Övervakning av tarmförsurning i den vuxna Drosophila Intestine

Summary

Här presenterar vi ett standardiserat protokoll för övervakning av gut försurning i Drosophila melanogaster med optimal utgång. Vi använder först detta protokoll för tarmförsurning övervakning i Drosophila melanogaster och sedan visa dess användning i icke-modell Drosophila arter.

Abstract

Fruktflugan midgut består av flera regioner, som var och en består av celler som utför unika fysiologiska funktioner som krävs för att tarmen ska fungera korrekt. En sådan region, kopparcellsområdet (CCR), är lokaliserad till mitten av mitten av geväret och består delvis av en grupp celler som kallas kopparceller. Kopparceller är involverade i magsyrautsöndring, en evolutionärt bevarad process vars exakta roll är dåligt förstådd. Detta dokument beskriver förbättringar i det nuvarande protokollet som används för att analysera försurning av den vuxna Drosophila melanogaster gut och visar att det kan användas på andra arter av flugor. I synnerhet visar detta dokument att tarmförsurning är beroende av flugans näringsstatus och presenterar ett protokoll baserat på detta nya fynd. Sammantaget visar detta protokoll den potentiella nyttan av att studera Drosophila kopparceller för att avslöja allmänna principer som ligger till grund för mekanismerna för gut försurning.

Introduction

I insektsmagen delar kopparceller cellulära och funktionella likheter med de syraproducerande magparietala cellerna (även känd som oxyntic) i däggdjursmagen. Denna grupp av celler släpper ut syra i tarmlumen. Funktionen av syrautsöndring och anatomi bevaras evolutionärt. De viktigaste komponenterna i den urladdade syran är saltsyra och kaliumklorid. Den kemiska mekanismen för syrabildning i cellerna beror på kolsyrahydras. Detta enzym genererar en bikarbonatjon från _CO2 och vatten, som frigör en kolxyljon som sedan släpps ut i lumen genom en protonpump i utbyte mot kalium. Klorid och kaliumjoner transporteras in i lumen genom ledningskanaler som resulterar i bildandet av saltsyra och kaliumklorid, huvudkomponenten i magsaft1,2,3,4.

Även om mekanismerna för syrabildning är väl förstådda, är mycket mindre känt om de fysiologiska mekanismerna som reglerar sur utsöndring. Målet med att utveckla denna metod är att hjälpa till att bättre avgränsa de cellulära vägarna som samordnar syrabildning och utsöndring och bestämma syrans roll för att medla tarmfysiologi och homeostas. Grunden bakom utvecklingen och användningen av denna teknik är att tillhandahålla en konsekvent och pålitlig metod för att studera processen för tarmförsurning i Drosophila och icke-modellorganismer. Även om det för närvarande finns ett standardprotokoll för bestämning av Drosophila midgut-försurning2,5,6, observerades signifikant variabilitet i omfattningen av försurning i vilda (WT) flugor när man använde detta protokoll för att studera kopparcellsfunktionen. För att förstå grunden för denna observerade variabilitet och få konsekventa resultat optimerades flera aspekter av standardprotokollet enligt beskrivningen nedan.

Protocol

OBS: Standardlaboratoriumlinjen Oregon R användes som en WT-kontroll. Alla flugor uppfödds på standard majsmjöl-melass medium (innehållande melass, agar, jäst, majsmjöl, tegosept, propionsyra och vatten) vid rumstemperatur med 12/12 h ljus /mörk dygnsrytm. 1. Förberedelser för analysen Samla kvinnliga flugor (0-2 dagar gamla, icke-jungfruliga) under CO2-anestesi och låt dem återhämta sig på standard majsmjölsmat i minst 3 dagar före experim…

Representative Results

Vi svalt Oregon R kvinnliga flugor i mer än 20 h och sedan mata dem med mat kompletterad med BPB (2%) för ~ 12 h, som beskrivits tidigare7,8,9,10,11. Bromofenolblå (BPB) är ett pH-avkännande färgämne. Den ändras från gult vid pH 3,0 till blått vid pH 4,6 och högre. Efter tarmdisekering, som tidigare rapporterats, visade sig vissa flugor producera sy…

Discussion

Ett kritiskt steg i detta protokoll är korrekt dissekering av tarmen för att visualisera CCR för försurning fenotyp. Syran som frigörs från kopparcellerna begränsas till CCR när tarmen är intakt. Under dissekering kan läckage som orsakas av bristning i tarmarna leda till diffusion av syra från CCR och resultera i en tarm som felaktigt poängsatts som en negativ försurning. Dessutom bleknar den gula färgen som indikerar försurning inom 5-10 min efter dissekering, vilket understryker vikten av att poängsätt…

Materials

Bromophenol blue	Sigma-Aldrich		B0126
cellSens software	Olympus		Image aqusition (https://www.olympus-lifescience.com/en/software/cellsens)
D. simulans	Drosophila Species Stock Center at the University of California		Riverside California1 (https://www.drosophilaspecies.com/)
D. erecta	Drosophila Species Stock Center at the University of California		Dere cy1(https://www.drosophilaspecies.com/)
D. pseudoobscura	Drosophila Species Stock Center at the University of California		Eugene, Oregon(https://www.drosophilaspecies.com/)
D. mojavensis	Drosophila Species Stock Center at the University of California		Chocolate Mountains, California (https://www.drosophilaspecies.com/)
Forceps	Inox Biology		Catalog# 11252-20
Fuji	Fuji		Image processing (https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html)
Glass slide	VWR		Catalog#16005-108
Kim wipes Tissue	Kimtech
Microscope and camera	Olympus SZ61 microscope equipped with an Olympus D-27 digital camera		Imaging
Oregon R	Bloomington Drosophila Stock		(https://bdsc.indiana.edu/ # 2376)
Petri dishes	Fisher Scientific		Catalog #FB0875713A
Phosphate-buffered Saline (PBS)	HyClone		Catalog # SH30258.01
Stereomicroscope	Olympus SZ51		Visual magnification