Drosophila Passiv unngåelsesatferd som et nytt paradigme for å studere assosiativ aversiv læring
Summary
Dette arbeidet beskriver et enkelt atferdsparadigme som tillater analyse av aversiv assosiativ læring i voksne fruktfluer. Metoden er basert på å undertrykke den medfødte negative geotaxis-oppførselen på grunn av sammenhengen mellom en bestemt miljøkontekst og et elektrisk støt.
Abstract
Denne protokollen beskriver et nytt paradigme for å analysere aversiv assosiativ læring i voksne fluer (Drosophila melanogaster). Paradigmet er analogt med passiv unngåelsesadferd hos laboratoriegnagere der dyr lærer å unngå et rom der de tidligere har fått et elektrisk støt. Analysen utnytter negativ geotaxis i fluer, noe som manifesterer seg som en trang til å klatre opp når de plasseres på en vertikal overflate. Oppsettet består av vertikalt orienterte øvre og nedre rom. På den første prøven plasseres en flue i et nedre rom hvorfra den vanligvis går ut innen 3-15 s, og går inn i det øvre rommet der den mottar et elektrisk støt. I løpet av den andre studien, 24 timer senere, økes ventetiden betydelig. Samtidig reduseres antall støt sammenlignet med den første studien, noe som indikerer at fluer dannet langsiktig minne om det øvre rommet. Opptakene av ventetider og antall støt kan utføres med en teller og en stoppeklokke eller med en Arduino-basert enkel enhet. For å illustrere hvordan analysen kan brukes, ble den passive unngåelsesatferden til D. melanogaster og D. simulans mann og kvinne karakterisert her. Sammenligning av ventetider og antall sjokk viste at både D. melanogaster og D. simulans flyr effektivt lærte den passive unngåelsesatferden. Det ble ikke observert statistiske forskjeller mellom mannlige og kvinnelige fluer. Menn var imidlertid litt raskere mens de kom inn i det øvre rommet i den første studien, mens kvinner fikk et litt høyere antall støt i hver oppbevaringsstudie. Det vestlige kostholdet (WD) svekket læring og minne betydelig hos mannlige fluer mens flyøvelse motvektet denne effekten. Samlet sett tilbyr den passive unngåelsesatferden i fluer en enkel og reproduserbar analyse som kan brukes til å studere grunnleggende mekanismer for læring og minne.
Introduction
Læring og hukommelse er en evolusjonært gammel tilpasningsmekanisme for miljøet, bevart fra Drosophila (D.) til human1. Fruktfluen er en robust modellorganisme for å studere grunnleggende prinsipper for læring og hukommelse, da den tilbyr et bredt spekter av kraftige genetiske verktøy for å dissekere iboende molekylære mekanismer2. De banebrytende genetiske screeningstudiene, som identifiserte rutabaga3-, amnesiac4– og dunce5-gener som var kritiske for læring og hukommelse2, benyttet seg av olfaktorisk kondisjonering da fruktfluene er avhengige av deres ivrige luktesans for å finne mat, potensielle kamerater og for å unngå rovdyr6.
Olfaktorisk kondisjonering har blitt et populært paradigme for å studere mekanismen for læring og hukommelse, takket være innføringen av olfaktorisk T-labyrint av Tully og Quinn7,8. Deretter er det foreslått andre metoder for å måle ulike typer læring og hukommelse, inkludert visuell kondisjonering9, frierikondisjonering10, aversiv fototaxis undertrykkelse assay11, og vepseksponering kondisjonering12. Imidlertid har de fleste av disse analysene et komplekst oppsett som må bygges på et universitetsverksted eller kjøpes gjennom en leverandør. Paradigmet beskrevet her er basert på en enkel atferdsanalyse for å studere aversiv assosiativ læring i fluer som lett kan monteres med noen få tilgjengelige forsyninger.
Det beskrevne paradigmet tilsvarer passiv (eller hemmende) unngåelsesatferd hos laboratoriemus og rotter der dyr lærer å unngå et rom der de tidligere har fått elektrisk fotsjokk13. I murider er prosedyren basert på deres medfødte unngåelse av sterkt lys og preferanse for mørkere områder14. På den første studien plasseres dyret i det lyse rommet, hvorfra dyret raskt går ut, går inn i et mørkt rom, hvor et elektrisk fotsjokk leveres. Vanligvis er en enkelt studie tilstrekkelig til å danne et solidt langsiktig minne, noe som resulterer i betydelig økt ventetid 24 timer senere. Ventetiden brukes deretter som en indeks over dyrets evne til å huske sammenhengen mellom den aversive stimulansen og det spesifikke miljøet15.
Dette arbeidet beskriver en analog prosedyre ved hjelp av D. som et modellsystem som gir flere fordeler i forhold til gnagermodeller, inkludert kostnadseffektivitet, større prøvestørrelse, fravær av regulatorisk tilsyn og tilgang til kraftige genetiske verktøy16,17. Prosedyren er basert på negativ geotaxis oppførsel, som manifesterer seg i fluenes trang til å klatre opp når de er plassert på en vertikal overflate18. Oppsettet består av to vertikale kamre. På den første rettssaken plasseres en fruktflue i et lavere rom. Derfra går den vanligvis ut innen 3-15 s, og går inn i det øvre rommet der den får elektrisk støt. I løpet av en 1 min prøve kan noen fluer av og til komme inn i det øvre rommet igjen, noe som resulterer i et ekstra elektrisk støt. I testfasen, 24 timer senere, økes ventetiden betydelig. Samtidig reduseres antall støt sammenlignet med den første dagen som indikerer at fluer dannet aversivt assosiativt minne om det øvre rommet. Ventetiden, antall støt og varigheten og frekvensen av grooming bouts brukes deretter til å analysere dyreadferden og evnen til å danne og huske sammenhengen mellom den aversive stimulansen og det spesifikke miljøet. De representative resultatene avslører at eksponering for det vestlige kostholdet (WD) betydelig svekker passiv unngåelsesadferd hos mannlige fluer, noe som tyder på at WD dypt påvirker flyets oppførsel og kognisjon. Omvendt lindret flyøvelse den negative effekten av WD, og forbedret passiv unngåelsesadferd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Unngåelse av truende stimuli er en avgjørende egenskap for adaptiv oppførsel i ulike arter fra C. eleganse til human32. Unngåelseslæringsprosedyrer som vanligvis innebærer rømming av en aversiv hendelse, er ofte brukte atferdsoppgaver for å undersøke lærings- og minneprosesser i laboratoriegnagere13 siden 1970-tallet32. I aktive unngåelsesprosedyrer etterfølges en likegyldig stimulus eller betinget signal (CS) av en aversiv hende…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble støttet i deler av NIH R15ES029673 (AKM).
Materials
| Bloomington Formulation diet | Nutri-Fly | 66-112 | Available from Genesee Scientific Inc., San Diego, CA |
| 1000 µL Blue tip | Fisher | NC9546243 | |
| 17 x 100 mm 14 mL polypropylene culture tube | VWR | 60818-689 | |
| Aduino-based Automatic Kontrol Module | In-house | AKM-007 | This unit is optional. Complete description, schematics, wiring diagram and a code are provided at the ECU Digital Market – https://digitalmarket.ecu.edu/akmmodule |
| Dual-Display 2-Channel Digital Clock/Timer | Digi-Sense | AO-94440-10 | https://www.amazon.com/Cole-Parmer-AO-94440-10-Dual-Display-2-Channel-Jumbo-Digit/dp/B00PR0809G/ref=sr_1_5?dchild=1&keywords=Dual-Display+timer+jumbo&qid=1627660660&sr= 8-5#customerReviews |
| Electronic Finger Counter | N/A | N/A | https://www.amazon.com/gp/product/B01M8IRK6F/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1 |
| Fisherbrand Sparkleen 1 Detergent | Fisher Scientific | 04-320-4 | |
| Fly mouth aspirator | In-house | Prepared as described in reference 19. | |
| Grass S88 stimulator | N/A | N/A | Could be replaced with any stimulator which can provide described parameters |
| Kim-wipes | Fisher Scientific | 06-666 | Kimberly-Clark Professional 34120 |
| Metal block for fly immobilization | In-house | 4 x 13 x 23.5cm aluminum block | |
| Nutiva USDA Certified Organic, non-GMO, Red Palm Oil | Nutiva | N/A | https://www.amazon.com/Nutiva-Certified-Cold-Filtered-Unrefined-Ecuadorian/dp/B00JJ1E83G/ref=sxts_rp_s1_0?cv_ct_cx=Nutiva+USDA+Certified+Organic%2C+non-GMO%2C+Red+Palm+Oil&dchild=1&keywords=Nutiva+USDA+Certified+Organic%2C+non-GMO%2C+Red+Palm+Oil&pd_rd_i=B00JJ1E83G&pd_ rd_r=f35e9d2f-afe4-44b6-afc2-1c9cd705be18&pd_rd_w= R3Zb4&pd_rd_wg=eUv1m&pf_rd_ p=c6bde456-f877-4246-800f-44405f638777&pf _rd_r=M94N11RC7NH333EMJ66Y &psc=1&qid=1627661533&sr=1-1-f0029781-b79b-4b60-9cb0-eeda4dea34d6 |
| Shock tube | CelExplorer | TMA-201 | https://www.celexplorer.com/product_detail.asp?id=217&MainType=110&SubType=8 |
| Stopwatch | Accusplit | A601XLN | https://www.amazon.com/gp/product/B0007ZGZYI/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1 |
| Transparent vinyl tubing (3/4” OD, 5/8” ID) | Lowes | Avaiable from Lowes |
References
- Kandel, E. R., Dudai, Y., Mayford, M. R. The molecular and systems biology of memory. Cell. 157 (1), 163-186 (2014).
- McGuire, S. E., Deshazer, M., Davis, R. L. Thirty years of olfactory learning and memory research in Drosophila melanogaster. Progress in Neurobiology. 76 (5), 328-347 (2005).
- Livingstone, M. S., Sziber, P. P., Quinn, W. G. Loss of calcium/calmodulin responsiveness in adenylate cyclase of rutabaga, a Drosophila learning mutant. Cell. 37 (1), 205-215 (1984).
- Quinn, W. G., Sziber, P. P., Booker, R. The Drosophila memory mutant amnesiac. Nature. 277 (5693), 212-214 (1979).
- Dudai, Y., Jan, Y. N., Byers, D., Quinn, W. G., Benzer, S. dunce, a mutant of Drosophila deficient in learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73 (5), 1684-1688 (1976).
- Busto, G. U., Cervantes-Sandoval, I., Davis, R. L. Olfactory learning in Drosophila. Physiology. 25 (6), 338-346 (2010).
- Tully, T., Quinn, W. G. Classical conditioning and retention in normal and mutant Drosophila melanogaster. Journal of Comparative Physiology. A: Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 157 (2), 263-277 (1985).
- Wright, N. J. Evolution of the techniques used in studying associative olfactory learning and memory in adult Drosophila in vivo: A historical and technical perspective. Invertebrate Neuroscience. 14 (1), 1-11 (2014).
- Vogt, K., Yarali, A., Tanimoto, H. Reversing stimulus timing in visual conditioning leads to memories with opposite valence in Drosophila. PloS One. 10 (10), 0139797 (2015).
- Koemans, T. S., et al. Drosophila courtship conditioning as a measure of learning and memory. Journal of Visualized Experiments. (124), e55808 (2017).
- Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. Journal of Visualized Experiments. (49), e2504 (2011).
- Bozler, J., et al. A systems level approach to temporal expression dynamics in Drosophila reveals clusters of long term memory genes. Plos Genetics. 13 (10), 1007054 (2017).
- Atucha, E., Roozendaal, B. The inhibitory avoidance discrimination task to investigate accuracy of memory. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 9, 60 (2015).
- Thiels, E., Hoffman, E. K., Gorin, M. B. A reliable behavioral assay for the assessment of sustained photophobia in mice. Current Eye Research. 33 (5), 483-491 (2008).
- Detrait, E. R., Hanon, E., Dardenne, B., Lamberty, Y. The inhibitory avoidance test optimized for discovery of cognitive enhancers. Behavior Research Methods. 41 (3), 805-811 (2009).
- Piper, M. D. W., Partridge, L. Drosophila as a model for ageing. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease. 1864 (9), 2707-2717 (2018).
- Chalmers, J., et al. A multicomponent screen for feeding behaviour and nutritional status in Drosophila to interrogate mammalian appetite-related genes. Molecular Metabolism. 43, 101127 (2021).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental Gerontology. 40 (5), 386-395 (2005).
- Yang, D. Simple homemade tools to handle fruit flies-Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (149), e59613 (2019).
- Barradale, F., Sinha, K., Lebestky, T. Quantification of Drosophila grooming behavior. Journal of Visualized Experiments. (125), e55231 (2017).
- Denmark, A., et al. The effects of chronic social defeat stress on mouse self-grooming behavior and its patterning. Behavioural Brain Research. 208 (2), 553-559 (2010).
- Kalueff, A. V., et al. Neurobiology of rodent self-grooming and its value for translational neuroscience. Nature Reviews: Neuroscience. 17 (1), 45-59 (2016).
- Motulsky, H. . Intuitive biostatistics: A nonmathematical guide to statistical thinking. Fourth edition. , (2018).
- Qiao, B., Li, C., Allen, V. W., Shirasu-Hiza, M., Syed, S. Automated analysis of long-term grooming behavior in Drosophila using a k-nearest neighbors classifier. Elife. 7, 34497 (2018).
- Mu, M. D., et al. A limbic circuitry involved in emotional stress-induced grooming. Nature Communications. 11 (1), 2261 (2020).
- Song, C., Berridge, K. C., Kalueff, A. V. Stressing’ rodent self-grooming for neuroscience research. Nature Reviews: Neuroscience. 17 (9), 591 (2016).
- Wang, C., Chan, J. S., Ren, L., Yan, J. H. Obesity reduces cognitive and motor functions across the lifespan. Neural Plasticity. 2016, 2473081 (2016).
- Lewis, A. R., Singh, S., Youssef, F. F. Cafeteria-diet induced obesity results in impaired cognitive functioning in a rodent model. Heliyon. 5 (3), 01412 (2019).
- Yohn, S. E., Galbraith, J., Calipari, E. S., Conn, P. J. Shared behavioral and neurocircuitry disruptions in drug addiction, obesity, and binge eating disorder: Focus on Group I mGluRs in the mesolimbic dopamine pathway. ACS Chemical Neuroscience. 10 (5), 2125-2143 (2019).
- Lopez-Taboada, I., Gonzalez-Pardo, H., Conejo, N. M. Western Diet: Implications for brain function and behavior. Frontiers in Psychololgy. 11, 564413 (2020).
- Murashov, A. K., et al. Preference and detrimental effects of high fat, sugar, and salt diet in wild-caught Drosophila simulans are reversed by flight exercise. FASEB Bioadvances. 3 (1), 49-64 (2021).
- Krypotos, A. M., Effting, M., Kindt, M., Beckers, T. Avoidance learning: A review of theoretical models and recent developments. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 9, 189 (2015).
- Binder, M. D., Hirokawa, N., Windhorst, U. . Encyclopedia of Neuroscience. , 3093 (2009).
- Mery, F., Belay, A. T., So, A. K., Sokolowski, M. B., Kawecki, T. J. Natural polymorphism affecting learning and memory in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (32), 13051-13055 (2007).
- Tan, Y., Yu, D., Pletting, J., Davis, R. L. Gilgamesh is required for rutabaga-independent olfactory learning in Drosophila. Neuron. 67 (5), 810-820 (2010).
- Ögren, S. O., Stiedl, O., Stolerman, I. P. . Encyclopedia of Psychopharmacology. , 960-967 (2010).
