عزل خلايا العضلات الملساء الأبهرية الأولية الخاصة بالمريض وقياسات الانقباض شبه الكمية في الوقت الفعلي في المختبر
Summary
تصف هذه الورقة طريقة قائمة على زراعة الإكسبولوجيا لعزل وزراعة خلايا العضلات الملساء الأبهرية البشرية الأولية الخاصة بالمريض والخلايا الليفية الجلدية. علاوة على ذلك ، يتم تقديم طريقة جديدة لقياس تقلص الخلايا والتحليل اللاحق ، والتي يمكن استخدامها لدراسة الاختلافات الخاصة بالمريض في هذه الخلايا.
Abstract
خلايا العضلات الملساء (SMCs) هي نوع الخلايا السائد في الوسط الأبهري. آلياتهم الانقباضية مهمة لنقل القوة في الشريان الأورطي وتنظم تضيق الأوعية وتوسع الأوعية. ترتبط الطفرات في الجينات المشفرة لبروتينات جهاز الانقباض SMC بأمراض الأبهر ، مثل تمدد الأوعية الدموية الأبهري الصدري. يعد قياس انكماش SMC في المختبر أمرا صعبا ، خاصة بطريقة عالية الإنتاجية ، وهو أمر ضروري لفحص مواد المرضى. الطرق المتاحة حاليا ليست مناسبة لهذا الغرض. تقدم هذه الورقة طريقة جديدة تعتمد على استشعار مقاومة الخلايا الكهربائية والركيزة (ECIS). أولا ، يتم وصف بروتوكول explant لعزل SMCs البشرية الأولية الخاصة بالمريض من خزعات الأبهر والخلايا الليفية الجلدية الأولية البشرية الخاصة بالمريض لدراسة تمدد الأوعية الدموية الأبهري. بعد ذلك ، يتم تقديم وصف مفصل لطريقة انكماش جديدة لقياس الاستجابة الانقباضية لهذه الخلايا ، بما في ذلك التحليل اللاحق والاقتراح لمقارنة المجموعات المختلفة. يمكن استخدام هذه الطريقة لدراسة تقلص الخلايا الملتصقة في سياق الدراسات الانتقالية (القلبية الوعائية) ودراسات فحص المرضى والأدوية.
Introduction
خلايا العضلات الملساء (SMCs) هي نوع الخلايا السائد في الطبقة الإنسية الأبهرية، وهي الطبقة الأكثر سمكا في الشريان الأورطي. داخل الجدار ، يتم توجيهها شعاعيا وتشارك ، من بين وظائف أخرى ، في تضيق الأوعية وتوسيع الأوعية1. تشارك آلية الانقباض SMC في نقل القوة في الشريان الأورطي من خلال الرابط الوظيفي مع المصفوفة خارج الخلية2. ترتبط الطفرات في الجينات المشفرة لبروتينات جهاز انقباض SMC ، مثل سلسلة الميوسين الثقيلة للعضلات الملساء (MYH11) والأكتين العضلي الأملس (ACTA2) ، بحالات تمدد الأوعية الدموية الأبهري الصدري العائلي ، مما يؤكد أهمية تقلص SMC في الحفاظ على السلامة الهيكلية والوظيفية للشريان الأورطي 1,2 . علاوة على ذلك ، ترتبط الطفرات في مسار إشارات TGFβ أيضا بتمدد الأوعية الدموية الأبهري ، ويمكن أيضا دراسة آثارها في الفيزيولوجيا المرضية لتمدد الأوعية الدموية الأبهري في الخلايا الليفية الجلدية3.
يعد قياس الإنتاجية العالية لانكماش SMC في المختبر تحديا. نظرا لأنه لا يمكن قياس انقباض SMC في الجسم الحي لدى البشر ، فإن الفحوصات المخبرية على الخلايا البشرية تقدم بديلا ممكنا. علاوة على ذلك ، فإن تطور تمدد الأوعية الدموية الأبهري البطني (AAA) في النماذج الحيوانية إما مستحث كيميائيا عن طريق ، على سبيل المثال ، تروية الإيلاستاز ، أو ناجم عن طفرة محددة. لذلك ، لا يمكن مقارنة البيانات الحيوانية بتطور AAA في البشر ، والذي له في الغالب سبب متعدد العوامل ، مثل التدخين والعمر و / أو تصلب الشرايين. في المختبر تم قياس انقباض SMC حتى الآن بشكل رئيسي بواسطة الفحص المجهري لقوة الجر 4,5 ، وتحديد كمية تدفقات الكالسيوم داخل الخلايا Fura-2 الفلورية6 ، ومقايسات تجاعيد الكولاجين7. في حين أن الفحص المجهري لقوة الجر يوفر رؤية رقمية لا تقدر بثمن للقوى الناتجة عن خلية واحدة ، إلا أنه غير مناسب للفحص عالي الإنتاجية بسبب معالجة البيانات الرياضية المعقدة وتحليل خلية واحدة في كل مرة ، مما يعني أنه يستغرق وقتا طويلا جدا لقياس عدد تمثيلي من الخلايا لكل متبرع. تسمح اختبارات تجاعيد صبغة Fura-2 والكولاجين بالتحديد السطحي للانكماش ولا تعطي مخرجات رقمية دقيقة ، مما يجعلها أقل ملاءمة للتمييز بين الاختلافات الخاصة بالمريض. تم إثبات ضعف تقلص SMC في الخلايا المشتقة من الشريان الأورطي لمرضى تمدد الأوعية الدموية الأبهري البطني لأول مرة من خلال تحسين طريقة جديدة لقياس تقلص SMC في المختبر8. وقد تم ذلك عن طريق إعادة استخدام طريقة استشعار مقاومة الخلايا الكهربائية (ECIS). ECIS هو اختبار متوسط الإنتاجية في الوقت الفعلي لتحديد حجم سلوك الخلايا الملتصقة وانكماشها9،10،11 مثل نمو SMC والسلوك في فحوصات التئام الجروح والهجرة 12،13،14. يتم وصف الطريقة الدقيقة في قسم البروتوكول. بهذه الطريقة المحسنة ، يمكن أيضا استخدام ECIS لدراسة تقلص الخلايا الليفية بسبب حجمها ومورفولوجيتها المتشابهة.
الهدف من هذه الورقة هو تقديم وصف تدريجي لطريقة قياس انكماش SMC في المختبر باستخدام ECIS8 ومقارنة الانكماش بين SMCs الضابطة والمريضة. أولا ، يتم شرح عزل وزراعة SMCs الأولية من خزعات الأبهر الضابطة والمريض ، والتي يمكن استخدامها لقياس الانقباض. ثانيا ، يتم وصف قياسات وتحليل الانكماش ، إلى جانب التحقق من تعبير علامة SMC. علاوة على ذلك ، تصف هذه الورقة طريقة عزل الخلايا الليفية الجلدية الخاصة بالمريض والتي يمكن قياس تقلصها باستخدام نفس المنهجية. يمكن استخدام هذه الخلايا للدراسات الخاصة بالمريض التي تركز على تمدد الأوعية الدموية الأبهري أو أمراض القلب والأوعية الدموية الأخرى15 أو الدراسات التنبؤية باستخدام بروتوكول التمايز الذي يسمح بقياس الانقباض قبل جراحة تمدد الأوعية الدموية16.
Protocol
Representative Results
Discussion
تقدم هذه الورقة طريقة لقياس انكماش SMC في المختبر ، بناء على التغيرات في المعاوقة واحتلال السطح. أولا ، يتم وصف عزل وزراعة وتوسيع SMCs البشرية الأولية الخاصة بالمريض والخلايا الليفية الجلدية ، تليها كيفية استخدامها لقياسات الانقباض.
يرتبط أحد قيود الدراسة بالحصول على ال?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نعرب عن امتناننا لتارا فان ميرينبوير ، وألبرت فان ويك ، ويولاندا فان دير فيلدن ، وجان د. بلانكنشتيجن ، ولان تران ، وبيتر ل. هورديك ، وفريق PAREL-AAA ، وجميع جراحي الأوعية الدموية في أمستردام UMC ، و Zaans Medisch Centrum ، ومستشفى Dijklander لتوفير المواد والدعم لهذه الدراسة.
Materials
| 96-well Array | Applied Biophysics | 96W10idf PET | Array used to measure contraction in the ECIS setup |
| Custodiol | Dr. Franz Höhler Chemie GmbH | RVG 12801 | Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | Solution used to dilute ionomycin |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140079 | Addition to cell culture medium |
| Ham's F-10 Nutrient Mix | Gibco | 11550043 | Medium used to culture skin fibroblasts |
| Human Vascular Smooth Muscle Cell Basal Medium (formerly ''Medium 231'') | Gibco | M231500 | Medium used to culture smooth muscle cells |
| Invitrogen countess II | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | Automated cell counter |
| Ionomycin calcium salt from Streptomyces conglobatus | Sigma-Aldrich | I0634-1MG | Compound used for contraction stimulation |
| NaCl 0.9% | Fresenius Kabi | B230561 | Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Antibiotics used for cell culture medium |
| Phospathe buffered saline | Gibco | 10010023 | Used to wash cells |
| Quick-RNA Miniprep Kit | Zymo Research | R1055 | Kit used for RNA isolation |
| Smooth Muscle Growth Supplement (SMGS) | Gibco | S00725 | Supplement which is added to smooth muscle cell culture medium |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | 11754250 | Kit used for cDNA synthesis |
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4309155 | Reagent for qPCR |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | Used to trypsinize cells |
| ZTheta | Applied Biophysics | ZTheta | ECIS instrument used for contraction measurements |
References
- Milewicz, D. M., et al. Genetic basis of thoracic aortic aneurysms and dissections: focus on smooth muscle cell contractile dysfunction. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 9, 283-302 (2008).
- Milewicz, D. M., et al. Altered smooth muscle cell force generation as a driver of thoracic aortic aneurysms and dissections. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (1), 26-34 (2017).
- Groeneveld, M. E., et al. Betaglycan (TGFBR3) up-regulation correlates with increased TGF-β signaling in Marfan patient fibroblasts in vitro. Cardiovascular Pathology. 32, 44-49 (2018).
- Chen, J., Li, H., SundarRaj, N., Wang, J. H. C. Alpha-smooth muscle actin expression enhances cell traction force. Cell Motility and the Cytoskeleton. 64 (4), 248-257 (2007).
- Peyton, S. R., Putnam, A. J. Extracellular matrix rigidity governs smooth muscle cell motility in a biphasic fashion. Journal of Cellular Physiology. 204 (1), 198-209 (2005).
- Williams, D. A., Fogarty, K. E., Tsien, R. Y., Fay, F. S. Calcium gradients in single smooth muscle cells revealed by the digital imaging microscope using Fura-2. Nature. 318 (6046), 558-561 (1985).
- Wu, D., et al. NLRP3 (nucleotide oligomerization domain-like receptor family, pyrin domain containing 3)-caspase-1 inflammasome degrades contractile proteins: implications for aortic biomechanical dysfunction and aneurysm and dissection formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (4), 694-706 (2017).
- Bogunovic, N., et al. Impaired smooth muscle cell contractility as a novel concept of abdominal aortic aneurysm pathophysiology. Scientific Reports. 9 (1), 1-14 (2019).
- Hurst, V., Goldberg, P. L., Minnear, F. L., Heimark, R. L., Vincent, P. A. Rearrangement of adherens junctions by transforming growth factor-β1: role of contraction. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 276 (4), 582-595 (1999).
- Hu, N., et al. Comparison between ECIS and LAPS for establishing a cardiomyocyte-based biosensor. Sensors and Actuators B: Chemical. 185, 238-244 (2013).
- Peters, M. F., Lamore, S. D., Guo, L., Scott, C. W., Kolaja, K. L. Human stem cell-derived cardiomyocytes in cellular impedance assays: bringing cardiotoxicity screening to the front line. Cardiovascular Toxicology. 15 (2), 127-139 (2015).
- Zhang, S., Yang, Y., Kone, B. C., Allen, J. C., Kahn, A. M. Insulin-stimulated cyclic guanosine monophosphate inhibits vascular smooth muscle cell migration by inhibiting Ca/calmodulin-dependent protein kinase II. Circulation. 107 (11), 1539-1544 (2003).
- Halterman, J. A., Kwon, H. M., Zargham, R., Bortz, P. D. S., Wamhoff, B. R. Nuclear factor of activated T cells 5 regulates vascular smooth muscle cell phenotypic modulation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (10), 2287-2296 (2011).
- Bass, H. M., Beard, R. S., Cha, B. J., Yuan, S. Y., Nelson, P. R. Thrombomodulin induces a quiescent phenotype and inhibits migration in vascular smooth muscle cells in vitro. Annals of Vascular Surgery. 30, 149-156 (2016).
- Burger, J., et al. Molecular phenotyping and functional assessment of smooth muscle like-cells with pathogenic variants in aneurysm genes ACTA2, MYH11, SMAD3 and FBN1. Human Molecular Genetics. , (2021).
- Yeung, K. K., et al. Transdifferentiation of human dermal fibroblasts to smooth muscle-like cells to study the effect of MYH11 and ACTA2 mutations in aortic aneurysms. Human Mutation. 38 (4), 439-450 (2017).
