شريحة موائع دقيقة بسيطة للنمو على المدى الطويل وتصوير Caenorhabditis elegans
Summary
يصف البروتوكول تصميما بسيطا لرقاقة الموائع الدقيقة ومنهجية التصنيع الدقيق المستخدمة لزراعة C. elegans في وجود إمدادات غذائية مستمرة لمدة تصل إلى 36 ساعة. يتيح جهاز النمو والتصوير أيضا تصويرا متقطعا عالي الدقة طويل المدى للعمليات الخلوية وشبه الخلوية أثناء التطوير لعدة أيام.
Abstract
أثبت Caenorhabditis elegans (C. elegans) أنه نظام نموذجي قيم لدراسة العمليات البيولوجية التنموية والخلوية. غالبا ما يتطلب فهم هذه العمليات البيولوجية تصويرا طويل الأمد ومتكررا لنفس الحيوان. أوقات التعافي الطويلة المرتبطة بطرق التثبيت التقليدية التي تتم على منصات أجار لها آثار ضارة على صحة الحيوان مما يجعل من غير المناسب تصوير نفس الحيوان بشكل متكرر على مدى فترات طويلة من الزمن. تصف هذه الورقة تصميم رقاقة الموائع الدقيقة ، وطريقة التصنيع ، وبروتوكول زراعة C. elegans على الرقاقة ، وثلاثة أمثلة للتصوير طويل المدى لدراسة العمليات التنموية في الحيوانات الفردية. الرقاقة ، المصنعة من polydimethylsiloxane والمستعبدين على غطاء زجاجي ، تشل حركة الحيوانات على ركيزة زجاجية باستخدام غشاء مرن ينحرف باستخدام غاز النيتروجين. يتيح التثبيت الكامل ل C. elegans تصويرا قويا بفاصل زمني للأحداث الخلوية وشبه الخلوية بطريقة خالية من التخدير. تسمح هندسة القناة ذات المقطع العرضي الكبير للحيوان بالتحرك بحرية داخل غشاءين معزولين مغلقين جزئيا مما يسمح بالنمو في القناة مع إمدادات غذائية مستمرة. باستخدام هذه الشريحة البسيطة ، يمكن إجراء تصوير الظواهر التنموية مثل نمو العملية العصبية ، وتطور الفرج ، والتشجير المتغصن في الخلايا العصبية الحسية PVD ، حيث ينمو الحيوان داخل القناة. تعمل رقاقة النمو والتصوير على المدى الطويل بخط ضغط واحد ، ولا توجد صمامات خارجية ، ومستهلكات سائلة غير مكلفة ، وتستخدم بروتوكولات معالجة الديدان القياسية التي يمكن تكييفها بسهولة من قبل المختبرات الأخرى باستخدام C. elegans.
Introduction
أثبت Caenorhabditis elegans أنه كائن نموذجي قوي لدراسة بيولوجيا الخلية والشيخوخة وبيولوجيا التنمية وبيولوجيا الأعصاب. أدت مزايا مثل جسمها الشفاف ، ودورة حياتها القصيرة ، وسهولة الصيانة ، وعدد محدد من الخلايا ، والتماثل مع العديد من الجينات البشرية ، وعلم الوراثة المدروس جيدا إلى أن تصبح C. elegans نموذجا شائعا لكل من اكتشافات البيولوجيا الأساسية والبحوث التطبيقية 1,2. يمكن أن يكون فهم العمليات البيولوجية والتنموية للخلية من الملاحظة المتكررة طويلة المدى للحيوانات الفردية مفيدا. تقليديا ، يتم تخدير C. elegans على منصات أجار وتصويرها تحت المجهر. الآثار الضارة للتخدير على صحة الحيوانات تحد من استخدام الحيوانات المخدرة للتصوير المتقطع على المدى الطويل والمتكرر لنفس الحيوان 3,4. تتيح التطورات الحديثة في تقنيات الموائع الدقيقة وتكييفها مع الاصطياد الخالي من التخدير ل C. elegans مع مخاطر صحية ضئيلة التصوير عالي الدقة لنفس الحيوان على مدى فترة زمنية قصيرة وطويلة.
تم تصميم رقائق الموائع الدقيقة لفحص C. elegans’5 عالي الإنتاجية6،7،8 ، ومحاصرة وتوزيع9 ، وفحص المخدرات 10،11 ، وتحفيز الخلايا العصبية مع تصوير عالي الدقة 12 ، وتصوير عالي الدقة للحيوان 12،13،14. كما تم تطوير صفائح الموائع الدقيقة الرقيقة للغاية للتثبيت على الشرائح15. تم إجراء دراسات طويلة الأجل على C. elegans باستخدام صور منخفضة الدقة للحيوانات التي تنمو في الثقافة السائلة لمراقبة النمو وديناميكيات الكالسيوم وتأثيرات الدواء على سلوكها16،17،18،19 ، وطول عمرها ، والشيخوخة20. تم إجراء دراسات طويلة الأجل باستخدام الفحص المجهري عالي الدقة لتقييم التطور المشبكي21 ، وتجديد الخلايا العصبية 22 ، وإضافة الميتوكوندريا23. تم إجراء تصوير عالي الدقة على المدى الطويل وتتبع مصير الخلية والتمايز في أجهزة متعددة القنوات24,25. تحدث العديد من الأحداث الخلوية وشبه الخلوية على مدى نطاقات زمنية لعدة ساعات وتتطلب محاصرة نفس الفرد في نقاط زمنية مختلفة أثناء تطورها لتوصيف جميع الخطوات الوسيطة في العملية لفهم الديناميات الخلوية في الجسم الحي. لتصوير العملية البيولوجية مثل تكوين الأعضاء ، وتطور الخلايا العصبية ، وهجرة الخلايا ، يحتاج الحيوان إلى تجميد الحركة في نفس الاتجاه في نقاط زمنية متعددة. لقد نشرنا سابقا بروتوكولا للتصوير عالي الدقة ل C. elegans لأكثر من 36 ساعة لتحديد مكان إضافة الميتوكوندريا على طول الخلايا العصبية المستقبلة لمستقبلات اللمس (TRNs)23.
تقدم هذه الورقة بروتوكولا لإنشاء منهجية قائمة على الموائع الدقيقة للتصوير المتكرر عالي الدقة. هذا الجهاز ، مع قناة تدفق واحدة ، هو الأنسب للتصوير المتكرر لحيوان واحد لكل جهاز. لتحسين الإنتاجية وتصوير العديد من الحيوانات في وقت واحد ، يمكن توصيل أجهزة متعددة بنفس خط الضغط ولكن مع موصلات ثلاثية منفصلة تتحكم في واحد في كل جهاز. التصميم مفيد للدراسات التي تتطلب صورا ذات فاصل زمني عالية الدقة مثل عمليات النمو بعد الجنين ، وهجرة الخلايا ، ونقل العضيات ، ودراسات التعبير الجيني ، وما إلى ذلك. يمكن أن تكون التكنولوجيا مقيدة لبعض التطبيقات مثل دراسات العمر والشيخوخة التي تتطلب نموا متوازيا وتصويرا للعديد من الحيوانات في المرحلة المتأخرة. تم استخدام المطاط الصناعي Polydimethylsiloxane (PDMS) لتصنيع هذا الجهاز بسبب ثباته الحيوي 26 ، والتوافق الحيوي 27،28 ، ونفاذية الغاز 29،30 ، ومعامل المرونة القابل للضبط 31. يسمح هذا الجهاز المكون من طبقتين بنمو الحيوانات ذات الإمدادات الغذائية المستمرة في قناة الموائع الدقيقة ومحاصرة C. elegans الفردية عبر ضغط غشاء PDMS باستخدام غاز النيتروجين. هذا الجهاز هو امتداد للجهاز المنشور سابقا مع ميزة زراعة وتصوير نفس الحيوان في القناة الدقيقة تحت إمدادات غذائية مستمرة3. تتيح شبكة غشاء العزل الإضافية وغشاء الاصطياد بعرض 2 مم تثبيت الحيوانات النامية بكفاءة. تم استخدام الجهاز لمراقبة تطور الخلايا العصبية ، وتطور الفرج ، والتشجير الشجيري في الخلايا العصبية الحسية PVD. تنمو الحيوانات دون آثار صحية ضارة في الجهاز ويمكن تجميدها بشكل متكرر لتسهيل تصوير الأحداث دون الخلوية في نفس الحيوان أثناء تطوره.
ينقسم البروتوكول بأكمله إلى خمسة أجزاء. يصف الجزء 1 تصنيع الجهاز لشريحة النمو والتصوير. يصف الجزء 2 كيفية إعداد نظام ضغط لانحراف غشاء PDMS لشل حركة وعزل C. elegans الفردية. يصف الجزء 3 كيفية مزامنة C. elegans على لوحة وسط نمو الديدان الخيطية (NGM) لتصوير الجهاز. يصف الجزء 4 كيفية تحميل واحد في الجهاز وتنمية الحيوان داخل جهاز الموائع الدقيقة لعدة أيام. يصف الجزء 5 كيفية شل حركة فردي في نقاط زمنية متعددة ، والتقاط صور عالية الدقة باستخدام أهداف مختلفة ، وتحليل الصور باستخدام فيجي.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الورقة ، تم وصف بروتوكول لتصنيع واستخدام جهاز الموائع الدقيقة البسيط لزراعة C. elegans مع إمدادات غذائية ثابتة وتصوير عالي الدقة لحيوان واحد أثناء تطوره. عملية التصنيع هذه بسيطة ويمكن إجراؤها في بيئة غير معقمة. تعد البيئة الخالية من الغبار أمرا بالغ الأهمية أثناء خطوات التصنيع. قد …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر مرفق التصوير CIFF ، NCBS لاستخدام المجاهر متحدة البؤر التي يدعمها DST – مركز تكنولوجيا النانو (No. SR/55/NM-36-2005). نشكر تمويل الأبحاث من DBT (SPK) ، CSIR-UGC (JD) ، DST (SM) ، DBT (SM) ، قرص الغزل المدعوم من DAE-PRISM 12-R&D-IMS-5.02.0202 (SPK و Gautam Menon) ، ورقم منحة HHMI-IECS 55007425 (SPK). تم توفير سلالات HB101 و PS3239 و wdIs51 من قبل مركز Caenorhabditis Genetics Center (CGC) ، والذي يموله مكتب المعاهد الوطنية للصحة لبرامج البنية التحتية البحثية (P40 OD010440). صنع SPK jsIs609 في مختبر مايك نونت.
Materials
| 18 G needles | Sigma-Aldrich, Bangalore, India | Gauge 18 | |
| 3-way stopcock | Cole-Parmer | WW-30600-02 | Masterflex fitting with luer lock |
| CCD camera | Andor Technology | EMCCD C9100-13no | |
| Circuit board film | Fine Line Imaging, Colorado, USA | The designs are printed with 65,024 dots per inch (DPI) | |
| Convection Oven | Meta-Lab Scientific Industries, India | MSI-5 | |
| Coverslips | Blue stat microscopic cover glass | 22mm x 10Gms | |
| Ethanol | Hi media | ||
| Harris uni-core puncher 1mm | Qiagen | Z708801 | |
| Hexamethyldisilazane | Sigma-Aldrich, Bangalore, India | 440191 | |
| Hot plate | IKA | RCT B S 22 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | 26895 | |
| KOH | Fisher Scientific | ||
| Laser Scanning Microscope | ZEISS | LSM 5 LIVE | |
| Micropipette tips | Tarsons | 0.5-10 µL micropipette tips are used for food supply | |
| Negative Photoresist-1 | Microchem | SU8-2025 | http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm |
| Negative Photoresist-2 | Microchem | SU8-2050 | http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm |
| Nitrogen gas | Local Supplier | Commercial nitrogen gas | Cylinder volume of 7 cubic meter |
| PDMS (Curing solution) | Dow Corning Corporation, MI, USA | Sylgard curing solution | curing agent |
| Petri plates | Praveen Scientific Corporation | ||
| Plasma cleaner | Harrick Plasma, NY, USA | PDC-32G | |
| Razor and blades | Lister surgical Blade | ||
| Silicon Elastomer (Base) | Dow Corning Corporation, MI, USA | Sylgard 184 base | elastomer base |
| Silicon tubes | Fisher Scientific | Plastic tubes with the inner diameter 1.59 mm and the outer diameter 3.18 mm | |
| Silicon wafer | University Wafer, MA, USA | [100] orientation, 4-inch diameter | Small pieces (2 mm × 2 mm) were cut from 100 mm diameter wafer |
| Spin Coater | SPS-Europe B.V., The Netherlands | SPIN 150 | |
| Spinning Disk microscope | Perkin Elmer ultra-view VOX system | CSU-X1-A3 N | The system was equipped with four (405/488/561/640 nm) lasers and controlled with the Volocity software package. |
| SU8 developer | Microchem, MA, USA | SU8 Developer | |
| Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma-Aldrich, Bangalore, India | 448931 | Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane vapor is toxic |
| UV lamp | Oriel Instruments, Bangalore, India | 200 Watt and collimated UV light source | |
| Volocity software | Perkin-Elmer | Image analysis |
References
- Doitsidou, M., Poole, R. J., Sarin, S., Bigelow, H., Hobert, O. C. elegans Mutant Identification with a One-Step Whole-Genome-Sequencing and SNP Mapping Strategy. PloS One. 5 (11), 15435 (2010).
- Hobert, O. Neurogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans. WormBook. The C. elegans. Research Community, WormBook. , (2010).
- Mondal, S., Ahlawat, S., Rau, K., Venkataraman, V., Koushika, S. P. Imaging in vivo neuronal transport in genetic model organisms using microfluidic devices. Traffic. 12 (4), 372-385 (2011).
- Steele, L. M., Sedensky, M. M. Approaches to Anesthetic Mechanisms: The C. elegans Model. Methods in Enzymology. 602, 133-151 (2018).
- San-Miguel, A., Lu, H. Microfluidics as a tool for C. elegans research. WormBook. The C. elegans. Research Community, WormBook. , (2013).
- Cáceres, I. C., Valmas, N., Hilliard, M. A., Lu, H. Laterally orienting C. elegans using geometry at microscale for high-throughput visual screens in neurodegeneration and neuronal development studies. PloS One. 7 (4), 35037 (2012).
- Ai, X., Zhuo, W., Liang, Q., McGrath, P. T., Lu, H. A high-throughput device for size based separation of C. elegans developmental stages. Lab on a Chip. 14 (10), 1746-1752 (2014).
- Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nature Methods. 5 (7), 637-643 (2008).
- Desta, I. T., et al. Detecting and Trapping of a Single C. elegans Worm in a Microfluidic Chip for Automated Microplate Dispensing. SLAS Technology. 22 (4), 431-436 (2017).
- Ben-Yakar, A. High-Content and High-Throughput In Vivo Drug Screening Platforms Using Microfluidics. Assay and Drug Development Technologies. 17 (1), 8-13 (2019).
- Mondal, S., et al. Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model. Nature Communications. 7, 13023 (2016).
- Fehlauer, H., et al. Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. Elegant. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56530 (2018).
- Saberi-Bosari, S., Huayta, J., San-Miguel, A. A microfluidic platform for lifelong high-resolution and high throughput imaging of subtle aging phenotypes in C. elegans. Lab on a Chip. 18 (20), 3090-3100 (2018).
- Cornaglia, M., et al. An automated microfluidic platform for C. elegans embryo arraying, phenotyping, and long-term live imaging. Scientific Reports. 5, 10192 (2015).
- Suzuki, M., et al. Development of ultra-thin chips for immobilization of Caenorhabditis elegans in microfluidic channels during irradiation and selection of buffer solution to prevent dehydration. Journal of Neuroscience Methods. 306, 32-37 (2018).
- Hulme, S. E., et al. Lifespan-on-a-chip: microfluidic chambers for performing lifelong observation of C. elegans. Lab on a Chip. 10 (5), 589-597 (2010).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
- Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. Microfluidic Devices for Behavioral Analysis, Microscopy, and Neuronal Imaging in Caenorhabditis Elegans. Methods in Molecular Biology. 1327, 159-179 (2015).
- Levine, E., Lee, K. S. Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research. Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).
- Rahman, M., et al. NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10 (1), 16190 (2020).
- Allen, P. B., et al. Single-synapse ablation and long-term imaging in live C. elegans. Journal of Neuroscience Methods. 173 (1), 20-26 (2008).
- Guo, S. X., et al. Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies. Nature Methods. 5 (6), 531-533 (2008).
- Mondal, S., et al. Tracking Mitochondrial Density and Positioning along a Growing Neuronal Process in Individual C. elegans Neuron Using a Long-Term Growth and Imaging Microfluidic Device. eNeuro. 8 (4), (2021).
- Keil, W., Kutscher, L. M., Shaham, S., Siggia, E. D. Long-Term High-Resolution Imaging of Developing C. elegans Larvae with Microfluidics. Developmental Cell. 40 (2), 202-214 (2017).
- Gritti, N., Kienle, S., Filina, O., Van Zon, J. S. Long-term time-lapse microscopy of C. Elegans post-embryonic development. Nature Communications. 7, 12500 (2016).
- Kim, S., et al. A biostable, anti-fouling zwitterionic polyurethane-urea based on PDMS for use in blood-contacting medical devices. Journal of materials chemistry B. 8 (36), 8305-8314 (2020).
- Peterson, S. L., McDonald, A., Gourley, P. L., Sasaki, D. Y. Poly(dimethylsiloxane) thin films as biocompatible coatings for microfluidic devices: cell culture and flow studies with glial cells. Journal of Biomedical Materials ResearchPart A. 72 (1), 10-18 (2005).
- Folch, A., Toner, M. Cellular micropatterns on biocompatible materials. Biotechnology Progress. 14 (3), 388-392 (1998).
- Leclerc, E., Sakai, Y., Fujii, T. Microfluidic PDMS (polydimethylsiloxane) bioreactor for large-scale culture of hepatocytes. Biotechnology Progress. 20 (3), 750-755 (2004).
- Mehta, G., et al. Quantitative measurement and control of oxygen levels in microfluidic poly(dimethylsiloxane) bioreactors during cell culture. Biomedical Microdevices. 9 (2), 123-134 (2007).
- Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. Development of polydimethylsiloxane substrates with tunable elastic modulus to study cell mechanobiology in muscle and nerve. PloS One. 7 (12), 51499 (2012).
- Inoue, T., et al. Gene expression markers for Caenorhabditis elegans vulval cells. Mechanisms of Development. 119, 203-209 (2002).
- Fatouros, C., et al. Inhibition of Tau aggregation in a novel caenorhabditis elegans model of tauopathy mitigates proteotoxicity. Human Molecular Genetics. 21 (16), 3587-3603 (2012).
- Smith, C. J., et al. Time-lapse imaging and cell-speci fi c expression pro fi ling reveal dynamic branching and molecular determinants of a multi-dendritic nociceptor in C. elegans. Developmental Biology. 345 (1), 18-33 (2010).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
- Oren-Suissa, M., Hall, D. H., Treinin, M., Shemer, G., Podbilewicz, B. The fusogen EFF-I controls sculpting of mechanosensory dendrites. Science. 328 (5983), 1285-1288 (2010).
- Smith, C. J., et al. Sensory neuron fates are distinguished by a transcriptional switch that regulates dendrite branch stabilization. Neuron. 79 (2), 266-280 (2013).
- Shrestha, B. R., Grueber, W. B. Neuronal morphogenesis: worms get an EFF in dendritic arborization. Current Biology: CB. 20 (16), 673-675 (2010).
- Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport. Optics Express. 16 (13), 9884-9894 (2008).
- Sure, G. R., et al. UNC-16/JIP3 and UNC-76/FEZ1 limit the density of mitochondria in C. elegans neurons by maintaining the balance of anterograde and retrograde mitochondrial transport. Scientific Reports. 8 (1), 8938 (2018).
- Awasthi, A., et al. Regulated distribution of mitochondria in touch receptor neurons of C. elegans influences touch response. bioRxiv. , (2020).
