Ex Utero Kultur av musembryon från pregastrulation till avancerad organogenes
Summary
En förbättrad plattform för helembryonkultur möjliggör kontinuerlig och robust ex utero-utveckling av postimplantationmusembryon i upp till sex dagar, från pregastrulationsstadier till avancerad organogenes. I detta protokoll beskriver vi standardproceduren för framgångsrik embryokultur med statiska plattor och roterande flasksystem.
Abstract
Postimplantation däggdjur embryo kultur metoder har i allmänhet varit ineffektiva och begränsade till korta perioder efter dissekering ut ur livmodern. Plattformar har nyligen utvecklats för mycket robust och långvarig ex utero kultur av musembryon från äggcylinderstadier till avancerad organogenes. Dessa plattformar möjliggör lämplig och trogen utveckling av förgastrullerande embryon (E5.5) fram till bildandet av bakben (E11). Sena gastrulaterande embryon (E7.5) odlas i roterande flaskor i dessa miljöer, medan utökad odling från förgastrulationsstadier (E5.5 eller E6.5) kräver en kombination av statiska och roterande flaskkulturer. Dessutom är känslig reglering av O2– och CO2-koncentration, gastryck, glukosnivåer och användning av ett specifikt ex utero-odlingsmedium avgörande för korrekt embryoutveckling. Här tillhandahålls ett detaljerat steg-för-steg-protokoll för utökad ex utero-musembryonkultur. Förmågan att odla normala musembryon ex utero från gastrulation till organogenes representerar ett värdefullt verktyg för att karakterisera effekten av olika experimentella störtben under embryonal utveckling.
Introduction
Intrauterin utveckling av däggdjursembryon har begränsat studien av de tidiga stadierna av postimplantation utveckling1,2. Det utvecklande embryots otillgänglighet hindrar förståelsen av viktiga utvecklingsprocesser som uppstår efter embryoimplantaten i livmodern, såsom upprättandet av djurkroppsplanen, specifikation av bakterieskikten eller bildandet av vävnader och organ. Dessutom gör den mycket lilla storleken på det tidiga postimplanterade embryot det svårt att observera genom intravital avbildning in utero före E103. Oförmågan att observera och manipulera levande embryon i dessa skeden har begränsat studien av tidig postimplantation embryogenesis till ögonblicksbilder under utvecklingen.
Protokoll för in vitro-kultur av preimplantation däggdjur embryon är väl etablerade, tillförlitliga och regelbundet används4. Försök att upprätta ex utero kultur system som kan stödja korrekt däggdjur postimplantation embryo tillväxt hade dock begränsad framgång5. En mängd olika kulturtekniker har föreslagits i över ett sekel, främst genom att odla embryona i konventionella statiska plattor6,7,8 eller roterande flaskor (rullkulturer)5,9,10. Dessa plattformar visade sig vara till hjälp för att utöka kunskapen om däggdjursutveckling efter implantation11,12, trots att de var mycket ineffektiva för normal embryoöverlevnad och begränsade till korta perioder. Embryona började visa utvecklingsmässiga retardation och morfologiska anomalier så tidigt som 24-48 h efter kulturinitiering.
Denna studie ger en detaljerad beskrivning för att inrätta ex utero embryo kultursystem som möjliggör kontinuerlig utveckling från pregastrulation till avancerade organogenes stadier under upp till sex dagar av postimplantation utveckling13. Detta dokument beskriver det förbättrade rullkulturprotokollet som stöder tillväxten av E7.5 embryon (neurala plattor och huvudfold-stadium) fram till bakbenet bildas scenen (~ E11) och den utökade kulturen från E5.5/E6.5 genom att kombinera kultur på statiska plattor och rullkultur plattformar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Odlingsprotokollet som presenteras häri kan upprätthålla korrekt och kontinuerlig utveckling av musembryon ex utero i upp till sex dagar, från E5.5 till E11. Tidigare kunde embryon i dessa utvecklingsstadier utvecklas normalt i kultur endast under korta perioder (upp till 48 h)15. Kopplingen av gasregleringsmodulen till rullodlingsinkubatorn för exakt kontroll av syrekoncentration och övertrycksgastryck är avgörande för den korrekta musembryonkulturen som beskrivs häri. Att öka…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete finansierades av Pascal och Ilana Mantoux; Europeiska forskningsrådet (ERC-Cog-2016 726497-cellnaivety); Flygvärdinnans medicinska forskningsråd (FAMRI); Professur i Israel Cancer Research Fund (ICRF), BSF, Helen och Martin Kimmel Institute for Stem Cell Research, Helen och Martin Kimmel Award for Innovative Investigation; Israel Science Foundation (ISF), Minerva, Sherman Institute for Medicinal Chemistry, Nella och Leon Benoziyo Center for Neurological Diseases, David och Fela Shapell Family Center for Genetic Disorders Research, Kekst Family Institute for Medical Genetics, Dr. Beth Rom-Rymer Stem Cell Research Fund, Edmond de Rothschild Foundations, Zantker Charitable Foundation, Estate of Zvia Zeroni.
Materials
| 0.22 µm pore size filter (250 mL) | JetBiofil | FCA-206-250 | |
| 0.22 µm pore size syringe PVDF filter | Millipore | SLGV033RS | |
| 8-well µ-plates glass bottom/ibiTreat | iBidi | 80827/80826 | |
| Bottle with adaptor cap for gas inlet | Arad Technologies | ||
| Bungs (Hole) | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 06 | Used to seal the bottles to the drum |
| Bungs (Solid) | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 07 | Used to seal the rotating drum |
| Culture bottles | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 03/BTC 04 | Either Glass Bottles (Small) BTC 03 or Glass Bottles (Large) BTC 04 |
| D(+)-glucose Monohydrate | J.T. Baker | ||
| Diamond knife | Fine Science Tools | 10100-30/45 | |
| Digital Pressure Gauge | Shanghai Benxu Electronics Technology co. Ltd | BX-DPG80 | |
| DMEM | GIBCO | 11880 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Biological industries | 02-020-1A | |
| Fetal Bovine Serum | Biological industries | 04-013-1A | |
| Gas regulation module | Arad Technologies | HannaLab1 | |
| Glutamax | GIBCO | 35050061 | glutamine |
| Graefe forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| HEPES | GIBCO | 15630056 | |
| Microsurgical forceps (Dumont #5, #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Pasteur pipettes (glass) | Hilgenberg | 3150102 | |
| Pasteur pipettes (plastic) | Alexred | SO P12201 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biological industries | 03-031-1B | |
| Petri Dishes (60 mm and 100 mm) | Falcon | 351007/351029 | |
| Precision incubator system | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC01 | BTC01 model with gas bubbler kit |
| Pro-coagulant sterile test tubes (5 mL) | Greiner Bio-One | #456005 | |
| Rat whole embryo culture serum | ENVIGO Bioproducts | B-4520 | |
| Stereoscopic microscope equipped with heating plate | Nikon | SMZ18 | |
| Sterile syringes (5, 10 ml) for sera filtration | Pic Solution | ||
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14094-11 |
References
- New, D. A. Whole-embryo culture and the study of mammalian embryos during organogenesis. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 53 (1), 81-122 (1978).
- Tam, P. P., Behringer, R. R. Mouse gastrulation: the formation of a mammalian body plan. Mechanisms of Development. 68 (1-2), 3-25 (1997).
- Huang, Q., et al. Intravital imaging of mouse embryos. Science. 368 (6487), 181-186 (2020).
- White, M. D., et al. Long-lived binding of Sox2 to DNA predicts cell fate in the four-cell mouse embryo. Cell. 165 (1), 75-87 (2016).
- Tam, P. P. Postimplantation mouse development: whole embryo culture and micro-manipulation. International Journal of Developmental Biology. 42 (7), 895-902 (1998).
- Nicholas, J. S., Rudnick, D. The development of rat embryos in tissue culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 20 (12), 656-658 (1934).
- New, D. A., Stein, K. F. Cultivation of mouse embryos in vitro. Nature. 199, 297-299 (1963).
- Rivera-Pérez, J. A., Jones, V., Tam, P. P. L. Culture of whole mouse embryos at early postimplantation to organogenesis stages: developmental staging and methods. Methods in Enzymology. 476, 185-203 (2010).
- New, D. A. T., Coppola, P. T., Terry, S. Culture of explanted rat embryos in rotating tubes. Journal of Reproduction and Fertility. 35 (1), 135-138 (1973).
- Cockroft, D. L. A comparative and historical review of culture methods for vertebrates. International Journal of Developmental Biology. 41 (12), 127-137 (1997).
- Parameswaran, M., Tam, P. P. L. Regionalisation of cell fate and morphogenetic movement of the mesoderm during mouse gastrulation. Developmental Genetics. 17 (1), 16-28 (1995).
- Beddington, R. S. Induction of a second neural axis by the mouse node. Development. 120 (3), 613-620 (1994).
- Aguilera-Castrejon, A., et al. Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis. Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).
- Takahashi, M., Makino, S., Kikkawa, T., Osumi, N. Preparation of rat serum suitable for mammalian whole embryo culture. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51969 (2014).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. Isolation, culture and manipulation of postimplantation embryos. Manipulating the Mouse Embryo: a Laboratory Manual. , 149-193 (2014).
- Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation. Development, Growth and Differentiation. 50 (6), 485-497 (2008).
- Mathieu, J., Ruohola-Baker, H. Metabolic remodeling during the loss and acquisition of pluripotency. Development. 144 (4), 541-551 (2017).
- Sturm, K., Tam, P. P. L. Isolation and culture of whole postimplantation embryos and germ layer derivatives. Methods in Enzymology. 225, 164-190 (1993).
