تصف هذه الورقة طريقة قائمة على زراعة الإكسبولوجيا لعزل وزراعة خلايا العضلات الملساء الأبهرية البشرية الأولية الخاصة بالمريض والخلايا الليفية الجلدية. علاوة على ذلك ، يتم تقديم طريقة جديدة لقياس تقلص الخلايا والتحليل اللاحق ، والتي يمكن استخدامها لدراسة الاختلافات الخاصة بالمريض في هذه الخلايا.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
عزل خلايا العضلات الملساء الأبهرية الأولية الخاصة بالمريض وقياسات الانقباض شبه الكمية في الوقت الفعلي في المختبر
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
خلايا العضلات الملساء (SMCs) هي نوع الخلايا السائد في الوسط الأبهري. آلياتهم الانقباضية مهمة لنقل القوة في الشريان الأورطي وتنظم تضيق الأوعية وتوسع الأوعية. ترتبط الطفرات في الجينات المشفرة لبروتينات جهاز الانقباض SMC بأمراض الأبهر ، مثل تمدد الأوعية الدموية الأبهري الصدري. يعد قياس انكماش SMC في المختبر أمرا صعبا ، خاصة بطريقة عالية الإنتاجية ، وهو أمر ضروري لفحص مواد المرضى. الطرق المتاحة حاليا ليست مناسبة لهذا الغرض. تقدم هذه الورقة طريقة جديدة تعتمد على استشعار مقاومة الخلايا الكهربائية والركيزة (ECIS). أولا ، يتم وصف بروتوكول explant لعزل SMCs البشرية الأولية الخاصة بالمريض من خزعات الأبهر والخلايا الليفية الجلدية الأولية البشرية الخاصة بالمريض لدراسة تمدد الأوعية الدموية الأبهري. بعد ذلك ، يتم تقديم وصف مفصل لطريقة انكماش جديدة لقياس الاستجابة الانقباضية لهذه الخلايا ، بما في ذلك التحليل اللاحق والاقتراح لمقارنة المجموعات المختلفة. يمكن استخدام هذه الطريقة لدراسة تقلص الخلايا الملتصقة في سياق الدراسات الانتقالية (القلبية الوعائية) ودراسات فحص المرضى والأدوية.
المقدمة
خلايا العضلات الملساء (SMCs) هي نوع الخلايا السائد في الطبقة الإنسية الأبهرية، وهي الطبقة الأكثر سمكا في الشريان الأورطي. داخل الجدار ، يتم توجيهها شعاعيا وتشارك ، من بين وظائف أخرى ، في تضيق الأوعية وتوسيع الأوعية1. تشارك آلية الانقباض SMC في نقل القوة في الشريان الأورطي من خلال الرابط الوظيفي مع المصفوفة خارج الخلية2. ترتبط الطفرات في الجينات المشفرة لبروتينات جهاز انقباض SMC ، مثل سلسلة الميوسين الثقيلة للعضلات الملساء (MYH11) والأكتين العضلي الأملس (ACTA2) ، بحالات تمدد الأوعية الدموية الأبهري الصدري العائلي ، مما يؤكد أهمية تقلص SMC في الحفاظ على السلامة الهيكلية والوظيفية للشريان الأورطي
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: تم الحصول على خزعات الأبهر أثناء إصلاح تمدد الأوعية الدموية المفتوح في المراكز الطبية بجامعة أمستردام ، المركز الطبي بجامعة VU ، أمستردام ، Zaans Medisch Centrum ، مستشفى Zaandam و Dijklander ، Hoorn ، هولندا. تم الحصول على أنسجة الأبهر الضابطة من قطعة الشريان الأورطي المرتبطة بالشريان الكلوي الذي تم حصاده لعمليات زرع الكلى. تم تضمين المرضى الذين تزيد أعمارهم عن 18 عاما فقط ، وأعطى جميع المرضى موافقتهم المستنيرة على المشاركة في الدراسة. تم جمع جميع المواد وفقا للوائح إعلان WMA في هلسنكي والمبادئ التوجيهية المؤسسية للجنة الأخلاقيات الطبية التابعة لمركز VU الطبي. تم إجراء جميع التجارب والبروتوكولات التجريبية وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية ووافقت عليها لجنة الأخ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
لاختبار قابلية تكرار هذه الطريقة ، تم التحقق من صحة الطريقة أولا باستخدام SMCs التحكم فقط. لتحديد قابلية تكرار القياس بين التجارب، تم رسم قياسين مستقلين لجميع خطوط خلايا التحكم والمريض المضمنة كمخطط Bland-Altman (الشكل 3B). أظهرت المؤامرة أن هذه الطريقة لا تظهر التباين خارج فترة الثقة ، باستثناء خط خلية شاذ واحد. وعلاوة على ذلك، أظهرت هذه النتائج أن بئرين تم زرعهما في نفس التجربة وحفزهما في وقت واحد يظهران عمليا نفس منحنى الاستجابة الانقباضية (الشكل 4C). للتحقق .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تقدم هذه الورقة طريقة لقياس انكماش SMC في المختبر ، بناء على التغيرات في المعاوقة واحتلال السطح. أولا ، يتم وصف عزل وزراعة وتوسيع SMCs البشرية الأولية الخاصة بالمريض والخلايا الليفية الجلدية ، تليها كيفية استخدامها لقياسات الانقباض.
يرتبط أحد قيود الدراسة بالحصول على الخلايا من خلال بروتوكول explant. قد يكون للخلايا التي تتكاثر من الخزعة خصائص مختلفة عن الأنسجة الأصلية في الجسم الحي. بالإضافة إلى ذلك ، فإن بروتوكولات explant المعروضة هنا ليست مبتكرة ولكن يتم تضمينها لتقديم س.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان.
شكر وتقدير
نود أن نعرب عن امتناننا لتارا فان ميرينبوير ، وألبرت فان ويك ، ويولاندا فان دير فيلدن ، وجان د. بلانكنشتيجن ، ولان تران ، وبيتر ل. هورديك ، وفريق PAREL-AAA ، وجميع جراحي الأوعية الدموية في أمستردام UMC ، و Zaans Medisch Centrum ، ومستشفى Dijklander لتوفير المواد والدعم لهذه الدراسة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 96-بئر صفيف | الفيزياء الحيوية التطبيقية | 96W10idf مصفوفة PET | المستخدمة لقياس الانكماش في إعداد |
| ECIS Custodiol | Dr. Franz Hö حل hler Chemie GmbH | RVG 12801 | يستخدم لنقل الأنسجة من غرفة الجراحة إلى المختبر |
| ثنائي ميثيل سلفوكسيد | سيجما ألدريتش | 472301 يستخدم لتخفيف مصل الأيونوميسين | |
| الأيوني | جيبكو | 26140079 | إضافة إلى وسط زراعة |
| مزيج المغذيات F-10 | من Ham Gibco | 11550043 | Medium يستخدم لزراعة الخلايا |
| الليفية الجلديةوسيط قاعدة لخلية العضلات الملساء الوعائية البشرية (المعروف سابقا باسم "Medium 231") | Gibco | M231500 | Medium يستخدم لزراعة خلايا العضلات الملساء |
| Invitrogen countess II | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | عداد الخلايا الآلي |
| ملح الكالسيوم Ionomycin من Streptomyces conglobatus | Sigma-Aldrich | I0634-1MG | مركب يستخدم لتحفيز الانكماش |
| كلوريد الصوديوم 0.9٪ | Fresenius Kabi | B230561 | Solution يستخدم لنقل الأنسجة من غرفة الجراحة إلى المختبر |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | المضادات الحيوية المستخدمة في وسط زراعة الخلايا |
| Phospathe Buffered Saline | Gibco | 10010023 | يستخدم لغسل الخلايا |
| Quick-RNA Miniprep Kit | Zymo Research | R1055 | Kit المستخدمة لعزل |
| الحمض النووي الريبيمكمل نمو العضلات الملساء (SMGS) | Gibco | S00725 | الذي يضاف إلى وسط زراعة خلايا العضلات الملساء |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis | Kit Thermo Fisher Scientific | 11754250 | Kit المستخدمة لتخليق (كدنا |
| SYBR Green PCR Master | Mix Thermo Fisher كاشف 4309155 العلمي | ل qPCR | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | يستخدم في التربسين الخلايا |
| ZTheta | الفيزياء الحيوية التطبيقية | ZTheta | ECIS أداة تستخدم لقياسات الانكماش |
المراجع
- Milewicz, D. M., et al. Genetic basis of thoracic aortic aneurysms and dissections: focus on smooth muscle cell contractile dysfunction. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 9, 283-302 (2008).
- Milewicz, D. M., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
