पूर्व गर्भाशय माउस भ्रूण की संस्कृति Pregastrulation से उन्नत Organogenesis करने के लिए

Summary

पूरे भ्रूण संस्कृति के लिए एक बढ़ाया मंच छह दिनों तक पोस्टइम्प्लांटेशन माउस भ्रूण के निरंतर और मजबूत पूर्व गर्भाशय विकास की अनुमति देता है, प्रीगैस्ट्रुलेशन चरणों से उन्नत ऑर्गेनोजेनेसिस तक। इस प्रोटोकॉल में, हम स्थैतिक प्लेटों और घूर्णन बोतल प्रणालियों का उपयोग करके सफल भ्रूण संस्कृति के लिए मानक प्रक्रिया का विस्तार करते हैं।

Abstract

पोस्टइम्प्लांटेशन स्तनधारी भ्रूण संस्कृति विधियां आम तौर पर अक्षम रही हैं और गर्भाशय से बाहर विच्छेदन के बाद संक्षिप्त अवधि तक सीमित हैं। प्लेटफार्मों को हाल ही में उन्नत ऑर्गेनोजेनेसिस तक अंडे-सिलेंडर चरणों से माउस भ्रूण की अत्यधिक मजबूत और लंबे समय तक पूर्व गर्भाशय संस्कृति के लिए विकसित किया गया है। ये प्लेटफ़ॉर्म हिंद अंग गठन चरण (E11) तक pregastrulating भ्रूण (E5.5) के उचित और वफादार विकास को सक्षम करते हैं। देर से gastrulating भ्रूण (E7.5) इन सेटिंग्स में घूर्णन बोतलों में उगाया जाता है, जबकि pregastrulation चरणों (E5.5 या E6.5) से विस्तारित संस्कृति को स्थैतिक और घूर्णन बोतल संस्कृतियों के संयोजन की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, _O2 और _CO2 एकाग्रता, गैस दबाव, ग्लूकोज के स्तर, और एक विशिष्ट पूर्व गर्भाशय संस्कृति माध्यम का उपयोग का संवेदनशील विनियमन उचित भ्रूण विकास के लिए महत्वपूर्ण है। यहां, विस्तारित पूर्व गर्भाशय माउस भ्रूण संस्कृति के लिए एक विस्तृत चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रदान किया गया है। सामान्य माउस भ्रूण को विकसित करने की क्षमता गैस्ट्रुलेशन से ऑर्गेनोजेनेसिस तक पूर्व गर्भाशय भ्रूण विकास के दौरान विभिन्न प्रयोगात्मक गड़बड़ी के प्रभाव की विशेषता के लिए एक मूल्यवान उपकरण का प्रतिनिधित्व करती है।

Introduction

स्तनधारी भ्रूण के अंतर्गर्भाशयी विकास ने पोस्टइम्प्लांटेशन विकास के शुरुआती चरणों के अध्ययन को सीमित कर दिया ^है1,2। विकासशील भ्रूण की दुर्गमता गर्भाशय में भ्रूण प्रत्यारोपण के बाद होने वाली प्रमुख विकास प्रक्रियाओं की समझ को बाधित करती है, जैसे कि पशु शरीर की योजना की स्थापना, रोगाणु परतों का विनिर्देश, या ऊतकों और अंगों का गठन। इसके अलावा, प्रारंभिक पोस्टरिप्लांटेड भ्रूण का बहुत छोटा आकार ई ¹⁰³ से पहले गर्भाशय में इंट्रावाइटल इमेजिंग द्वारा निरीक्षण करना मुश्किल बनाता है। इन चरणों में जीवित भ्रूणों का निरीक्षण करने और हेरफेर करने में असमर्थता ने विकास के दौरान स्नैपशॉट के लिए प्रारंभिक पोस्टइम्प्लांटेशन भ्रूणजनन के अध्ययन को सीमित कर दिया है।

प्रीइम्प्लांटेशन स्तनधारी भ्रूण की इन विट्रो संस्कृति के लिए प्रोटोकॉल अच्छी तरह से स्थापित, विश्वसनीय और नियमित रूप से उपयोग किए जाते ^हैं4। फिर भी, उचित स्तनधारी पोस्टइम्प्लांटेशन भ्रूण विकास का समर्थन करने में सक्षम पूर्व गर्भाशय संस्कृति प्रणालियों को स्थापित करने के प्रयासों में सीमित सफलता ^मिली। एक सदी से अधिक समय से विभिन्न संस्कृति तकनीकों का प्रस्ताव किया गया है, मुख्य रूप से पारंपरिक स्थैतिक प्लेटों ^6,7,8 या घूर्णन बोतलों (रोलर संस्कृतियों) ^5,9,10 में भ्रूण को संवर्धित करके। ये प्लेटफ़ॉर्म सामान्य भ्रूण अस्तित्व के लिए अत्यधिक अक्षम होने और छोटी अवधि तक सीमित होने के बावजूद, आरोपण ^11,12 के बाद स्तनधारी विकास पर ज्ञान का विस्तार करने में सहायक साबित हुए। भ्रूण ने संस्कृति दीक्षा के बाद 24-48 घंटे की शुरुआत में विकासात्मक मंदता और रूपात्मक विसंगतियों को प्रदर्शित करना शुरू कर दिया।

यह अध्ययन पूर्व गर्भाशय भ्रूण संस्कृति प्रणाली की स्थापना के लिए एक विस्तृत विवरण प्रदान करता है जो प्रीगैस्ट्रुलेशन से उन्नत ऑर्गेनोजेनेसिस चरणों तक निरंतर विकास की अनुमति देता है, जो पोस्टइम्प्लांटेशन विकास के छह दिनों तक होता ^है। यह पेपर बेहतर रोलर संस्कृति प्रोटोकॉल का वर्णन करता है जो ई 7.5 भ्रूण (तंत्रिका प्लेट और हेडफोल्ड-स्टेज) के विकास का समर्थन करता है जब तक कि हिंद अंग गठन चरण (~ E11) और स्थिर प्लेटों और रोलर संस्कृति प्लेटफार्मों पर संस्कृति के संयोजन से E5.5 / E6.5 से विस्तारित संस्कृति।

Protocol

सभी पशु प्रयोगों को Weizmann Institute of Science के पशु संरक्षण दिशानिर्देशों के अनुसार किया गया था और प्रासंगिक Weizmann Institute IACUC (#01390120-1, 01330120-2, 33520117-2) द्वारा अनुमोदित किया गया था। स्वस्थ गर्भवती महिलाओं को अपनी गर्भनाल से रक्त एकत…

Representative Results

E7.5 भ्रूण (देर से gastrulation चरण) के लिए वर्णित रोलर संस्कृति की स्थिति 4 संस्कृति दिनों के बाद 75% के करीब औसत दक्षता के साथ निरंतर और सामान्य भ्रूण विकास का समर्थन करती है (चित्रा 2 और तालिका 1)। भ्…

Discussion

यहां प्रस्तुत संस्कृति प्रोटोकॉल E5.5 से E11 तक छह दिनों तक उचित और निरंतर माउस भ्रूण विकास पूर्व गर्भाशय को बनाए रख सकता है। पहले, इन विकासात्मक चरणों में भ्रूण केवल छोटी अवधि (48 ज तक) ¹⁵ के लिए सं?…

Materials

0.22 µm pore size filter (250 mL)	JetBiofil	FCA-206-250
0.22 µm pore size syringe PVDF filter	Millipore	SLGV033RS
8-well µ-plates glass bottom/ibiTreat	iBidi	80827/80826
Bottle with adaptor cap for gas inlet	Arad Technologies
Bungs (Hole)	B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering	BTC 06	Used to seal the bottles to the drum
Bungs (Solid)	B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering	BTC 07	Used to seal the rotating drum
Culture bottles	B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering	BTC 03/BTC 04	Either Glass Bottles (Small) BTC 03 or Glass Bottles (Large) BTC 04
D(+)-glucose Monohydrate	J.T. Baker
Diamond knife	Fine Science Tools	10100-30/45
Digital Pressure Gauge	Shanghai Benxu Electronics Technology co. Ltd	BX-DPG80
DMEM	GIBCO	11880
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Biological industries	02-020-1A
Fetal Bovine Serum	Biological industries	04-013-1A
Gas regulation module	Arad Technologies	HannaLab1
Glutamax	GIBCO	35050061	glutamine
Graefe forceps	Fine Science Tools	11052-10
HEPES	GIBCO	15630056
Microsurgical forceps (Dumont #5, #55)	Fine Science Tools	11255-20
Pasteur pipettes (glass)	Hilgenberg	3150102
Pasteur pipettes (plastic)	Alexred	SO P12201
Penicillin/Streptomycin	Biological industries	03-031-1B
Petri Dishes (60 mm and 100 mm)	Falcon	351007/351029
Precision incubator system	B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering	BTC01	BTC01 model with gas bubbler kit
Pro-coagulant sterile test tubes (5 mL)	Greiner Bio-One	#456005
Rat whole embryo culture serum	ENVIGO Bioproducts	B-4520
Stereoscopic microscope equipped with heating plate	Nikon	SMZ18
Sterile syringes (5, 10 ml) for sera filtration	Pic Solution
Surgical scissors	Fine Science Tools	14094-11