rapor, insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (iPSC'ler) ve iPSC kaynaklı nöral ve glial hücreler de dahil olmak üzere farklı hücre tiplerinde çoklu mitokondriyal parametreleri ölçmek için yeni bir akış sitometrisine dayalı yaklaşımı detaylandırmaktadır. Bu akış tabanlı strateji, mitokondriyal hacim, MMP ve ROS seviyelerini ölçmek için canlı hücrelerin yanı sıra mitokondriyal solunum zincirinin (MRC) bileşenlerini ve mitokondriyal transkripsiyon faktörü A (TFAM) gibi mtDNA ile ilişkili proteinleri tahmin etmek için sabit hücreleri kullanır.

MitoTracker Green (MTG), tetrametilrodamin etil ester (TMRE) ve MitoSox Red dahil olmak üzere floresan muhabirlerle birlikte boyanarak, mitokondriyal hacim, MMP ve mitokondriyal ROS'taki değişiklikler ölçülebilir ve mitokondriyal içerikle ilişkilendirilebilir. MRC kompleks alt birimlerine ve dış mitokondriyal membran 20 (TOMM20) translokazına karşı antikorlarla çift boyama, MRC alt birim ekspresyonunun değerlendirilmesine izin verir. TFAM miktarı mtDNA kopya sayısı ile orantılı olduğundan, TOMM20 başına TFAM ölçümü, mitokondriyal hacim başına mtDNA'nın dolaylı bir ölçümünü verir. Tüm protokol 2-3 saat içinde gerçekleştirilebilir. Önemli olarak, bu protokoller, akış sitometrisi kullanılarak mitokondriyal parametrelerin hem toplam seviyede hem de mitokondriyal hacim başına spesifik seviyede ölçülmesine izin verir.

Introduction

Mitokondri, hemen hemen tüm ökaryotik hücrelerde bulunan esansiyel organellerdir. Mitokondri, oksidatif fosforilasyon yoluyla adenozin trifosfat (ATP) üreterek enerji tedarikinden sorumludur ve biyosentez ve metabolizma için metabolik aracılar olarak işlev görür. Mitokondri, ROS üretimi, hücre ölümü ve hücre içi Ca2 + regülasyon gibi diğer birçok önemli hücresel süreçte derinden rol oynar. Mitokondriyal disfonksiyon, Parkinson hastalığı (PD), Alzheimer hastalığı (AD), Huntington hastalığı (HD), Friedreich ataksi (FRDA) ve amiyotrofik lateral skleroz (ALS)1 dahil olmak üzere çeşitli nörodejeneratif hastalıklarla ilişkilendirilmiştir. Artmış mitokondriyal disfonksiyon ve mtDNA anormalliğinin de insan yaşlanmasına katkıda bulunduğu düşünülmektedir 2,3.

Nörodejeneratif hastalıklarda çeşitli mitokondriyal disfonksiyon tipleri ortaya çıkar ve mitokondriyal hacimdeki değişiklikler, MMP depolarizasyonu, ROS üretimi ve mtDNA kopya sayısındaki değişiklikler yaygındır 4,5,6,7. Bu nedenle, bu ve diğer mitokondriyal fonksiyonları ölçme yeteneği, hastalık mekanizmalarını incelerken ve potansiyel terapötik ajanları test ederken büyük önem taşımaktadır. Ayrıca, insan nörodejeneratif hastalıklarını sadık bir şekilde kopyalayan hayvan modellerinin eksikliği göz önüne alındığında, beyin hücrelerinde insan hastalığını özetleyen uygun in vitro model sistemlerin kurulması, bu hastalıkların daha iyi anlaşılması ve yeni tedavilerin geliştirilmesi için önemli bir adımdır 2,3,8,9.

İnsan iPSC'leri, nöronal ve nöronal olmayan hücreler (yani, glial hücreler) dahil olmak üzere çeşitli beyin hücreleri üretmek için kullanılabilir ve nörodejeneratif hastalıkla ilişkili mitokondriyal hasar her iki hücre tipinde debulunmuştur 3,10,11,12,13. Nöral ve glial soylara iPSC farklılaşması için uygun yöntemler mevcuttur14,15,16. Bu hücreler, in vitro hastalık modellemesi ve ilaç taraması için benzersiz bir insan / hasta platformu sağlar. Ayrıca, bunlar hastalardan türetildiğinden, iPSC kaynaklı nöronlar ve glial hücreler, insanlarda neler olup bittiğini daha doğru yansıtan hastalık modelleri sağlar.

Bugüne kadar, iPSC'lerde, özellikle canlı nöronlarda ve glial hücrelerde çoklu mitokondriyal fonksiyonel parametreleri ölçmek için birkaç uygun ve güvenilir yöntem mevcuttur. Akış sitometrisinin kullanımı, bilim adamına mitokondriyal fonksiyon da dahil olmak üzere biyolojik parametreleri tek hücrelerde ölçmek için güçlü bir araç sağlar. Bu protokol, iPSC'lerden nöral kök hücreler (NSC'ler), nöronlar ve glial astrositler dahil olmak üzere farklı tipte beyin hücrelerinin yanı sıra iPSC'ler ve iPSC türevi nöral ve glial hücreler de dahil olmak üzere farklı hücre tiplerinde çoklu mitokondriyal parametreleri ölçmek için yeni akış sitometrisine dayalı yaklaşımlar için ayrıntılar sağlar. Protokol ayrıca mitokondriyal hacmi, MMP'yi, mitokondriyal ROS seviyesini, MRC komplekslerini ve TFAM'yi ölçmek için akış sitometrisini kullanmak için bir ortak boyama stratejisi sağlar. Mitokondriyal hacim veya kütle ölçümlerini içererek, bu protokoller mitokondriyal birim başına hem toplam seviyenin hem de spesifik seviyenin ölçülmesine izin verir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

NOT: Bu protokolde kullanılan tüm ortam ve çözümlerin tarifleri için Malzeme Tablosuna ve Ek Tablo S1'e bakınız.

1. İnsan iPSC'lerinin NCS'lere, dopaminerjik (DA) nöronlara ve astrositlere farklılaşması

  1. Matris kaplı plakalar hazırlayın.
    1. Bir gecede buz üzerinde 5 mL'lik bir matris şişesi çözün. 1 mL matrisi 99 mL soğuk Advanced Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium/Ham'ın F-12'si (Advanced DMEM/F12) (% 1 nihai konsantrasyon) ile seyreltin. 1 mL aliquots yapın ve -20 ° C'de saklayın.
    2. Matris çözeltisini 4 ° C'de çözün (soğuk tutun) ve 6 kuyucuğu kaplayın (6 delikli bir plakada kuyucuk başına 1 mL).
    3. Matris kaplı plakayı nemlendirilmiş %5 CO2/%95 hava inkübatörüne 37 °C'de 1 saat boyunca yerleştirin. Plakayı inkübatörden çıkarın ve oda sıcaklığına (RT) dengelenmesini sağlayın.
      NOT: Plakanın kaplamadan sonraki 3 gün içinde kullanılması önerilir. Bununla birlikte, kaplanmış plaka 4 ° C'de 2 haftaya kadar saklanabilir. Sadece çıkarmayı ve kullanmadan önce RT'ye ısınmasına izin vermeyi unutmayın. Uzun süreli depolama için, matrisin kurumasını önlemek için kaplanmış plakaya 1 mL iPSC kültür ortamı ekleyin.
  2. iPSC'leri çözme
    1. Matris kaplı plakaları RT'de veya inkübatörde 37 ° C'de 20-30 dakika boyunca önceden ısıtın. RT'de gerekli miktarda iPSC kültür ortamını önceden ısıtın.
    2. 10 μM'lik nihai bir konsantrasyon elde etmek için 6 mL önceden ısıtılmış iPSC kültür ortamını 12 μL Y-27632 ROCK inhibitörü ile karıştırın.
    3. iPSC'lerin donmuş şişesini 37 ° C'de bir su banyosunda küçük bir buz parçası kalana kadar kısmen çözün.
    4. Hücrelere damla damla 12 μL ROCK inhibitörü ile yavaşça 1 mL önceden ısıtılmış iPSC kültür ortamı ekleyin. Şişenin sıvı içeriğini iPSC'lerle damla damla 5 mL'lik bir pipet kullanarak 6 delikli önceden kaplanmış bir plakanın bir kuyucuğuna aktarın.
    5. Kuyu içeriğini karıştırmak ve plakayı inkübatöre geri döndürmek için plakayı dik yönlerde hareket ettirin. Dulbecco'nun fosfat tamponlu salini (DPBS) (1x) (Ca 2+/Mg 2+-içermeyen) (6 delikli bir plakada kuyucuk başına 4 mL) ile yıkadıktan sonra24 saat sonra iPSC kültür ortamını değiştirin.
      NOT: Sonraki beslemelere ROCK inhibitörü eklemeyin. iPSC kültür ortamını günlük olarak değiştirin.
  3. iPSC'lerin alt kültürlenmesi
    1. Matris kaplı plakaları RT'de veya inkübatörde 37 ° C'de 20-30 dakika boyunca önceden ısıtın. RT'de gerekli miktarda iPSC kültür ortamını önceden ısıtın.
    2. Kültür ortamını hücreleri içeren plakalardan aspire edin. iPSC'leri DPBS (1x) (Ca2+/Mg2+-free) (6 delikli bir plakada kuyucuk başına 4 mL) ile durulayın.
    3. EDTA (0,5 mM) ekleyin (6 delikli bir plakada kuyu başına 1 mL). Kolonilerin kenarları kuyudan kalkmaya başlayana kadar plakaları 37 ° C'de kuluçkaya yatırın (genellikle 3-5 dakika). EDTA'yı aspire edin.
    4. Önceden ısıtılmış iPSC kültür ortamı ekleyin (6 delikli bir plakada kuyucuk başına 4 mL) ve 10 mL'lik steril pipet kullanarak iPSC kolonilerini bir kez zorla ayırın. Hücre kümelerini tek hücrelere ayırabileceğinden yukarı ve aşağı pipet yapmayın.
    5. Her bir kuyucuğun içeriğini matris kaplı 6 delikli bir plakada (6 delikli bir plakada kuyu başına 2 mL) iki ayrı kuyucuğa aktarın ve 37 ° C'de inkübe edin. Pipetleme sırasında süspansiyonda kabarcıklar oluşturmayın.
      NOT: İnkübatörde tutmadan önce plakayı hafifçe sallayın. Bölünme oranı 1: 2 (bir kuyudan 2 yeni kuyuya) ila 1: 4 (bir kuyudan 4 yeni kuyuya) kadar olabilir.
    6. Koloniler iyi boyut ve bağlantılarla birleştiğinde% 60 birleşene kadar ortamı günlük olarak değiştirin.
  4. Nöral indüksiyon ve nöral progenitör üretimi
    1. 500 mL Kimyasal Olarak Tanımlanmış Ortam (CDM), 500 mL Nöral İndüksiyon Ortamı (NIM) ve 500 mL Nöral Kök Hücre Serumsuz (NSC SF) ortamı hazırlayın.
    2. Hücreleri DPBS (1x) (Ca2+/Mg2+-free) (6 delikli bir plakada kuyucuk başına 4 mL) ile durulayın ve NIM (6 delikli bir plakada kuyucuk başına 3 mL) ekleyin. Gün 0 olarak ayarlayın.
    3. NIM'i (6 delikli bir plakada kuyu başına 3 mL) 1. Gün, 3. Gün ve 4. Gün'de değiştirin ve günlük mikroskopi altında gözlemleyin.
    4. 5. Günde, nöral rozetleri aşağıda açıklandığı gibi süspansiyon kültürüne ayırın.
      1. DPBS (1x) (Ca 2+/Mg2+-free) (6 delikli bir plakada kuyucuk başına 4 mL) ile bir kez nazikçe yıkayın. Kollajenaz IV ekleyin (6 delikli bir plakada kuyucuk başına 1 mL) ve 1 dakika boyunca bir inkübatörde tutun. Kollajenaz IV'ü aspire edin ve DPBS (1x) (6 delikli bir plakada kuyucuk başına 4 mL) ile bir kez yavaşça yıkayın.
      2. 6 delikli bir plakaya kuyucuk başına 2 mL NSC SF Medium ekleyin. 200 μL'lik bir pipet ucu kullanarak ızgaralar çizerek kuyucukların tabanlarını kazıyarak hücreleri ayırın.
      3. Hücre süspansiyonunu 6 delikli plakadan 10 cm'lik yapışmaz bir kaba toplayın. NSC SF Medium ile ses seviyesini 12 mL'ye kadar yükseltin.
      4. Yapışkan olmayan çanağı, birikmeyi önlemek için bir inkübatördeki yörüngesel çalkalayıcıda 65-85 rpm'de çalkalayın.
  5. DA nöron farklılaşması
    1. 7. Günde, 100 ng / mL fibroblast büyüme faktörü-8b (FGF-8b) ile desteklenmiş 12 mL CDM ekleyin ve çanağı inkübatördeki orbital çalkalayıcıya yerleştirin.
    2. 8-13. günlerde, ortamı her 2 günde bir değiştirin ve günlük mikroskopi altında gözlemleyin.
    3. 14. Günde, 100 ng / mL FGF-8b ve 1 μM purmorfamin (PM) ile desteklenmiş 12 mL CDM ekleyin. Çanağı inkübatördeki yörüngesel çalkalayıcıya yerleştirin.
    4. 15-20. günlerde, ortamı her 2 günde bir değiştirin ve mikroskopi altındaki hücreleri günlük olarak gözlemleyin.
    5. Daha büyük küreleri parçalamak için 1000 μL uçları kullanarak küreleri mekanik olarak geçirin.
      NOT: Oran 1: 2 olabilir (bir tabak 2 yeni tabağa dönüşür).
  6. Farklılaşmanın sonlandırılması
    1. Aşağıda açıklandığı gibi 6 delikli bir plakayı veya kapak kapaklarını Poli-L-Ornitin (PLO) ve laminin ile kaplayın.
      1. 6 delikli bir plakayı kuyu başına 1 mL PLO ile kaplayın ve plakayı 20 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. FKÖ çözümünü aspire edin.
      2. Plakayı UV altında 20 dakika sterilize edin. Kuyucukları DPBS (1x) ile iki kez durulayın (6 delikli bir plakada kuyucuk başına 4 mL).
      3. Kuyuya 5 μg / mL laminin çözeltisi (6 delikli bir plakada kuyu başına 1 mL) ekleyin ve 2 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Laminini aspire edin ve kaplamadan önce kuyucukları DPBS (1x) (6 delikli bir plakada kuyucuk başına 4 mL) ile bir kez kısaca yıkayın.
    2. Tüm küreleri (adım 1.5.5'ten itibaren) 50 mL tüplerde toplayın ve DPBS (1x) ile doldurun. 5 dakika boyunca 300 × g'da döndürün. Süper natantı aspire edin.
    3. Bir su banyosunda 37 °C'de 10 dakika boyunca 2 mL hücre ayrışma reaktifi ile inkübe edin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve ardından 200 μL'lik bir pipetle nazik tritürasyon yapın (kürelerin boyutuna bağlı olarak 20-50 kez, kabarcık oluşumunu önleyin).
    4. Hücre ayrışma reaktifini% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile 2 mL Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) ile nötralize edin ve hücreleri içeren 50 mL konik tüpü RT'de 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüj edin.
    5. 10 ng / mL Beyin Türetilmiş Nörotrofik Faktör (BDNF) ve 10 ng / mL Glial hücre hattı kaynaklı nörotrofik faktör (GDNF) ile desteklenmiş 1 mL CDM ekleyin ve tek hücreli süspansiyonlar elde etmek için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek hücre peletlerini yeniden askıya alın.
    6. Laminin çözeltisini plakadan aspire edin (adım 1.6.1.3), DPBS (1x) ile kısaca yıkayın (6 delikli bir plakada kuyucuk başına 4 mL) ve hücreleri (adım 1.6.5'ten itibaren) önceden kaplanmış plakalarda veya kapaklarda, 10 ng / mL BDNF ve 10 ng / mL GDNF ile desteklenmiş 3 mL CDM'de tohumlayın. Hücreleri her 4 günde bir besleyin.
      NOT: Farklılaşan kültürler 3 aya kadar haftalarca korunabilir. Nöral morfoloji genellikle 2 haftalık terminasyondan sonra ortaya çıkar ve bu noktadan itibaren aşağı akış analizleri için kullanılabilir. BDNF ve GDNF, daha uzun bakım (2 aya kadar) için kültürleme için gerekli değildir.
  7. NSC üretimi
    1. Ceket matris plakaları.
    2. Tüm nöral küreleri (adım 1.4'ten üretilen) 50 mL tüplerde toplayın ve DPBS (1x) (Ca2+/Mg2+-free) ile doldurun. 5 dakika boyunca 300 × g'da döndürün. Süpernatanları aspire edin.
    3. Peletleri bir su banyosunda 37 °C'de 10 dakika boyunca 2 mL hücre ayrışma reaktifi ile inkübe edin, ardından 200 μL'lik bir pipetle nazik tritürasyon (kürelerin boyutuna bağlı olarak 20-50 kez, kabarcık oluşumunu önleyin).
    4. % 10 FBS ile 2 mL DMEM ile nötralize edin ve RT'de 5 dakika boyunca 300 × g'de hücreleri içeren 50 mL konik tüpleri santrifüj edin. Tek hücreli süspansiyonlar elde etmek için hücre peletlerini hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden askıya alın.
    5. Matris çözeltisini önceden kaplanmış bir plakadan aspire edin ve önceden kaplanmış plakalardaki hücreleri NSC SF Medium'da tohumlayın (6 delikli bir plakada kuyucuk başına 3 mL). Hücreleri her 2-3 günde bir besleyin ve birleştiğinde hücreleri bölün.
      NOT: Bu aşamadan itibaren, NSC'ler genişletilebilir ve dondurulabilir.
  8. Glia astrosit farklılaşması
    1. NSC'lerden astrosit farklılaşması
      1. 500 mL Astrosit Farklılaşma Ortamı hazırlayın.
      2. NSC SF Medium ile Poli-D-Lizin (PDL) kaplı plakalar/kapaklar üzerinde tohum NSC'leri.
      3. Ertesi gün, hücreleri DPBS (1x) (Ca2 + / Mg2 + içermeyen) (6 delikli bir plakada kuyucuk başına 4 mL) ile durulayın ve Astrosit Farklılaşma Ortamı (6 delikli bir plakada kuyucuk başına 3 mL) ekleyin. Gün 0 olarak ayarlayın.
      4. NSC'leri mikroskop altında günlük olarak gözlemleyin ve Astrosit Farklılaşma Ortamını (6 delikli bir plakada kuyu başına 3 mL) 1. Günden 27. Güne kadar her 2 günde bir değiştirin.
    2. Astrosit olgunlaşması
      1. Astrosit olgunlaşma ortamı hazırlayın.
      2. 28. Günde, hücreleri DPBS (1x) (6 kuyucuklu bir plakada kuyu başına 4 mL) ile durulayın ve Astrosit Olgunlaşma Ortamı (6 delikli bir plakada kuyucuk başına 3 mL) ekleyin.
      3. 29. gün ve sonrasında, hücreleri mikroskop altında günlük olarak gözlemleyin ve her 2 günde bir Astrosit Olgunlaşma Ortamını (6 delikli bir plakada kuyu başına 3 mL) değiştirin.
      4. Bir aylık olgunlaşmadan sonra, hücreleri genişletin ve bu aşamadan itibaren kriyoproteksiyon.
        NOT: Bu aşamada, hücre sayısı artacaktır. Hücreleri bölerken, PDL kaplı kapaklar kültürleme için gerekli değildir.

2. İmmünositokimya ve immünofloresan boyama ile hücre karakterizasyonu

  1. Kültür döneminin sonunda, kapakları hücrelerle birlikte 12 delikli bir plakaya aktarın.
    Hücreleri fosfat tamponlu salin (PBS) (1x) ile iki kez durulayın ve RT'de% 4 Paraformaldehit (PFA) (12 delikli bir plakada kuyucuk başına 0.5 mL) içinde 10 dakika boyunca inkübe edin.
    NOT: Sabit numune 2 mL PBS (1x) ile kaplanabilir ve immün boyama için gerekli olana kadar 4 °C'de saklanabilir. PFA toksiktir ve kansere neden olduğundan şüphelenilmektedir. Cilt ve göze maruz kalmayı önleyin ve kimyasal bir duman başlığı altında çalışın.
  2. Hücreleri bloke edin ve geçirgenleştirin ve RT'de 1 saat boyunca PBS (1x),% 0.3 Triton X-100 ve% 10 normal keçi serumu içeren bloke edici tamponla inkübe edin.
  3. 4 °C'de gece boyunca bloke edici tamponda birincil antikorlarla inkübe edin: anti-oktamer bağlayıcı transkripsiyon faktörü 4 (Ekim4) ve anti-evreye özgü embriyonik antijen-4 (SSEA4) ile leke iPSC'ler, anti-cinsiyet belirleyici bölge Y kutusu-2 (Sox2) ve anti-Nestin içeren NSC'ler, anti-eşleştirilmiş kutu-6 (Pax6) ve anti-Nestin içeren nöral küreler, anti-glial fibriler asidik protein (GFAP) ve anti-S100 kalsiyum bağlayıcı protein β (S100β) içeren DA nöronları, anti-β III Tubulin (Tuj 1), anti-Sinaptofizin ve anti-PSD-95 (12 delikli bir plakada kuyucuk başına 0,5 mL birincil antikor çözeltisi; ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakınız).
  4. Numuneleri PBS (1x) ile her biri 10 dakika boyunca üç kez hafifçe sallayarak yıkayın.
  5. İkincil antikor çözeltisi (bloke edici tamponda 1:800, 12 delikli bir plakada kuyucuk başına 0,5 mL Alexa Fluor sekonder antikor çözeltisi) ile RT'de 1 saat boyunca hafifçe sallanarak inkübe edin.
  6. Çekirdekleri etiketlemek için hücreleri PBS'de (1x) Hoechst 33342 (1:5.000, 12 delikli bir plakada kuyu başına 0,5 mL) ile RT'de 15 dakika boyunca inkübe edin.
  7. Karanlıkta floresan mikroskobu altında görüntüleme için hücreleri montaj ortamıyla monte edin ve RT'de gece boyunca kurutun. Mikroskop ayarları ve parametreleri için Ek Şekil S1'e bakınız.

3. Canlı hücrelerde mitokondriyal hacim, MMP ve mitokondriyal ROS'un akış sitometrisi ölçümü

  1. Hücreleri% 50 -% 60 akıcılığa ulaşana kadar 6 delikli bir plakada ayrı ayrı 4 kuyucuk halinde tohumlayın. Bu dört kuyuyu #1, #2, #3 ve #4 olarak etiketleyin.
  2. Kültür periyodunun sonunda, aşağıdaki gibi 5 ayrı boyama çözeltisi (6 delikli bir plakada kuyucuk başına 500 μL) hazırlayın: # 1 sadece kültür ortamı (kontrol için sadece hücreleri içeren kuyu # 1'e); FCCP (100 μM) içeren #2-1; Kültür ortamında FCCP (100 μM) + TMRE (100 nM) + MTG (150 nM) içeren #2-2; Kültür ortamında TMRE (100 nM) + MTG (150 nM) içeren #3; #4, %10 FBS ile PBS'de (1x) MitoSox Red (10 μM) + MTG (150 nM) içerir. Bu bileşikler ve akış sitometrisi kurulumu hakkında ayrıntılar için Şekil 1A, Ek Tablo S2 ve Malzeme Tablosu'na bakın.
    NOT: Boyama çözeltisini hazırlamak için kültür ortamını kullanın. Kullanmadan önce ortamı ve PBS'yi (1x) RT'de ısıtın. FCCP toksiktir; cilt ve göze maruz kalmayı önler ve kimyasal bir duman başlığı altında çalışır.
  3. Ortamı #2 kuyucuğundan aspire edin ve #2-1 çözeltisi ekleyin (yalnızca FCCP). Hücreleri 10 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  4. Ortamı #2 ve #3 kuyularından aspire edin ve #2 kuyucuğuna #2-2 çözeltisi (FCCP + TMRE + MTG) ve #3 koduna #3 çözeltisi (TMRE + MTG) ekleyin. Hücreleri 45 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  5. Ortamı # 4 kuyusundan aspire edin ve # 4 çözeltisi ekleyin (MitoSox Kırmızı + MTG). Hücreleri 15 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  6. Ortamı tüm kuyucuklardan aspire edin. PBS (1x) ile yıkayın (6 delikli bir plakada kuyu başına 4 mL). 5 dakika boyunca 37 ° C'de 1 mL hücre ayrışma reaktifi (6 delikli bir plakada kuyucuk başına 1 mL) kullanarak hücreleri ayırın. Hücre ayrışma reaktifini 1 mL DMEM'de% 10 FBS (6 delikli bir plakada kuyucuk başına 2 mL) ile nötralize edin.
  7. Tüm kuyuların içeriğini 15 mL konik tüplerde toplayın. Tüpleri 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüj yapın. Peletleri PBS (1x) ile bir veya iki kez yıkayın.
  8. Süpernatantları aspire edin, ancak tüplerde yaklaşık 100 μL bırakın. Hücre peletlerini 300 μL PBS (1x) içinde yeniden askıya alın. Hücreleri 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın. RT'de tüpleri karanlıkta tutun.
  9. Bir akış sitometresi kullanarak hücreleri analiz edin (3 mavi ve 1 kırmızı lazer konfigürasyonu ile). 530/30 bandpass filtresi kullanarak filtre 1'de (FL1) MTG'yi, 585/40 bandpass filtresini kullanarak filtre 2'de (FL2) TMRE'yi ve 510/580 bandpass filtresi kullanarak filtre 3'te (FL3) MitoSox Red'i algılayın.

4. Sabit hücrelerde MRC kompleks alt birimlerinin ve TFAM'nin akış sitometrisi ölçümü

  1. Kültür periyodunun sonunda, hücre ayrışma reaktifini ekleyerek hücreleri ayırın (~ 106); Daha sonra, hücreleri 15 mL'lik bir tüpte toplayın ve toplayın. PBS (1x) ile santrifüjleme yaparak hücreleri 5 dakika boyunca 300 × g'de santrifüj yaparak iki kez yıkayın.
  2. Hücreleri RT'de 10 dakika boyunca% 1.6 PFA'da (15 mL'lik bir tüpte 1 mL% 1.6 PFA'nın% 1 mL'si) sabitleyin. PBS (1x) ile santrifüjleme yaparak hücreleri 5 dakika boyunca 300 × g'de santrifüj yaparak iki kez yıkayın.
  3. Hücreleri buz gibi soğuk% 90 metanol (15 mL'lik bir tüpte 1 mL% 90 metanol) ile -20 dakika boyunca -20 ° C'de geçirgenleştirin.
  4. Numuneleri 0.3 M glisin,% 5 keçi serumu ve% 1 sığır serumu albümini (BSA) içeren bloke tamponunda bloke edin - PBS'de Fraksiyon V (1x) (15 mL'lik bir tüpte 1 mL bloke tamponu). Hücreleri PBS (1x) ile iki kez santrifüjleme yaparak yıkayın (adım 3.7'de olduğu gibi).
  5. Hücreleri 30 dakika boyunca aşağıdaki birincil antikorlarla inkübe edin: kompleks I alt biriminin ölçümü için anti-NDUFB10 (1:1.000), kompleks II alt biriminin ölçümü için anti-süksinat dehidrogenaz kompleks flavoprotein alt birimi A (SDHA, 1:1.000) ve kompleks IV alt biriminin ölçümü için anti-COX IV (1:1.000) ve Alexa Fluor 488 (1:400) ile konjuge edilmiş anti-TFAM antikoru. Alexa Fluor 488 (1:400) ile konjuge edilmiş anti-TOMM20 antikoru ile aynı sayıda hücreyi 30 dakika boyunca ayrı ayrı lekeleyin (15 mL'lik bir tüpte 1 mL birincil antikor çözeltisi; antikorlar hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın).
  6. Hücreleri PBS (1x) ile bir kez 300 × g'da santrifüjleme ile 5 dakika boyunca yıkayın. NDUFB10, SDHA ve COX IV tüplerine ikincil antikor (1:400) ekleyin ve hücreleri bu çözeltilerle 30 dakika boyunca inkübe edin.
  7. Hücreleri PBS (1x) ile 5 dakika boyunca 300 × g'de santrifüj yaparak bir kez yıkayın. Süpernatantları aspire edin, tüplerde yaklaşık 100 μL bırakın. Hücre peletlerini 300 μL PBS (1x) içinde yeniden askıya alın. Hücreleri buz üzerinde karanlıkta tutulan 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın.
  8. Akış sitometresindeki hücreleri analiz edin (3 mavi ve 1 kırmızı lazer konfigürasyonu ile). 530/30 bandpass filtresi kullanarak filtre 1'deki (FL1) sinyalleri algılayın. Mikroskop ayarları ve parametreleri için Ek Şekil S2'ye bakınız.

5. Akım sitometrisi edinimi ve analizi

  1. Analiz edilen hücre popülasyonunun boyutuna ve karmaşıklığına bağlı olarak ileri saçılma alanı (FSC-A) ve yan saçılma alanı (SSC-A) saçılma grafiklerini ayarlamak için lekesiz kontrol tüpünü kullanın. Mikroskop ayarları ve parametreleri için Ek Şekil S2'ye bakınız.
    NOT: Tek tek hücre tipleri için lekesiz denetimler ayarlayın.
  2. Pozitif kapıları seçmek için leke olmayan kontrol tüplerini kullanın ve çok renkli akış sitometrisinde MTG (florofor-1 [FL-1]) ve TMRE (FL-2) arasındaki floresan spektral örtüşmesini telafi etmek için tek renkli kontrol tüpleri kullanın. MRC ve TFAM örneklerinde arka plan boyamasını izlemek üzere negatif kontrol için izotip kontrolünü kullanın. FCCP tüpünü TMRE boyama için depolarizasyon kontrolü olarak kullanın.
  3. Canlı hücreleri ve ana geçidi ileri ve yan saçılma grafiğinden seçmek için yabancı kalıntıları kapatın (Şekil 2A). Çiftleri hariç tutmak ve ayrıca bir yan saçılma yüksekliği (SSC-H) ve SSC-A grafiği oluşturmak için ileri dağılım yüksekliği (FSC-H) ve (vs.) FSC-A yoğunluk grafiği kullanarak çiftleri kapatın (Şekil 2A).
  4. Veri toplama (akış sitometresi)
    1. Lekesiz veya izotip örnekleri negatif kontrol olarak kullanarak, SSC-A'yı ve çeşitli filtreleri (FL1, FL2, FL3, FL4) görüntülerken tek hücreli olayların ana popülasyonunun üzerinde bir kapı oluşturun (Şekil 1B ve Şekil 2B).
  5. Veri analizi (CFlow yazılımı)
    1. Kapıların konumunu lekeli hücre örneklerine kopyalayın ve pozitif boyama için pozitif boyanmış hücrelerin miktarını kaydedin.
    2. Her hücre alt popülasyonu için bir histogram grafiği seçin ve farklı filtre kanallarının (FL1, FL2, FL3, FL4) (x ekseni) medyan floresan yoğunluğunu (MFI) analiz edin.
      1. TMRE düzeylerini, aşağıdaki Eq (1)'de olduğu gibi, bir histogramdaki #3 TMRE boyalı örneklerden FL2 MFI'sından FL2 FCCP ile muamele edilmiş hücrelerin FL2 MFI'sından çıkararak hesaplayın.
        TMRE seviyeleri = #3 TMRE boyalı numunelerden FL2'nin MFI'sı - #2 FCCP ile muamele edilmiş hücrelerin FL2'sinin MFI'sı (1)
      2. MMP ve mitokondriyal ROS için spesifik değerleri, mitokondriyal hacim göstergesi MTG'yi bölerek TMRE veya MitoSox Kırmızısı cinsinden MFI ile hesaplayın.
      3. Karmaşık alt birim ve TFAM için özgül değeri, karmaşık ifadede MFI veya TFAM kullanarak mitokondriyal hacim göstergesi TOMM20'yi bölerek hesaplayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Farklılaşma yönteminin ve akış sitometrik stratejilerinin şematik bir açıklaması Şekil 3'te gösterilmiştir. İnsan iPSC'leri nöral rozetlere farklılaştırılır ve daha sonra nöral kürelere farklılaşma için süspansiyon kültürüne kaldırılır. Nöral küreler daha da farklılaşır ve DA nöronlarına olgunlaşır. Nöral küreler, glial astrositler üretmek için tek hücrelere ayrılır, NSC'ler olarak tek katmanlar halinde yeniden kaplanır ve daha sonra astrositlere farklılaştırılır. Bu protokol, MMP, mitokondriyal hacim, mitokondriyal ROS seviyeleri, MRC kompleks alt birimlerinin ekspresyon seviyeleri ve TFAM (göreceli mtDNA kopya sayısının dolaylı bir ölçümü) ölçümü için akış sitometrisi ile numunelerin alınması ve analiz edilmesi için gerekli stratejileri sağlar. Spesifik olarak, floresan muhabirler, TMRE ve MTG ile birlikte boyama, MMP ve mitokondriyal hacimdeki değişiklikleri tespit etmek ve ölçmek için kullanılmıştır. MitoSox Red ve MTG ile birlikte boyama, canlı hücrelerde mitokondriyal ROS üretiminin ölçülmesine izin verir. TOMM20 ile birlikte MRC kompleks alt birimlerine karşı antikorlarla boyama, MRC'nin değerlendirilmesine ve mtDNA kopya sayısının dolaylı olarak değerlendirilmesi için TFAM ve TOMM20'nin boyanmasına izin verir. Önemli olarak, MTG ve TOMM20, mitokondriyal hacmin bu parametreler üzerindeki etkisine karşı koyarak mitokondriyal hacim başına ölçümü sağlar.

DA nöronları, iPSC'lerden çift SMAD inhibisyonu yoluyla üretilir ve Şekil 4A'da gösterildiği gibi FGF-8b ve Sonik kirpi (SHH) agonisti PM'ye maruz kalır. İnsan iPSC'leri, matris kaplı plakalar üzerine iPSC kültür ortamında tohumlanır. Hücreler% 50 -% 80 akıcılığa ulaştığında, ortam 5 gün boyunca SB431542, AMPK inhibitörü, Bileşik C ve N-asetilsistein ile desteklenmiş bir CDM kullanılarak NIM olarak değiştirilir. 5 gün sonra, iPSC'ler (Şekil 4B, a) net nöral rozet yapıları sergileyen nöral epitel aşamasına ilerler (Şekil 4B, b). 5. günde, nöral küreler, nöral epitelin süspansiyon kültürüne kaldırılması ve inkübatörün içindeki bir yörüngesel çalkalayıcı üzerinde NSC SF ortamında kültürlenmesiyle üretilir. Yuvarlak, iyi tanımlanmış küreler Şekil 4B, c'de gösterilmiştir. 7. günde, ortam 100 ng / mL FGF-8b ile desteklenmiş CDM'ye dönüştürülür. 14. günde, ortam 100 ng / mL FGF-8b ve 1 μM PM ile desteklenen CDM'ye dönüştürülür. 21. günde, küreler tek bir tabakada DA nöronlarına ayrıştırılarak ve FKÖ'de 10 ng / mL BDNF ve 10 ng / mL GDNF ve laminin kaplı plakalar / kapaklar ile desteklenmiş CDM'de kültürlenerek ayrıştırılır. 15-30 gün boyunca olgunlaşan nöronlar (Şekil 4B, e) mitokondriyal fonksiyonel ölçümler için daha fazla kullanılır.

NSC'ler, nöral küreleri tek hücrelere ayırarak ve daha sonra astrositler üretmek için bunları tek katmanlar halinde yeniden düzenleyerek üretilir. Bu NSC'ler klasik bir nöral progenitör görünümü göstermektedir (Şekil 4B, d). Bu aşamadaki NSC'ler daha fazla kullanım için kolayca genişletilebilir ve bankaya yatırılabilir. Astrosit farklılaşmasını başlatmak için, NSC'ler NSC SF ortamında PDL kaplı kapak kapakları üzerine kaplanır. Ertesi gün, ortam 28 gün boyunca astrosit farklılaşma ortamına dönüştürülür. 28 gün sonra, farklılaşmış astrositler astrosit olgunlaşma ortamında daha da olgunlaşır. Bu aşamada, astrositler yıldız şeklindeki morfolojiyi göstermelidir (Şekil 4B, f) ve bu hücreler mitokondriyal fonksiyonel değerlendirme de dahil olmak üzere daha fazla kullanım için genişletilebilir ve bankalanabilir.

Farklılaşma sırasında, immünofloresan boyama kullanılarak hücre kimliği doğrulanır. Şekil 5A'da, immün boyama, iPSC'lerin spesifik pluripotent belirteçleri, SSEA4 ve Oct4'ü eksprese ettiğini göstermektedir. Şekil 5B , nöral kürelerin Nestin ve Pax6'nın pozitif boyanmasını sergilediğini gösterirken, Şekil 5C , tek katmanlardaki iPSC türevi NSC'lerin Nestin ve Sox2'nin pozitif boyanmasını sergilediğini göstermektedir. DA nöronlarını tanımlamak için, hücreler nöral belirteç β III Tubulin (Tuj 1) ve DA nöronal belirteci tirozin hidroksilaz (TH) ile boyanır (Şekil 6B). Ek olarak, DA nöronları sinaptik belirteçler, sinaptofizin ve PSD-95 için boyanma göstererek fonksiyonel sinaptik bağlantılarını doğrular (Şekil 5B). iPSC türevi astrositlerin immün boyaması, astrosit belirteçlerinin, glial fibriler asidik proteinin (GFAP) ve S100 kalsiyum bağlayıcı protein β (S100β) ekspresyonunu gösterir.

Diferansiye nöronlarda ve astrositlerde mitokondriyal fonksiyonun flow sitometri kullanılarak incelenmesi, yukarıda protokol bölüm 3 ve 4'te açıklandığı gibi gerçekleştirilir. Şekil 1B'de gösterildiği gibi, veri toplama için bir akış sitometresi ve veri analizi için CFlow Örnekleyici kullanılmıştır.

Şekil 2, canlı tek hücreleri geçit yöntemine göstermektedir. Ölü hücreler ve hücre kalıntıları FSC ve SSC grafiği kullanılarak hariç tutulur (Şekil 2A, a). Hücre çiftleri, FSC-H ve FSC-A grafiği (Şekil 2A, b) ve ardından SSC-H ve SSC-A grafiği (Şekil 2A, c) kullanılarak hariç tutulur. Belirli bir hücre tipinin negatif popülasyonu, aynı hücre tipi içindeki pozitif popülasyonla karşılaştırılırsa, arka plan floresansı uygun şekilde değerlendirilir (Şekil 2B, a). MMP örnekleri için, hücrelerin FCCP ile muamele edilmesi, mitokondriyal membran potansiyeli ve TMRE boyamasından kaynaklanan paraziti ortadan kaldırır (Şekil 2B, b).

Bu akış sitometrik yaklaşımları, mitokondriyal DNA polimeraz, POLG (W748S) katalitik alt biriminde mutasyon (lar) taşıyan insan iPSC'lerinden üretilen DA nöronlarını incelemek ve bunları Detroit 551 fibroblastlarından üretilen hastalıksız örneklerle karşılaştırmak için kullanılmıştır. Daha önce4 olarak bildirildiği gibi, bu çalışma aynı zamanda POLG DA nöronlarında MMP'nin azaldığını ve spesifik mitokondriyal ROS seviyelerinin arttığını göstermiştir (Şekil 7). Bununla birlikte, mitokondriyal hacim, toplam MMP ve toplam mitokondriyal ROS seviyesi değişmedi. Şekil 8'de, sonuçlar spesifik kompleks I seviyelerinde bir azalma, daha düşük toplam ve spesifik TFAM seviyeleri, ancak mutant DA nöronlarında kontrollere kıyasla benzer spesifik kompleks II seviyeleri göstermektedir.

Bu yaklaşım, aynı iPSC hatlarından üretilen astrositleri incelemek için de kullanıldı. Daha önce7'de bildirildiği ve Şekil 9'da gösterildiği gibi, sonuçlar POLG mutasyona uğramış astrositlerin daha düşük toplam ve spesifik MMP'ye sahip olduğunu, ancak kontrollere kıyasla benzer mitokondriyal hacme ve mitokondriyal ROS'a sahip olduğunu ve ayrıca spesifik komplekslerin I ve IV'ün seviyelerinin azaldığını göstermektedir (Şekil 10). Bununla birlikte, kompleks I ve IV'ün toplam seviyelerinde ve POLG astrositlerinde kompleks II'nin toplam ve spesifik seviyelerinde hiçbir değişiklik olmamıştır. Genel olarak, bu veriler, çoklu mitokondriyal parametrelerin akış sitometrik analizinin, iPSC'ler ve bunların nöral ve glial türevleri gibi hücrelerdeki mitokondriyal fonksiyonun değerlendirilmesinde değerli olan ilk adım yaklaşımını sağladığını göstermektedir.

Figure 1
Şekil 1: Akış sitometrisi için kurulum. (A) MMP, mitokondriyal hacim ve mitokondriyal ROS boyaması; (B) Bir C6 akış sitometresinde veri toplama örneği. Kısaltmalar: MMP = mitokondriyal membran potansiyeli; ROS = reaktif oksijen türleri; FCCP = karbonil siyanür p-triflorometoksifenilhidrazon; TMRE = tetrametilrodamin etil ester; MTG = MitoTracker Yeşil. Ayrıca, bkz: Ek Tablo S2. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Geçit stratejileri. (A) Veri toplama; (B) Canlı hücrelerde MTG ve TMRE boyama ile floresan histogramları. Kısaltmalar: SSC-A = yan dağılım alanı; FSC-A = ileri dağılım alanı; SSC-H = yan saçılma yüksekliği; FSC-H = ileri saçılma yüksekliği; FL#-A = florofor # alanı; MTG = MitoTracker Yeşil; FCCP = karbonil siyanür p-triflorometoksifenilhidrazon; TMRE = tetrametilrodamin etil ester. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Protokol iş akışının şematik gösterimi. Kısaltmalar: DA = dopaminerjik; MMP = mitokondriyal membran potansiyeli; ROS = reaktif oksijen türleri; NDUFB 10 = NADH: Ubikinon oksidoredüktaz alt birimi 10; SDHA = süksinat dehidrogenaz kompleksi flavoprotein alt birimi A; COX IV = sitokrom c oksidaz kompleksi IV; mtDNA = mitokondriyal DNA; TFAM = mitokondriyal transkripsiyon faktörü A. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: iPSC farklılaşması. (A) Akış şeması ve (B) iPSC'ler (a), nöral rozet (b), nöral küreler (c), NSC'ler (d), DA nöronları (e) ve astrositler (f) dahil olmak üzere farklılaşma sırasında farklı aşamalardan hücreler için temsili görüntüler. Ölçek çubukları = 25 μm. Kısaltmalar: iPSC = indüklenmiş pluripotent kök hücre; NSC = nöral kök hücre; DA = dopaminerjik; SFM = serumsuz ortam; CDM = kimyasal olarak tanımlanmış ortam; FGF-8b = fibroblast büyüme faktörü-8b; PM = purmorfamin; BDNF = beyin kaynaklı nörotrofik faktör; GDNF = glial hücre hattı kaynaklı nörotrofik faktör; FKÖ = poli-L-ornitin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: iPSC'lerin ve nöral türevlerinin temsili konfokal görüntüleri . (A) iPSC'lerde SSEA4 (kırmızı) ve Oct4'ün (yeşil) immün boyaması. (B) iPSC türevi nöron kürelerinde Nestin (kırmızı) ve Pax6'nın (yeşil) immün boyaması. (C) iPSC türevi NSC'lerde Nestin (kırmızı) ve Sox2'nin (yeşil) immün boyaması. Çekirdekler DAPI (mavi) ile boyanır. Ölçek çubukları = 50 μm. Kısaltmalar: iPSC'ler = indüklenmiş pluripotent kök hücreler; NSC'ler = nöral kök hücreler; SSEA4 = evreye özgü embriyonik antijen-4; Ok4 = oktamer bağlayıcı transkripsiyon faktörü 4; Pax6 = eşleştirilmiş kutu-6; Sox2 = cinsiyet belirleyici bölge Y kutu-2; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: iPSC türevi astrositlerin ve DA nöronlarının temsili konfokal görüntüleri. (A) iPSC türevi astrositlerde GFAP (kırmızı) ve S100β'nin (yeşil) immün boyaması. (B) iPSC türevi DA nöronlarında nöral soy belirteci TH (yeşil), Tuj 1 (kırmızı) ve nöral fonksiyonel belirteç Sinaptofizin (yeşil) ve PSD-95'in (kırmızı) immün boyanması. Çekirdekler DAPI (mavi) ile boyanır. Ölçek çubukları = 25 μm. Kısaltmalar: iPSC'ler = indüklenmiş pluripotent kök hücreler; GFAP = glial fibriler asidik protein; S100β = S100 kalsiyum bağlayıcı protein β; Tuj 1 = β III Tubulin; PSD-95 = postsinaptik yoğunluk proteini 95; DA = dopaminerjik; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 7
Şekil 7: POLG hasta iPSC'lerinin bir klonundan ve Detroit 551 kontrol iPSC'lerinin bir klonundan türetilen DA nöronları için akış sitometrik analizi. (A) MTG ile ölçülen mitokondriyal hacim, (B) TMRE ile ölçülen toplam MMP, (C) toplam TMRE / MTG ile hesaplanan spesifik MMP seviyesi, (D) MitoSox Red tarafından ölçülen toplam mitokondriyal ROS ve (E ) toplam MitoSox Kırmızı / MTG ile hesaplanan spesifik mitokondriyal ROS seviyesi. Veriler, örnek sayısı için ortalamanın (SEM) ortalama ± standart hatası (SEM) olarak sunulmuştur (klon başına n ≥ 3). Veriler GraphPad Prism yazılımı kullanılarak analiz edildi ve üretildi. Değişkenlerin istatistiksel anlamlılığını değerlendirmek için Mann-Whitney U testi kullanıldı. P < 0.05 için anlamlılık belirtilir. *P < 0,05; ns, önemli değil. Kısaltmalar: DA = dopaminerjik; POLG = DNA polimeraz alt birim gama; iPSC'ler = indüklenmiş pluripotent kök hücreler; MMP = mitokondriyal membran potansiyeli; ROS = reaktif oksijen türleri; MTG = MitoTracker Yeşil; TMRE = tetrametilrodamin etil ester. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 8
Şekil 8: POLG hasta iPSC'lerinin bir klonundan ve Detroit 551 kontrol iPSC'lerinin bir klonundan türetilen astrositler için akış sitometrik analizi. (A) MTG ile ölçülen mitokondriyal hacim, (B) TMRE ile ölçülen toplam MMP, (C) toplam TMRE / MTG ile hesaplanan spesifik MMP seviyesi, (D) MitoSox Red tarafından ölçülen toplam Rmitokondriyal ROS S ve (E ) toplam MitoSox Kırmızı / MTG ile hesaplanan spesifik mitokondriyal ROS seviyesi. Veriler, örnek sayısı için ortalamanın (SEM) ortalama ± standart hatası (SEM) olarak sunulmuştur (klon başına n ≥ 3). Veriler GraphPad Prism yazılımı kullanılarak analiz edildi ve üretildi. Değişkenlerin istatistiksel anlamlılığını değerlendirmek için Mann-Whitney U testi kullanıldı. P < 0.05 için anlamlılık belirtilir. *P < 0,05; ns, önemli değil. Kısaltmalar: POLG = DNA polimeraz alt birim gama; iPSC = indüklenmiş pluripotent kök hücre; MMP = mitokondriyal membran potansiyeli; ROS = reaktif oksijen türleri; MTG = MitoTracker Yeşil; TMRE = tetrametilrodamin etil ester. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 9
Şekil 9: POLG hasta iPSC'lerinin bir klonundan ve Detroit 551 kontrol iPSC'lerinin bir klonundan türetilen DA nöronları için akış sitometrik analizi. (A) NDUFB10 ile ölçülen toplam kompleks I, (B) toplam NDUFB10/TOMM20 ile hesaplanan spesifik kompleks I seviyesi, (C) SDHA ile ölçülen toplam kompleks II, (D) toplam SDHA/TOMM20 ile hesaplanan spesifik kompleks II seviyesi, (E) TFAM ile ölçülen toplam TFAM ve (F) toplam TFAM/TOMM20 ile hesaplanan spesifik TFAM seviyesi. Ortalama ± örnek sayısı için ortalamanın standart hatası (SEM) olarak sunulan veriler (klon başına n ≥ 3). Veriler GraphPad Prism yazılımı kullanılarak analiz edildi ve üretildi. Mann-Whitney U testi, değişkenlerin istatistiksel anlamlılığını değerlendirmek için kullanılmıştır. P < 0.05 için anlamlılık belirtilir. *P < 0,05; ns, önemli değil. Kısaltmalar: DA = dopaminerjik; POLG = DNA polimeraz alt birim gama; iPSC = indüklenmiş pluripotent kök hücre; NDUFB10 = NADH: Ubikinon oksidoredüktaz alt birimi 10; TOMM20 = dış mitokondriyal membran 20'nin translokazı; SDHA = süksinat dehidrogenaz kompleksi flavoprotein alt birimi A; TFAM = mitokondriyal transkripsiyon faktörü A. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 10
Şekil 10: POLG hasta iPSC'lerinin bir klonundan ve Detroit 551 kontrol iPSC'lerinin bir klonundan türetilen astrositler için akış sitometrik analizi. (A) NDUFB10 ile ölçülen toplam kompleks I, (B) toplam NDUFB10 / TOMM20 ile hesaplanan spesifik kompleks I seviyesi, (C) SDHA tarafından ölçülen toplam kompleks II, (D) toplam SDHA / TOMM20 ile hesaplanan spesifik kompleks II seviyesi, (E) COX IV ile ölçülen toplam kompleks IV, (F) COX IV/TOMM20 ile hesaplanan spesifik kompleks IV seviyesi, (G) TFAM ile ölçülen toplam TFAM ve (H) toplam TFAM/TOMM20 ile hesaplanan spesifik TFAM seviyesi. Ortalama ± örnek sayısı için ortalamanın standart hatası (SEM) olarak sunulan veriler (klon başına n ≥ 3). Veriler GraphPad Prism yazılımı kullanılarak analiz edildi ve üretildi. Değişkenlerin istatistiksel anlamlılığını değerlendirmek için Mann-Whitney U testi kullanıldı. P < 0.05 için anlamlılık belirtilir. *P < 0,05; ** P < 0,01; ns, önemli değil. Kısaltmalar: POLG = DNA polimeraz alt birim gama; iPSC = indüklenmiş pluripotent kök hücre; NDUFB10 = NADH: Ubikinon oksidoredüktaz alt birimi 10; TOMM20 = dış mitokondriyal membran 20'nin translokazı; SDHA = süksinat dehidrogenaz kompleksi flavoprotein alt birimi A; TFAM = mitokondriyal transkripsiyon faktörü A; COX IV = sitokrom c oksidaz kompleksi IV. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S1: Konfokal lazer taramalı floresan mikroskobun ayarları ve görüntü alma adımları. (A) Yapılandırma aracını seçin ve Mevcut mevcut lazerden doğru lazer türünü seçin ve gücünü ayarlayın. (B) Edinme-Edinme Modu-SEQ'u seçin ve veritabanından ilgili floresan dalga boyu fotoğraf modunu seçin. (C) Sıralı Tarama-Yükleme'yi seçin ve ilgili modu içe aktarın. (D) 40x objektif lensi seçin ve damla yönünde ekleyin. (E) Farklı dalga boylarında fotoğraf çekmek için özel ayar parametreleri. (F) Fotoğraf parametrelerini ayarlayın, fotoğrafı önizleyin ve kaydedin. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil S2: Akış sitometrisi için adımlar ve ayarlar. (A) Cflow yazılımını açın, Dosya aracını seçin ve CFlow dosyasını veya şablonunu aç'ı seçin. (B) 40000 etkinlik ayarlayın ve Çalıştırma Sınırları panelinde yalnızca canlı tek hücreleri içeren geçidi seçin. Fluidics panelinde Orta hız'ı seçin. (C) Ana geçidi ayarlamak için FSC-A ve FSC-A grafiğini (a) seçin. Çiftleri hariç tutmak için FSC-A ile FSC-H grafiğini (b) ve SSC-A ile SSC-H grafiğini (c) seçin. FL1 veya FL2 gibi ilgili filtreleri seçin ve lekesiz hücreleri çalıştırırken pozitif olayları çizmek için FL1-A ile FSC-A grafiği (d) veya FL2-A ile FSC-A grafiğini kullanın. (D) Aynı parametreleri ayarlayın, önizleme, lekeli örnekleri çalıştırın ve fotoğrafı kaydedin. Ayrıca, bkz: Ek Tablo S2. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Tablo S1: Medya ve çözüm tarifleri. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Tablo S2: Akış sitometrik boyama için kurulum. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada, iPSC kaynaklı nöronlar ve astrositler üretmek ve akış sitometrisi kullanarak mitokondriyal fonksiyonun birçok yönünü değerlendirmek için protokoller bulunmaktadır. Bu protokoller, insan iPSC'lerinin hem nöronlara hem de glial astrositlere verimli bir şekilde dönüştürülmesine ve çoğunlukla canlı hücrelerde mitokondriyal fonksiyonun ayrıntılı karakterizasyonuna izin verir. Protokoller ayrıca, canlı hücrelerde hacim, MMP ve mitokondriyal ROS seviyeleri ve MRC kompleksleri ve sabit hücrelerde TFAM dahil olmak üzere çoklu mitokondriyal fonksiyonları elde etmek ve analiz etmek için birlikte boyama akışı sitometrisine dayalı bir strateji sağlar. Spesifik olarak, bu protokoller mitokondriyal hacim başına hem toplam hem de spesifik seviyelerin tahmin edilmesine izin verir. Bu strateji, DA nöronlarında ve astrositlerde bilinen bir mitokondriyal hastalıkta (POLG) mitokondriyal disfonksiyonu tespit ederken, bu teknikler her türlü hücre ve hastalığa uygulanabilir. Ayrıca, protokol sağlam ve tekrarlanabilir. Önceki birkaç çalışma, fibroblastlar, iPSC'ler, NSC'ler, DA nöronları ve astrositler 2,3,13,17'deki mitokondriyal değişiklikleri analiz etmek için bu protokolü başarıyla uygulamıştır.

Bu protokolü uygularken göz önünde bulundurulması gereken bazı kritik noktalar vardır. Tutarlı ve yüksek verimli farklılaşmayı sağlamak için, dönüşümü yüksek kaliteli iPSC'lerle (% <5 farklılaşmış hücreler içeren hücreler) başlatmak çok önemlidir. Ticari olarak temin edilebilen diğer tanımlanmış medya geçerli alternatifler olsa da, bu çalışma alternatifleri ele almamıştır. iPSC hatlarının orta bileşim ve klonal farklılıkları hem başlangıç hücresi popülasyonunun çoğalmasını hem de farklılaşma verimliliğini etkileyebileceğinden, bu protokolün diğer bakım ortamlarına uyarlanması muhtemelen optimizasyon gerektirecektir.

MTG ve MMP floresan arasındaki ilişki daha önce incelenmiştir3. MTG floresansının hem18'den bağımsız hem de MMP 19,20'ye duyarlı olduğu bildirildiği için bu önemlidir. İPSC'lerin farklı TMRE konsantrasyonları ile titre edildiği ve 150 nM MTG ile birlikte boyandığı önceki çalışmalarda, MTG seviyesi daha düşük TMRE konsantrasyonlarında (5-100 nM) aynı kalırken, daha yüksek TMRE konsantrasyonları (100 nM'nin üzerinde) için azalmış bir MTG sinyali gözlenmiştir. Bu nedenle, spesifik MMP'yi ölçmek için 100 nM TMRE ve 150 nM MTG seçildi. Bu ilişki hücreye özgü olabileceğinden, MMP'yi ölçmek için MTG ve TMRE ikili boyama kullanılmadan önce MTG ve MMP floresansı arasındaki korelasyon değerlendirilmelidir.

Hücre yoğunluğu ayrıca mitokondriyal fonksiyonu ve hücre metabolizmasını da etkileyebilir. Bu çalışmada, MMP'de hücre yoğunluğuna bağlı değişiklikler gözlenmiştir, bu da diğer çalışmalarda gösterilmiştir21. Bu nedenle, farklı hücre tipleri için ko-boyama protokolünü oluştururken varyasyonu en aza indirmek için tüm örneklerde benzer bir hücre yoğunluğu seçmek önemlidir - çok yüksek veya düşük değil. Diğer mikroskopi tabanlı tahlillerle karşılaştırıldığında, akış sitometrisi, çok sayıda hücreyi analiz ederken hız ve tekrarlanabilirlik avantajlarına sahiptir. Mikroskobik görüntülerin analizinde, araştırmacıların önyargısı sonuçları bir dereceye kadar çarpıtacaktır, bu da akış sitometrisi kullanılırken bir sorun değildir. Ek olarak, akış sitometrisi analizi bir milyondan az hücre gerektirir ve bir numunenin analizi sadece birkaç dakika sürer, bu da düzinelerce numunenin 1-2 saat içinde analiz edilebileceği anlamına gelir. Bu teknik, diğer nörodejeneratif hastalıklardan olanlar da dahil olmak üzere çok çeşitli hücre tiplerine de uygulanabilir ve bu nedenle mekanizmaları anlamak ve farklı nörodejeneratif hastalıklarda potansiyel terapötikleri test etmek için yararlı olmalıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgments

Norveç'teki Bergen Üniversitesi'ndeki Moleküler Görüntüleme Merkezi ve Akış Sitometrisi Çekirdek Tesisi'ne teşekkür ederiz. Bu çalışma, Norveç Araştırma Konseyi (Hibe numarası: 229652), Rakel og Otto Kr.Bruuns legat ve Çin Burs Konseyi (proje numarası: 201906220275) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-Oct4 Abcam ab19857, RRID:AB_445175 Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-SSEA4 Abcam ab16287, RRID:AB_778073 Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody.
anti-Sox2 Abcam ab97959, RRID:AB_2341193 Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-Pax6 Abcam ab5790, RRID:AB_305110 Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-Nestin Santa Cruz Biotechnology sc-23927, RRID:AB_627994 Primary Antibody; use as 1:50, 20 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody.
anti-GFAP Abcam ab4674, RRID:AB_304558 Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution;  use Alexa Fluor ® 594 goat anti-chicken IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11042) as secondary antibody.
anti-S100β  conjugated with Alexa Fluor 488 Abcam ab196442, RRID:AB_2722596 Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution;
anti-TH Abcam ab75875, RRID:AB_1310786 Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-Tuj 1 Abcam ab78078, RRID:AB_2256751 Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody.
anti-Synaptophysin Abcam ab32127, RRID:AB_2286949 Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-PSD-95 Abcam ab2723, RRID:AB_303248 Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution;  use Alexa Fluor ® 594 goat anti-chicken IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11042) as secondary antibody.
anti-TFAM conjugated with Alexa Fluor 488 Abcam ab198308 Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; use mouse monoclonal IgG2b  Alexa Fluor® 488 as an isotype control.
anti-TOMM20 conjugated with Alexa Fluor 488 Santa Cruz Biotechnology Cat# sc-17764 RRID:AB_628381 Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; use mouse monoclonal IgG2a  Alexa Fluor® 488 as an isotype control.
anti-NDUFB10 Abcam ab196019 Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody; use rabbit monoclonal IgG as an isotype control.
anti-SDHA Abcam ab137040 Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution;  use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody; use rabbit monoclonal IgG as an isotype control.
anti-COX IV Abcam ab14744, RRID:AB_301443 Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use  Alexa Fluor ® 488 goat anti-mouse IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11001) as secondary antibody; use mouse monoclonal IgG as an isotype control.
Activin A PeproTech 120-14E Astrocyte differentiation medium ingredient
ABM Basal Medium Lonza CC-3187 Basal medium for astrocyte culture
AGM SingleQuots Supplement Pack Lonza CC-4123 Supplement for astrocyte culture
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific 15240062 CDM ingredient
Advanced DMEM/F-12 Thermo Fisher Scientific 12634010 Basal medium for dilute Geltrex
Bovine Serum Albumin Europa Bioproducts EQBAH62-1000 Blocking agent to prevent non-specific binding of antibodies in immunostaining assays and CDM ingredient
BDNF PeproTech 450-02 DA neurons medium ingredient
B-27 Supplement Thermo Fisher Scientific 17504044 Astrocyte differentiation medium ingredient
BD Accuri C6 Plus Flow Cytometer BD Biosciences, USA
Chemically Defined Lipid Concentrate Thermo Fisher Scientific 11905031 CDM ingredient
Collagenase IV Thermo Fisher Scientific 17104019 Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
CCD Microscope Camera Leica DFC3000 G Leica Microsystems, Germany
Corning non-treated culture dishes Sigma-Aldrich CLS430589 Suspension culture
DPBS Thermo Fisher Scientific 14190250 Used for a variety of cell culture wash
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement Thermo Fisher Scientific 10565018 Astrocyte differentiation basal Medium
EDTA Thermo Fisher Scientific 15575020 Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
Essential 8 Basal Medium Thermo Fisher Scientific A1516901 Basal medium for iPSC culture
Essential 8 Supplement (50X) Thermo Fisher Scientific A1517101 Supplement for iPSC culture
EGF Recombinant Human Protein Thermo Fisher Scientific PHG0314 Supplement for NSC culture
FGF-basic (AA 10–155) Recombinant Human Protein Thermo Fisher Scientific PHG0024 Supplement for NSC culture
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich 12103C Medium ingredient
FGF-basic PeproTech 100-18B Astrocyte differentiation medium ingredient
FCCP Abcam ab120081 Eliminates mitochondrial membrane potential and TMRE staining
Fluid aspiration system BVC control Vacuubrand, Germany
Formaldehyde (PFA) 16% Thermo Fisher Scientific 28908 Cell fixation
Geltrex Thermo Fisher Scientific A1413302 Used for attachment and maintenance of human iPSCs
GlutaMAX Supplement Thermo Fisher Scientific 35050061 Supplement for NSC culture
GDNF Peprotech 450-10 DA neurons medium ingredient
Glycine Sigma-Aldrich G8898 Used for blocking buffer
Ham's F-12 Nutrient Mix Thermo Fisher Scientific 31765027 Basal medium for CDM
Heregulin beta-1 human Sigma-Aldrich SRP3055 Astrocyte differentiation medium ingredient
Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific H1399 Stain the nuclei for confocal image
Heracell 150i CO2 Incubators Fisher Scientific, USA
IMDM Thermo Fisher Scientific 21980032 Basal medium for CDM
Insulin Roche 1376497 CDM ingredient
InSolution AMPK Inhibitor Sigma-Aldrich 171261 Neural induction medium ingredient
Insulin-like Growth Factor-I human Sigma-Aldrich I3769 Astrocyte differentiation medium ingredient
KnockOut DMEM/F-12 medium Thermo Fisher Scientific 12660012 Basal medium for NSC culture
Laminin Sigma-Aldrich L2020 Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Leica TCS SP8 STED confocal microscope Leica Microsystems, Germany
Monothioglycerol Sigma-Aldrich M6145 CDM ingredient
MitoTracker Green FM Thermo Fisher Scientific M7514 Used for mitochondrial volume indicator
MitoSox Red Thermo Fisher Scientific M36008 Used for mitochondrial ROS indicator
N-Acetyl-L-cysteine Sigma-Aldrich A7250 Neural induction medium ingredient
N-2 Supplement Thermo Fisher Scientific 17502048 Astrocyte differentiation medium ingredient
Normal goat serum Thermo Fisher Scientific PCN5000 Used for blocking buffer
Orbital shakers - SSM1 Stuart Equipment, UK
Poly-L-ornithine solution Sigma-Aldrich P4957 Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma-Aldrich P7405 Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Purmorphamine STEMCELL Technologies 72204 Promotes DA neuron differentiation
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36930 Mounting the coverslip for confocal image
PBS 1x Thermo Fisher Scientific 18912014 Used for a variety of wash
Recombinant Human/Mouse FGF-8b Protein R&D Systems 423-F8-025/CF Promotes DA neuron differentiation
SB 431542 Tocris Bioscience TB1614-GMP Neural Induction Medium ingredient
StemPro Neural Supplement Thermo Fisher Scientific A10508-01 Supplement for NSCs culture
TrypLE Express Enzyme Thermo Fisher Scientific 12604013 Cell dissociation reagent
Transferrin Roche 652202 CDM ingredient
TRITON X-100 VWR International 9002-93-1 Used for cells permeabilization in immunostaining assays
TMRE Abcam ab113852 Used for mitochondrial membrane potential staining
Water Bath Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant Instruments Grant Instruments, USA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, Y., Xu, E., Musich, P. R., Lin, F. Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases and the potential countermeasure. CNS Neuroscience & Therapeutics. 25 (7), 816-824 (2019).
  2. Chen, A., et al. Nicotinamide riboside and metformin ameliorate mitophagy defect in induced pluripotent stem cell-derived astrocytes with POLG mutations. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 737304 (2021).
  3. Liang, K. X., et al. Disease-specific phenotypes in iPSC-derived neural stem cells with POLG mutations. EMBO Molecular Medicine. 12 (10), 12146 (2020).
  4. Chen, H., Chan, D. C. Mitochondrial dynamics--fusion, fission, movement, and mitophagy--in neurodegenerative diseases. Human Molecular Genetics. 18, 169-176 (2009).
  5. Lin, M. T., Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).
  6. Singh, A., Kukreti, R., Saso, L., Kukreti, S. Oxidative stress: A key modulator in neurodegenerative diseases. Molecules. 24 (8), Basel, Switzerland. 1583 (2019).
  7. Kondadi, A. K., Anand, R., Reichert, A. S. Functional interplay between cristae biogenesis, mitochondrial dynamics and mitochondrial DNA integrity. International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 4311 (2019).
  8. Sterneckert, J. L., Reinhardt, P., Schöler, H. R. Investigating human disease using stem cell models. Nature Reviews. Genetics. 15 (9), 625-639 (2014).
  9. Patani, R. Human stem cell models of disease and the prognosis of academic medicine. Nature Medicine. 26 (4), 449 (2020).
  10. Liang, K. X., et al. N-acetylcysteine amide ameliorates mitochondrial dysfunction and reduces oxidative stress in hiPSC-derived dopaminergic neurons with POLG mutation. Experimental Neurology. , 337 (2021).
  11. Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
  12. Juopperi, T. A., et al. Astrocytes generated from patient induced pluripotent stem cells recapitulate features of Huntington's disease patient cells. Molecular Brain. 5, 17 (2012).
  13. Liang, K. X., et al. Stem cell derived astrocytes with POLG mutations and mitochondrial dysfunction including abnormal NAD+ metabolism is toxic for neurons. bioRxiv. , (2020).
  14. Liu, Q., et al. Human neural crest stem cells derived from human ESCs and induced pluripotent stem cells: induction, maintenance, and differentiation into functional schwann cells. Stem Cells Translational Medicine. 1 (4), 266-278 (2012).
  15. Hong, Y. J., Do, J. T. Neural lineage differentiation from pluripotent stem cells to mimic human brain tissues. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 400 (2019).
  16. Lundin, A., et al. Human iPS-derived astroglia from a stable neural precursor state show improved functionality compared with conventional astrocytic models. Stem Cell Reports. 10 (3), 1030-1045 (2018).
  17. Liang, K. X., et al. N-acetylcysteine amide ameliorates mitochondrial dysfunction and reduces oxidative stress in hiPSC-derived dopaminergic neurons with POLG mutation. Experimental Neurology. 337, 113536 (2021).
  18. Pendergrass, W., Wolf, N., Poot, M. Efficacy of MitoTracker Green™ and CMXrosamine to measure changes in mitochondrial membrane potentials in living cells and tissues. Cytometry. Part A. 61 (2), 162-169 (2004).
  19. Keij, J. F., Bell-Prince, C., Steinkamp, J. A. Staining of mitochondrial membranes with 10-nonyl acridine orange, MitoFluor Green, and MitoTracker Green is affected by mitochondrial membrane potential altering drugs. Cytometry. 39 (3), 203-210 (2000).
  20. Buckman, J. F., et al. MitoTracker labeling in primary neuronal and astrocytic cultures: influence of mitochondrial membrane potential and oxidants. Journal of Neuroscience Methods. 104 (2), 165-176 (2001).
  21. Zanchetta, L. M., Kirk, D., Lyng, F., Walsh, J., Murphy, J. E. Cell-density-dependent changes in mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species production in human skin cells post sunlight exposure. Photodermatology, Photoimmunology & Photomedicine. 26 (6), 311-317 (2010).

Tags

Nörobilim Sayı 177
İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerde Multipl Mitokondriyal Parametrelerin ve Nöral ve Glial Türevlerinin Akış Sitometrik Analizi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liang, K. X., Chen, A., Kristiansen, … More

Liang, K. X., Chen, A., Kristiansen, C. K., Bindoff, L. A. Flow Cytometric Analysis of Multiple Mitochondrial Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cells and Their Neural and Glial Derivatives. J. Vis. Exp. (177), e63116, doi:10.3791/63116 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter