Summary

Overvåking av tarmforsuring i voksen drosophila tarmen

Published: October 11, 2021
doi:

Summary

Her presenterer vi en standardisert protokoll for overvåking av tarmforsuring i Drosophila melanogaster med optimal effekt. Vi bruker først denne protokollen for tarmforsuringsovervåking i Drosophila melanogaster og demonstrerer deretter bruken i ikke-modell Drosophila-arter .

Abstract

Fruktfluen midgut består av flere regioner, som hver består av celler som utfører unike fysiologiske funksjoner som kreves for riktig funksjon av tarmen. En slik region, kobbercelleområdet (CCR), er lokalisert til midten av midgut og består delvis av en gruppe celler kjent som kobberceller. Kobberceller er involvert i gastrsyresekresjon, en evolusjonær konservert prosess hvis presise rolle er dårlig forstått. Dette dokumentet beskriver forbedringer i den nåværende protokollen som brukes til å analyse for forsuring av den voksne Drosophila melanogaster tarmen og viser at den kan brukes på andre arter av fluer. Spesielt viser dette papiret at tarmforsuring er avhengig av flyets ernæringsstatus og presenterer en protokoll basert på dette nye funnet. Samlet sett viser denne protokollen den potensielle nytten av å studere Drosophila kobberceller for å avdekke generelle prinsipper som ligger til grunn for mekanismene for tarmforsuring.

Introduction

I insekts tarmen deler kobberceller cellulære og funksjonelle likheter med de syreproduserende mageparietalcellene (også kjent som oksytisk) av pattedyrets mage. Denne gruppen av celler frigjør syre i tarmlumen. Funksjonen av syresekresjon og anatomi er evolusjonært bevart. De viktigste komponentene i den utladede syren er saltsyre og kaliumklorid. Den kjemiske mekanismen for syredannelse i cellene avhenger av karbonanhydrase. Dette enzymet genererer en bikarbonation fra CO2 og vann, som frigjør en hydroksylion som deretter slippes ut i lumen gjennom en protonpumpe i bytte mot kalium. Klorid- og kaliumioner transporteres inn i lumen ved konduktivanskanaler som resulterer i dannelse av saltsyre og kaliumklorid, hovedkomponenten i magesaft1,2,3,4.

Selv om mekanismene for syredannelse er godt forstått, er mye mindre kjent om de fysiologiske mekanismene som regulerer syresekresjon. Målet med å utvikle denne metoden er å bidra til bedre å avgrense de cellulære banene som koordinerer syredannelse og sekresjon og bestemmer syrens rolle i å formidle tarmfysiologi og homeostase. Begrunnelsen bak utviklingen og bruken av denne teknikken er å gi en konsekvent og pålitelig metode for å studere prosessen med tarmforsuring i Drosophila og ikke-modellorganismer. Selv om en standardprotokoll for å bestemme Drosophila midgut-forsuring for tiden eksisterer2,5,6, ble det observert betydelig variasjon i omfanget av forsuring i villtype (WT) fluer mens du bruker denne protokollen for å studere kobbercellefunksjon. For å forstå grunnlaget for denne observerte variasjonen og oppnå konsistente resultater, ble flere aspekter av standardprotokollen optimalisert som beskrevet nedenfor.

Protocol

MERK: Standard laboratorielinje Oregon R ble brukt som en WT-kontroll. Alle fluer ble oppdrettet på standard maismelassemedium (som inneholder melasse, agar, gjær, maismel, tegosept, propionsyre og vann) ved romtemperatur med 12/12 t lys / mørk døgnrytme. 1. Forberedelse til analysen Samle kvinnelige fluer (0-2 dager gamle, ikke-jomfru) under CO2 anestesi og la dem gjenopprette på standard maismel mat i minst 3 dager før eksperimenter. Sult…

Representative Results

Vi sultet Oregon R kvinnelige fluer i mer enn 20 timer og matet dem deretter mat supplert med BPB (2%) i ~ 12 timer, som beskrevet tidligere7,8,9,10,11. Bromophenol blå (BPB) er en pH-sensing fargestoff. Den skifter fra gul ved pH 3,0 til blå ved pH 4.6 og over. Etter tarm disseksjon, som tidligere rapportert, ble det funnet at noen fluer produserte syre som…

Discussion

Et kritisk skritt i denne protokollen er riktig disseksjon av tarmen for å visualisere CCR for forsuring fenotype. Syren som frigjøres fra kobbercellene er begrenset til CCR når tarmen er intakt. Men under disseksjonen kan lekkasje forårsaket av brudd i tarmen føre til diffusjon av syre fra CCR og resultere i at tarmen feilaktig skårer som et negativt for forsuring. I tillegg falmer den gule fargen som indikerer forsuring innen 5-10 min etter disseksjon, og understreker viktigheten av å score tarmer for forsurings…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne erkjenner at støtte til arbeid i forfatterens laboratorium er gitt av en HHMI Faculty Scholar Award og oppstartsmidler fra Children’s Research Institute ved UT Southwestern Medical Center.

Materials

Bromophenol blue Sigma-Aldrich B0126
cellSens software Olympus Image aqusition (https://www.olympus-lifescience.com/en/software/cellsens)
D. simulans Drosophila Species Stock Center at the University of California Riverside California1 (https://www.drosophilaspecies.com/)
D. erecta Drosophila Species Stock Center at the University of California Dere cy1(https://www.drosophilaspecies.com/)
D. pseudoobscura Drosophila Species Stock Center at the University of California Eugene, Oregon(https://www.drosophilaspecies.com/)
D. mojavensis Drosophila Species Stock Center at the University of California Chocolate Mountains, California (https://www.drosophilaspecies.com/)
Forceps Inox Biology Catalog# 11252-20
Fuji Fuji Image processing (https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html)
Glass slide VWR Catalog#16005-108
Kim wipes Tissue Kimtech
Microscope and camera Olympus SZ61 microscope equipped with an Olympus D-27 digital camera Imaging
Oregon R Bloomington Drosophila Stock (https://bdsc.indiana.edu/ # 2376)
Petri dishes Fisher Scientific Catalog #FB0875713A
Phosphate-buffered Saline (PBS) HyClone Catalog # SH30258.01
Stereomicroscope Olympus SZ51 Visual magnification

References

  1. Hollander, F. The composition and mechanism of formation of gastric acid secretion. Science. 110 (2846), 57-63 (1949).
  2. Forte, J. G., Zhu, L. Apical recycling of the gastric parietal cell H, K-ATPase. Annual Review of Physiology. 72, 273-296 (2010).
  3. Samuelson, L. C., Hinkle, K. L. Insights into the regulation of gastric acid secretion through analysis of genetically engineered mice. Annual Review of Physiology. 65, 383-400 (2003).
  4. Yao, X., Forte, J. G. Cell biology of acid secretion by the parietal cell. Annual Review of Physiology. 65, 103-131 (2003).
  5. Driver, I., Ohlstein, B. Specification of regional intestinal stem cell identity during Drosophila metamorphosis. Development. 141 (9), 1848-1856 (2014).
  6. Overend, , et al. Molecular mechanism and functional significance of acid generation in the Drosophila midgut. Scientific Reports. 6, 27242 (2016).
  7. Shanbhag, S., Tripathi, S. Epithelial ultrastructure and cellular mechanisms of acid and base transport in the Drosophila midgut. Journal of Experimental Biology. 212, 1731-1744 (2009).
  8. Dubreuil, R. R. Copper cells and stomach acid secretion in the Drosophila midgut. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 36 (5), 745-752 (2004).
  9. Martorell, , et al. Conserved mechanisms of tumorigenesis in the Drosophila adult midgut. PLoS ONE. 9 (2), 88413 (2014).
  10. Strand, M., Micchelli, C. A. Regional control of Drosophila gut stem cell proliferation: EGF establishes GSSC proliferative set point & controls emergence from quiescence. PLoS One. 8 (11), 80608 (2013).
  11. Storelli, G., et al. Drosophila perpetuates nutritional mutualism by promoting the fitness of its intestinal symbiont Lactobacillus plantarum. Cell Metabolism. 27 (2), 362-377 (2018).
  12. Abu, F., et al. Communicating the nutritional value of sugar in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (12), 2829-2838 (2018).
  13. Blecker, U., Gold, B. D. Gastritis and ulcer disease in childhood. European Journal of Pediatrics. 158 (7), 541-546 (1999).
check_url/63141?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Abu, F., Ohlstein, B. Monitoring Gut Acidification in the Adult Drosophila Intestine. J. Vis. Exp. (176), e63141, doi:10.3791/63141 (2021).

View Video