Monitoraggio dell'acidificazione intestinale nell'intestino di Drosophila adulta

Summary

Qui, presentiamo un protocollo standardizzato per il monitoraggio dell’acidificazione intestinale in Drosophila melanogaster con un output ottimale. Per prima cosa usiamo questo protocollo per il monitoraggio dell’acidificazione intestinale in Drosophila melanogaster e poi dimostriamo il suo uso in specie di Drosophila non modello.

Abstract

Il moscerino della frutta midgut è costituito da più regioni, ognuna delle quali è composta da cellule che svolgono funzioni fisiologiche uniche necessarie per il corretto funzionamento dell’intestino. Una di queste regioni, la regione delle cellule di rame (CCR), è localizzata nel midgut medio e consiste, in parte, di un gruppo di cellule note come cellule di rame. Le cellule di rame sono coinvolte nella secrezione acida gastrica, un processo evolutivamente conservato il cui ruolo preciso è poco compreso. Questo documento descrive i miglioramenti nell’attuale protocollo utilizzato per il test per l’acidificazione dell’intestino adulto di Drosophila melanogaster e dimostra che può essere utilizzato su altre specie di mosche. In particolare, questo documento dimostra che l’acidificazione intestinale dipende dallo stato nutrizionale della mosca e presenta un protocollo basato su questa nuova scoperta. Nel complesso, questo protocollo dimostra la potenziale utilità di studiare le cellule di rame Drosophila per scoprire i principi generali alla base dei meccanismi di acidificazione intestinale.

Introduction

Nell’intestino degli insetti, le cellule di rame condividono somiglianze cellulari e funzionali con le cellule parietali gastriche produttrici di acido (note anche come ossintiche) dello stomaco dei mammiferi. Questo gruppo di cellule rilascia acido nel lume intestinale. La funzione della secrezione acida e dell’anatomia è conservata evolutivamente. I componenti principali dell’acido scaricato sono l’acido cloridrico e il cloruro di potassio. Il meccanismo chimico di formazione dell’acido nelle cellule dipende dall’anidrasi carbonica. Questo enzima genera uno ione bicarbonato da _CO2 e acqua, che libera uno ione idrossile che viene poi scaricato nel lume attraverso una pompa protonica in cambio di potassio. Gli ioni cloruro e potassio vengono trasportati nel lume da canali di conduttanza con conseguente formazione di acido cloridrico e cloruro di potassio, il componente principale del succo gastrico1,2,3,4.

Sebbene i meccanismi di formazione dell’acido siano ben compresi, molto meno si sa sui meccanismi fisiologici che regolano la secrezione acida. L’obiettivo dello sviluppo di questo metodo è quello di aiutare a delineare meglio le vie cellulari che coordinano la formazione e la secrezione di acido e determinare il ruolo dell’acido nel mediare la fisiologia intestinale e l’omeostasi. Il razionale alla base dello sviluppo e dell’uso di questa tecnica è quello di fornire un metodo coerente e affidabile per studiare il processo di acidificazione intestinale nella Drosophila e negli organismi non modello. Sebbene esista attualmente un protocollo standard per determinare l’acidificazione midgut di Drosophila2,5,6, è stata osservata una significativa variabilità nell’entità dell’acidificazione nelle mosche wild-type (WT) durante l’utilizzo di questo protocollo per studiare la funzione delle cellule di rame. Per comprendere le basi di questa variabilità osservata e ottenere risultati coerenti, diversi aspetti del protocollo standard sono stati ottimizzati come descritto di seguito.

Protocol

NOTA: La linea di laboratorio standard Oregon R è stata utilizzata come controllo WT. Tutte le mosche sono state allevate su un mezzo standard di farina di mais-melassa (contenente melassa, agar, lievito, farina di mais, tegosept, acido propionico e acqua) a temperatura ambiente con ritmo circadiano chiaro / scuro di 12/12 ore. 1. Preparazione per il test Raccogli le mosche femmine (0-2 giorni, non vergini) in anestesia CO2 e consenti loro di recuperare s…

Representative Results

Abbiamo affamato le mosche femminili dell’Oregon R per più di 20 ore e poi le abbiamo alimentate con cibo integrato con BPB (2%) per ~ 12 ore, come descritto in precedenza7,8,9,10,11. Il blu di bromofenolo (BPB) è un colorante sensibile al pH. Cambia da giallo a pH 3,0 a blu a pH 4,6 e oltre. Dopo la dissezione intestinale, come riportato in precedenza, alcu…

Discussion

Un passo critico in questo protocollo è la corretta dissezione dell’intestino per visualizzare il CCR per il fenotipo di acidificazione. L’acido rilasciato dalle cellule di rame è confinato al CCR quando l’intestino è intatto. Tuttavia, durante la dissezione, la perdita causata dalla rottura dell’intestino può portare alla diffusione di acido dal CCR e provocare un intestino erroneamente valutato come negativo per l’acidificazione. Inoltre, il colore giallo indicativo di acidificazione svanisce entro 5-10 minuti dopo…

Materials

Bromophenol blue	Sigma-Aldrich		B0126
cellSens software	Olympus		Image aqusition (https://www.olympus-lifescience.com/en/software/cellsens)
D. simulans	Drosophila Species Stock Center at the University of California		Riverside California1 (https://www.drosophilaspecies.com/)
D. erecta	Drosophila Species Stock Center at the University of California		Dere cy1(https://www.drosophilaspecies.com/)
D. pseudoobscura	Drosophila Species Stock Center at the University of California		Eugene, Oregon(https://www.drosophilaspecies.com/)
D. mojavensis	Drosophila Species Stock Center at the University of California		Chocolate Mountains, California (https://www.drosophilaspecies.com/)
Forceps	Inox Biology		Catalog# 11252-20
Fuji	Fuji		Image processing (https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html)
Glass slide	VWR		Catalog#16005-108
Kim wipes Tissue	Kimtech
Microscope and camera	Olympus SZ61 microscope equipped with an Olympus D-27 digital camera		Imaging
Oregon R	Bloomington Drosophila Stock		(https://bdsc.indiana.edu/ # 2376)
Petri dishes	Fisher Scientific		Catalog #FB0875713A
Phosphate-buffered Saline (PBS)	HyClone		Catalog # SH30258.01
Stereomicroscope	Olympus SZ51		Visual magnification