Ex Utero Kultur af museembryoner fra prægastrulation til avanceret organogenese
Summary
En forbedret platform for helembryokultur muliggør kontinuerlig og robust ex utero-udvikling af museembryoner efterimplantation i op til seks dage, fra prægastrulationsstadier til avanceret organogenese. I denne protokol beskriver vi standardproceduren for vellykket embryokultur ved hjælp af statiske plader og roterende flaskesystemer.
Abstract
Metoder til dyrkning af pattedyr efterimplantation har generelt været ineffektive og begrænset til korte perioder efter dissektion ud af livmoderen. Platforme er for nylig blevet udviklet til meget robust og langvarig ex utero-kultur af museembryoner fra ægcylinderstadier til avanceret organogenese. Disse platforme muliggør en hensigtsmæssig og trofast udvikling af prægaststyrende embryoner (E5.5) indtil bagbensdannelsestrinnet (E11). Sengassende embryoner (E7.5) dyrkes i roterende flasker i disse indstillinger, mens udvidet kultur fra prægastrulationsstadier (E5.5 eller E6.5) kræver en kombination af statiske og roterende flaskekulturer. Derudover er følsom regulering af O2 – og CO2-koncentration , gastryk, glukoseniveauer og brugen af et specifikt ex utero-dyrkningsmedium afgørende for korrekt embryonudvikling. Her tilvejebringes en detaljeret trin-for-trin protokol for udvidet embryokultur med ex utero-mus . Evnen til at dyrke normale museembryoner ex utero fra gastrulation til organogenese repræsenterer et værdifuldt redskab til at karakterisere effekten af forskellige eksperimentelle forstyrrelser under embryonal udvikling.
Introduction
Intrauterin udvikling af pattedyrembryoet har begrænset undersøgelsen af de tidlige stadier af postimplantationsudvikling1,2. Utilgængeligheden af det udviklende embryo hæmmer forståelsen af vigtige udviklingsprocesser, der forekommer efter embryoimplantaterne i livmoderen, såsom etablering af dyrekropsplanen, specifikation af kimlagene eller dannelse af væv og organer. Desuden gør den meget lille størrelse af det tidlige postimplanterede embryo det vanskeligt at observere ved intravital billeddannelse i livmoderen før E103. Manglende evne til at observere og manipulere levende embryoner på disse stadier har begrænset undersøgelsen af tidlig postimplantationsembryogenese til øjebliksbilleder under udvikling.
Protokoller for in vitro-dyrkning af præimplantationsfottedyrs embryoner er veletablerede, pålidelige og anvendes regelmæssigt4. Ikke desto mindre havde forsøg på at etablere ex utero-dyrkningssystemer, der kunne understøtte korrekt embryonvækst efter pattedyrs postimplantation, begrænset succes5. En række forskellige dyrkningsteknikker er blevet foreslået i over et århundrede, hovedsagelig ved at dyrke embryonerne i konventionelle statiske plader6,7,8 eller roterende flasker (rullekulturer)5,9,10. Disse platforme viste sig nyttige til at udvide viden om pattedyrs udvikling efter implantation11,12, på trods af at de var yderst ineffektive for normal embryooverlevelse og begrænset til korte perioder. Embryonerne begyndte at vise udviklingshæmning og morfologiske anomalier allerede 24-48 timer efter kulturinitiering.
Denne undersøgelse giver en detaljeret beskrivelse af oprettelsen af ex utero embryokultursystemet, der muliggør kontinuerlig udvikling fra prægastrulation til avancerede organogenesestadier over op til seks dages postimplantationsudvikling13. Dette papir beskriver den forbedrede rullekulturprotokol, der understøtter væksten af E7,5-embryoner (neural plade og hovedfold-stadium) indtil bagbensdannelsestrinnet (~ E11) og den udvidede kultur fra E5.5 / E6.5 ved at kombinere kultur på statiske plader og rullekulturplatforme.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den kulturprotokol, der præsenteres heri, kan opretholde korrekt og kontinuerlig udvikling af museembryoer ex utero i op til seks dage, fra E5.5 til E11. Tidligere kunne embryoner på disse udviklingsstadier kun udvikle sig normalt i kultur i korte perioder (op til 48 timer)15. Koblingen af gasreguleringsmodulet til rullekulturinkubatoren for præcis kontrol af iltkoncentration og hyperbart gastryk er afgørende for den korrekte museembryokultur, der er beskrevet heri. Forøgelse af gast…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev finansieret af Pascal og Ilana Mantoux; Det Europæiske Forskningsråd (EFR-CoG-2016 726497-Cellnaivety); Flight Attendant Medical Research Council (FAMRI); Israel Cancer Research Fund (ICRF) professorat, BSF, Helen og Martin Kimmel Institute for Stem Cell Research, Helen og Martin Kimmel Award for Innovative Investigation; Israel Science Foundation (ISF), Minerva, Sherman Institute for Medicinal Chemistry, Nella og Leon Benoziyo Center for Neurologiske Sygdomme, David og Fela Shapell Family Center for Genetic Disorders Research, Kekst Family Institute for Medical Genetics, Dr. Beth Rom-Rymer Stem Cell Research Fund, Edmond de Rothschild Foundations, Zantker Charitable Foundation, Estate of Zvia Zeroni.
Materials
| 0.22 µm pore size filter (250 mL) | JetBiofil | FCA-206-250 | |
| 0.22 µm pore size syringe PVDF filter | Millipore | SLGV033RS | |
| 8-well µ-plates glass bottom/ibiTreat | iBidi | 80827/80826 | |
| Bottle with adaptor cap for gas inlet | Arad Technologies | ||
| Bungs (Hole) | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 06 | Used to seal the bottles to the drum |
| Bungs (Solid) | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 07 | Used to seal the rotating drum |
| Culture bottles | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 03/BTC 04 | Either Glass Bottles (Small) BTC 03 or Glass Bottles (Large) BTC 04 |
| D(+)-glucose Monohydrate | J.T. Baker | ||
| Diamond knife | Fine Science Tools | 10100-30/45 | |
| Digital Pressure Gauge | Shanghai Benxu Electronics Technology co. Ltd | BX-DPG80 | |
| DMEM | GIBCO | 11880 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Biological industries | 02-020-1A | |
| Fetal Bovine Serum | Biological industries | 04-013-1A | |
| Gas regulation module | Arad Technologies | HannaLab1 | |
| Glutamax | GIBCO | 35050061 | glutamine |
| Graefe forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| HEPES | GIBCO | 15630056 | |
| Microsurgical forceps (Dumont #5, #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Pasteur pipettes (glass) | Hilgenberg | 3150102 | |
| Pasteur pipettes (plastic) | Alexred | SO P12201 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biological industries | 03-031-1B | |
| Petri Dishes (60 mm and 100 mm) | Falcon | 351007/351029 | |
| Precision incubator system | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC01 | BTC01 model with gas bubbler kit |
| Pro-coagulant sterile test tubes (5 mL) | Greiner Bio-One | #456005 | |
| Rat whole embryo culture serum | ENVIGO Bioproducts | B-4520 | |
| Stereoscopic microscope equipped with heating plate | Nikon | SMZ18 | |
| Sterile syringes (5, 10 ml) for sera filtration | Pic Solution | ||
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14094-11 |
References
- New, D. A. Whole-embryo culture and the study of mammalian embryos during organogenesis. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 53 (1), 81-122 (1978).
- Tam, P. P., Behringer, R. R. Mouse gastrulation: the formation of a mammalian body plan. Mechanisms of Development. 68 (1-2), 3-25 (1997).
- Huang, Q., et al. Intravital imaging of mouse embryos. Science. 368 (6487), 181-186 (2020).
- White, M. D., et al. Long-lived binding of Sox2 to DNA predicts cell fate in the four-cell mouse embryo. Cell. 165 (1), 75-87 (2016).
- Tam, P. P. Postimplantation mouse development: whole embryo culture and micro-manipulation. International Journal of Developmental Biology. 42 (7), 895-902 (1998).
- Nicholas, J. S., Rudnick, D. The development of rat embryos in tissue culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 20 (12), 656-658 (1934).
- New, D. A., Stein, K. F. Cultivation of mouse embryos in vitro. Nature. 199, 297-299 (1963).
- Rivera-Pérez, J. A., Jones, V., Tam, P. P. L. Culture of whole mouse embryos at early postimplantation to organogenesis stages: developmental staging and methods. Methods in Enzymology. 476, 185-203 (2010).
- New, D. A. T., Coppola, P. T., Terry, S. Culture of explanted rat embryos in rotating tubes. Journal of Reproduction and Fertility. 35 (1), 135-138 (1973).
- Cockroft, D. L. A comparative and historical review of culture methods for vertebrates. International Journal of Developmental Biology. 41 (12), 127-137 (1997).
- Parameswaran, M., Tam, P. P. L. Regionalisation of cell fate and morphogenetic movement of the mesoderm during mouse gastrulation. Developmental Genetics. 17 (1), 16-28 (1995).
- Beddington, R. S. Induction of a second neural axis by the mouse node. Development. 120 (3), 613-620 (1994).
- Aguilera-Castrejon, A., et al. Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis. Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).
- Takahashi, M., Makino, S., Kikkawa, T., Osumi, N. Preparation of rat serum suitable for mammalian whole embryo culture. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51969 (2014).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. Isolation, culture and manipulation of postimplantation embryos. Manipulating the Mouse Embryo: a Laboratory Manual. , 149-193 (2014).
- Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation. Development, Growth and Differentiation. 50 (6), 485-497 (2008).
- Mathieu, J., Ruohola-Baker, H. Metabolic remodeling during the loss and acquisition of pluripotency. Development. 144 (4), 541-551 (2017).
- Sturm, K., Tam, P. P. L. Isolation and culture of whole postimplantation embryos and germ layer derivatives. Methods in Enzymology. 225, 164-190 (1993).
