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Summary
Este trabalho descreve um simples paradigma comportamental que permite a análise da aprendizagem associativa aversiva em moscas de frutas adultas. O método baseia-se na supressão do comportamento geotaxis negativo inato devido à associação formada entre um contexto ambiental específico e um choque elétrico.
Abstract
Este protocolo descreve um novo paradigma para a análise do aprendizado associativo aversivo em moscas adultas (Drosophila melanogaster). O paradigma é análogo ao comportamento de evasão passiva em roedores de laboratório nos quais os animais aprendem a evitar um compartimento onde já receberam um choque elétrico. O ensaio se aproveita de geotaxis negativos em moscas, que se manifesta como uma vontade de subir quando são colocadas em uma superfície vertical. A configuração consiste em compartimentos superiores e inferiores orientados verticalmente. No primeiro teste, uma mosca é colocada em um compartimento inferior de onde geralmente sai dentro de 3-15 s, e entra no compartimento superior onde recebe um choque elétrico. Durante o segundo julgamento, 24 horas depois, a latência é significativamente aumentada. Ao mesmo tempo, o número de choques é reduzido em comparação com o primeiro ensaio, indicando que as moscas formaram memória de longo prazo sobre o compartimento superior. As gravações de latências e número de choques poderiam ser realizadas com um contador de contagem e um cronômetro ou com um dispositivo simples baseado em Arduino. Para ilustrar como o ensaio pode ser utilizado, o comportamento passivo de evasão de D. melanogaster e D. simulados masculino e feminino foram caracterizados aqui. A comparação das latências e o número de choques revelou que tanto d. melanogaster quanto D. simulados voam eficientemente aprendeu o comportamento de evasão passiva. Não foram observadas diferenças estatísticas entre moscas do sexo masculino e feminino. No entanto, os machos foram um pouco mais rápidos ao entrar no compartimento superior no primeiro ensaio, enquanto as fêmeas receberam um número ligeiramente maior de choques em todos os testes de retenção. A dieta ocidental (WD) prejudicou significativamente o aprendizado e a memória em moscas machos, enquanto o exercício de voo contrabalançava esse efeito. Em conjunto, o comportamento de evasão passiva em moscas oferece um ensaio simples e reprodutível que poderia ser usado para estudar mecanismos básicos de aprendizagem e memória.
Introduction
O aprendizado e a memória são um mecanismo de adaptação evolutivamente antigo ao meio ambiente, conservado de Drosophila (D.) para humano1. A mosca-das-frutas é um organismo modelo robusto para estudar princípios fundamentais de aprendizagem e memória, pois oferece uma ampla gama de poderosas ferramentas genéticas para dissecar mecanismos moleculares intrínsecos2. Os pioneiros estudos de triagem genética, que identificaram os genes rutabaga3, amnésiac4 e dunce5 críticos para o aprendizado e memória2, aproveitaram-se do condicionamento olfativo à medida que as moscas das frutas dependem de seu agudo olfato para encontrar comida, potenciais companheiros e evitar predadores6.
O condicionamento olfativo tornou-se um paradigma popular para estudar o mecanismo de aprendizagem e memória, graças à introdução do olfativo T-maze por Tully e Quinn7,8. Posteriormente, foram propostos outros métodos para medir vários tipos de aprendizagem e memória, incluindo condicionamento visual9, condicionamento de namoro10, ensaio de supressão de fototaxis aversiva11 e condicionamento de exposição de vespas12. No entanto, a maioria desses ensaios tem uma configuração complexa que deve ser feita sob medida em uma oficina universitária ou comprada através de um fornecedor. O paradigma descrito aqui baseia-se em um simples ensaio comportamental para estudar o aprendizado associativo aversivo em moscas que podem ser facilmente montados com alguns suprimentos disponíveis.
O paradigma descrito equivale ao comportamento passivo (ou inibitório) de evasão em ratos e ratos de laboratório em que os animais aprendem a evitar um compartimento onde já receberam choque elétrico no pé13. Em murids, o procedimento baseia-se em sua prevenção inata de luz brilhante e preferência por áreas mais escuras14. No primeiro ensaio, o animal é colocado no compartimento brilhante, de onde o animal sai rapidamente, entrando em um compartimento escuro, onde um choque elétrico no pé é entregue. Normalmente, um único ensaio é suficiente para formar uma memória sólida de longo prazo, resultando em uma latência significativamente aumentada 24 h depois. A latência é então usada como um índice da capacidade do animal de lembrar a associação entre o estímulo aversivo e o ambiente específico15.
Este trabalho descreve um procedimento análogo usando D. como um sistema de modelo que oferece várias vantagens sobre modelos de roedores, incluindo custo-efetividade, maior tamanho amostral, ausência de supervisão regulatória e acesso a poderosas ferramentas genéticas16,17. O procedimento é baseado no comportamento geotaxis negativo, que se manifesta na necessidade das moscas de subir quando são colocadas em uma superfície vertical18. A configuração consiste em duas câmaras verticais. No primeiro ensaio, uma mosca-das-frutas é colocada em um compartimento inferior. A partir daí, geralmente sai dentro de 3-15 s, pisando no compartimento superior onde recebe um choque elétrico. Durante um teste de 1 min, algumas moscas podem ocasionalmente reentrar no compartimento superior, o que resulta em um choque elétrico adicional. Durante a fase de testes, 24 horas depois, a latência é significativamente aumentada. Ao mesmo tempo, o número de choques é reduzido em comparação com o primeiro dia indicando que as moscas formaram memória associativa aversiva sobre o compartimento superior. A latência, o número de choques e a duração e frequência das crises de preparação são então usados para analisar o comportamento animal e a capacidade de formar e lembrar a associação entre o estímulo aversivo e o ambiente específico. Os resultados representativos revelam que a exposição à dieta ocidental (WD) prejudica significativamente o comportamento de evasão passiva em moscas masculinas, sugerindo que o WD impacta profundamente o comportamento e a cognição da mosca. Por outro lado, o exercício de voo aliviou o efeito negativo do WD, melhorando o comportamento de evasão passiva.
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Protocol
1. Preparação de aparelhos de evasão passiva
- Perfurar um perpendicular de 4 mm na superfície da parede do tubo de cultura de polipropileno de 14 mL e 8 mm de distância do fundo do tubo.
NOTA: Use uma broca elétrica e uma broca de 5/32 para obter melhores resultados. - Usando uma faca de aço, corte a parte superior do tubo de cultura de polipropileno de 14 mL para criar um fragmento inferior do tubo de 45 mm de comprimento. O fragmento inferior serve como compartimento inferior.
- Corte a ponta de 1.000 μL de ponta de pipeta azul usando uma lâmina de barbear de borda única para tornar a abertura larga o suficiente para uma passagem de uma única mosca. Corte a parte de estreitamento da ponta azul para criar um fragmento de 12 mm. Insira este fragmento firmemente em um orifício de 4 mm do compartimento inferior. Isto é usado como uma doca de carregamento para transferir as moscas.
- Corte um pedaço de 15 mm de tubo de vinil transparente de 5/8" ID (ver Tabela de Materiais) para criar um acoplamento. Insira compartimento superior e inferior no acoplamento de extremidades opostas para fixar com segurança o compartimento inferior ao compartimento superior.
- Usando um grampo ajustável de 2 pinos, conecte o conjunto a um suporte vertical. Oriente a montagem verticalmente com o tubo de choque como compartimento superior.
- Conecte os fios do tubo de choque a um estimulador elétrico (ver Tabela de Materiais) para fornecer choques elétricos. A duração do período de treinamento é de 1 min.
NOTA: Para facilitar a observação, posicione um pedaço de papel branco atrás do tubo de choque para servir como fundo branco do aparelho. Coloque uma lâmpada com uma lâmpada macia equivalente a 75 W acima do compartimento de choque. Coloque uma lâmpada de lupa de braço ajustável na frente da configuração. Uma representação do aparelho de evasão passiva é mostrada na Figura 1.
2. Preparação das moscas para o procedimento de evasão passiva
- Imobilize 3-4 dias de idade D. melanogaster ou D. simulados voa usando bloco gelado e transfira-os para frascos individuais com comida 24 horas antes do experimento (1 mosca por frasco) seguindo o procedimento descrito anteriormente19.
NOTA: Os experimentos aqui descritos compararam homem de 3 a 4 dias de idade vs. moscas fêmeas em D. melanogaster e D. simulados. - Antes dos experimentos comportamentais, codam todos os frascos. Para isso, atribua a cada grupo uma letra, por exemplo, "A", "B", "C", etc., e cada um voa um número. Revele esse código somente depois de todos os dados terem sido registrados e analisados. Use pelo menos 20 moscas por genótipo ou tratamento para combater variações individuais.
NOTA: Realizar os experimentos e análises "cegas" permite excluir um viés na avaliação do desempenho da análise de moscas e dados.
3. Realizando o primeiro teste
- Usando um aspirador de boca de mosca (ver Tabela de Materiais) descrito anteriormente20, transfira suavemente uma mosca do frasco individual para o compartimento inferior através da doca de carregamento. Levemente chupar uma mosca no aspirador da boca sugando o ar. Deposite a mosca soprando levemente na doca de carregamento.
NOTA: Evite estressar o animal durante a captura e o carregamento. - Imediatamente após a mosca ser carregada no compartimento inferior, inicie um cronômetro de 1 min e cronômetro.
NOTA: O cronômetro é usado para medir latências e contador de contagem para contar o número de choques. - Pressione o cronômetro para gravar a primeira latência quando a mosca entrar no tubo de choque colocando todas as patas na grade. Ligue o estimulador para dar um choque elétrico na mosca. Os parâmetros de estimulação são 120 volts, 1000 ms de duração, 1 pulso/s (PPS), duração do trem de 2000 ms.
- Entregue choques adicionais se a mosca reentrar no tubo de choque. Registo o número de choques recebidos durante um teste de 1 min com um contador de contagem ou um contador baseado em Arduino (ver Tabela de Materiais). Se estiver usando o contador baseado em Arduino, siga os passos abaixo.
NOTA: Um dispositivo opcional baseado em Arduino AKM-007 (ver Tabela de Materiais) pode ser usado para medir o tempo, a latência, o número de choques e a frequência e duração dos ataques de preparação para cada animal pressionando e liberando os botões correspondentes no dispositivo. Os botões do dispositivo são atribuídos para medir a latência, administrar e registrar o número de choques e medir a frequência e duração dos ataques de preparação.- Pressione o botão Iniciar na etapa 3.2.e pressione o botão Choque na etapa 3.3.
- Para gravar a duração de uma luta de preparação, pressione o botão Grooming no início de uma luta de preparação no dispositivo e solte este botão no final da luta de preparação.
NOTA: As lutas de preparação foram medidas ao longo de 1 min de teste. O preparo extensivo pode ser indicativo de estresse animal21,22. O dispositivo baseado em Arduino salva todos os dados como arquivo CSV em um cartão de memória.
- No final de um teste de 1 min, transfira suavemente a mosca de volta para um frasco individual. Anote a latência, o número de choques recebidos e quaisquer mudanças notáveis no comportamento.
- Limpe o compartimento inferior e de choque com 70% de etanol, limpe com um tecido de limpeza sem fiapos (ver Tabela de Materiais) e seque com o secador de cabelo. Repita o julgamento com a próxima mosca.
- Após os experimentos comportamentais, limpe o compartimento inferior com água e detergente inodoro. Limpe o compartimento inferior e o compartimento de choque com 70% de etanol, e a seco durante a noite.
4. Realizando o segundo teste
- Realize o segundo ensaio repetindo o procedimento descrito acima (etapa 3) 24 h depois. Teste as moscas na mesma sequência do dia anterior.
5. Análise dos resultados
- Calcule a latência média, o número médio de choques e a duração das lutas de preparação para o ensaio 1 e o teste 2 para cada grupo experimental de animais. Realize o teste t estudantil para comparação em dois grupos ou ANOVA para múltiplas comparações com análises pós-hoc usando o teste de Tukey23.
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Representative Results
A evasão passiva foi estudada em D. melanogaster (Canton-S) e D. simulados. Os experimentos compararam as latências e o número de choques recebidos entre ensaios consecutivos. Inicialmente, os experimentos foram realizados com moscas d. melanogaster machos de 3 a 4 dias de idade. As moscas foram mantidas na dieta padrão de formulação bloomington em um ambiente climatizado a 24 °C sob um ciclo claro-escuro de 12 horas, 70% de umidade e densidade populacional controlada. A densidade foi controlada mantendo as condições de reprodução constantes para todos os grupos. 15 machos e 15 fêmeas foram criados por 48 h em uma garrafa a 24 °C, 70% de umidade e um ciclo de luz de 12h para gerar a prole. O comportamento de evasão passiva em uma mosca-das-frutas foi estudado em quatro ensaios de 2 min espaçados 24 h de distância. Os ensaios foram realizados na mesma hora do dia. Uma mosca foi gentilmente aspirada a partir de um frasco individual durante um ensaio e transferida para o compartimento inferior através de uma doca de carregamento (Figura 1). Os experimentos revelaram que D. melanogaster poderia aprender e memorizar com sucesso o comportamento de evasão passiva. No primeiro ensaio, a mosca ingênua entraria no compartimento superior em média dentro de 16 s (16,15±2,64) e frequentemente reentrava nele, recebendo em média 2 choques (2,18±0,19). Durante os ensaios consecutivos, a latência aumentaria significativamente enquanto o número de choques diminuiria, indicando que as moscas aprenderam associação entre o compartimento superior e um choque elétrico (Tabela 1, Figura 2 A,B). A análise da distribuição de frequências mostrou que o geotaxis negativo é uma motivação poderosa. Durante o primeiro teste, a maioria das moscas ingênuas entraria no compartimento superior dentro de 5-15 s (bin 10, Figura 2C) e receberia 1-3 choques (Figura 2D). Em contraste, a maioria das moscas não entraria no compartimento superior no quarto ensaio e correspondentemente não receberia nenhum choque (Figura 2E,F).
Para verificar se o ensaio de evasão passiva funciona em outras espécies de moscas-das-frutas, os experimentos foram repetidos em moscas machos e fêmeas mantidas sob as mesmas condições de moradia que as moscas melanogaster descritas acima. A duração do ensaio foi reduzida para 1 min. A distribuição de frequência para latências mostrou claramente que se a mosca não entra no compartimento superior dentro dos 60 s no primeiro ensaio, geralmente não entra em tudo (Figura 3C). O número de ensaios foi reduzido a três, pois os experimentos descritos acima demonstraram de forma confiável que mesmo um único ensaio era suficiente para uma mosca formar associações aversivas. D. simuladores machos e fêmeas moscas foram ambos eficazes na aprendizagem do comportamento de evasão passiva, como evidente a partir dos dados nos gráficos e tabelas (Figura 3, Figura 4; e Tabela 2, Tabela 3).
A comparação das latências e o número de choques entre machos e fêmeas não revelou diferenças estatisticamente significativas (Figura 5 A,B). No entanto, as moscas machos foram um pouco mais rápidas entrando no compartimento superior no primeiro ensaio, enquanto as fêmeas receberam um número ligeiramente maior de choques em cada ensaio (Figura 4A,B). A diferença foi particularmente evidente nos gráficos que ilustram distribuições de frequência (Figura 4C-F). A distribuição de frequência de latências no terceiro ensaio indicou que a maioria das moscas entrou no compartimento superior dentro de 7,5-12,5 s (Figura 4E). A distribuição de frequência para o número de choques no terceiro ensaio mostra que as moscas fêmeas receberam em média 1-2 choques no último ensaio (Figura 4F).
A duração total do comportamento de preparação também foi registrada durante os ensaios. O comportamento de preparação de moscas consiste em repetidos movimentos coordenados de patas dianteiras e patas traseiras varrendo as asas, cabeça e corpo24. O auto-preparo, também conhecido como auto-grooming, já foi anteriormente ligado ao estresse comportamental em moscas24, roedores de laboratório25 e humanos22. Portanto, estudos de comportamento auto-preparador podem fornecer insights sobre os comportamentos relacionados à ansiedade26. A análise da duração total das lutas de preparação durante os ensaios de evasão passiva revelou que o auto-aliciamento foi significativamente aumentado em moscas femininas nos ensaios dois e três (Figura 5C, Tabela 4).
Evidências crescentes sugerem uma associação entre WD de alta caloria e desempenho cognitivo prejudicado27. Experimentalmente, o WD produz efeitos adversos na função cerebral mitocondrial, neurogênese e plasticidade sináptica28,29,30. Um estudo recente documentou que o WD aumenta triglicérides e reduz a vida útil em D., enquanto o exercício de voo contrabalança o efeito prejudicial do WD31. Para começar a explorar os efeitos do WD e do exercício de voo sobre o comportamento de evasão passiva, d. simulados moscas machos foram submetidos a 5 dias de WD, exercício de voo ou uma combinação de WD e exercício de voo de acordo com protocolos descritos anteriormente31. O WD, contendo 15% de Nutiva USDA Certified Organic, non-OGM, Red Palm Oil, 15% Sucrose e 0,1M NaCl, foi preparado como publicado em outros lugares31. O exercício de voo foi realizado em grupos de sessenta moscas machos abrigados em tambores de plástico transparente de 1 galão amarrados a uma plataforma horizontal presa a um motor elétrico e operados por um temporizador. O exercício foi realizado diariamente durante 7h durante 5 dias, conforme publicado anteriormente31. Ao final do regime de dieta e exercício de 5 dias, as moscas foram classificadas em frascos individuais sob anestesia fria e submetidas a dois ensaios de comportamento de evasão passiva. Os experimentos mostraram que o WD aumenta o número de choques recebidos nos ensaios um e dois e diminui a latência no segundo ensaio, indicando que o WD prejudica significativamente o aprendizado associativo aversivo em moscas (Figura 6, Tabela 5). Houve também uma tendência de queda no número de choques no segundo ensaio em um grupo com a combinação de WD e exercício, sugerindo que o exercício pode mitigar o impacto da sobrecarga calórica.
Figura 1: Esquema ilustrando ensaio de evasão passiva. As dimensões inferiores do compartimento têm 45 mm de comprimento e 17 mm de diâmetro externo. As dimensões do compartimento superior têm 80 mm de comprimento e 18 mm de diâmetro externo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Comportamento de evasão passiva em D. melanogaster masculino. (A) Latência média (s) por ensaio. O gráfico mostra que as latências aumentam significativamente com o número de ensaios. O número de moscas é indicado em cada barra. (B) Um número médio de choques recebidos por ensaio. O gráfico mostra que o número de choques diminui significativamente com o número de ensaios. (C) Distribuição de frequência exibindo o número de moscas dentro de uma caixa de latências no primeiro ensaio. Os números no eixo x são centros de lixo. As lixeiras são intervalos (0-5 s, 5-15 s, 15-25 s, etc.). O gráfico indica que a maioria das moscas entra no compartimento superior dentro de 5-15 s. (D) Distribuição de frequência exibindo o número de moscas dentro de uma caixa de choques no primeiro ensaio. Os números no eixo x são centros de lixo. O gráfico indica que a maioria das moscas recebe choques de 1-3 no primeiro teste. Poucas moscas não entraram no compartimento de choque no primeiro teste e não receberam choques. Eles foram excluídos dos julgamentos subsequentes. (E) Distribuição de frequência exibindo o número de moscas dentro de uma caixa de latências no quarto ensaio. O gráfico indica que a maioria das moscas não entra no compartimento superior. (F) Distribuição de frequência exibindo o número de moscas dentro de uma caixa de choques no quarto ensaio. O gráfico mostra que a maioria das moscas recebe 0 choques no último julgamento. Abreviaturas: ns- não-insignificante, *- P<0,05, **- P<0.01, ***-P<0.001, ****- P<0.0001. ANOVA unidirecional com o teste de múltiplas comparações de Tukey. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Comportamento de evasão passiva em D. simulam homens. (A) Latência média (s) por ensaio. O gráfico mostra que as latências aumentam significativamente com o número de ensaios. (B) Um número médio de choques recebidos por ensaio. O gráfico mostra que o número de choques diminui significativamente com o número de ensaios. (C) Distribuição de frequência exibindo o número de moscas dentro de uma caixa de latências no primeiro ensaio. O gráfico indica que a maioria das moscas entra no compartimento superior dentro de 2,5-12,5 s. Os números no eixo x são os centros de lixo. (D) Distribuição de frequência exibindo o número de moscas dentro de uma caixa de choques no primeiro ensaio. O gráfico indica que a maioria das moscas recebe choques de 1-3 no primeiro teste. (E) Distribuição de frequência exibindo o número de moscas dentro de uma caixa de latências no terceiro ensaio. O gráfico indica que a maioria das moscas não entra no compartimento superior. (F) Distribuição de frequência exibindo o número de moscas dentro de uma caixa de choques no terceiro ensaio. O gráfico mostra que a maioria das moscas recebe 0 choques no último julgamento. Abreviaturas: *- P<0,05, ****- P<0.0001. ANOVA unidirecional com o teste de múltiplas comparações de Tukey. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Comportamento de evasão passiva em D. simulam fêmeas. (A) Latência média (s) por ensaio. O gráfico mostra que as latências aumentam significativamente com o número de ensaios. (B) Um número médio de choques recebidos por ensaio. O gráfico mostra que o número de choques diminui significativamente com o número de ensaios. (C) Distribuição de frequência exibindo o número de moscas dentro de uma caixa de latências no primeiro ensaio. O gráfico indica que a maioria das moscas entra no compartimento superior dentro de 2,5-12,5 s. Os números no eixo x são os centros de lixo. (D) Distribuição de frequência exibindo o número de moscas dentro de uma caixa de choques no primeiro ensaio. O gráfico indica que a maioria das moscas recebe 2 choques no primeiro teste. (E) Distribuição de frequência exibindo o número de moscas dentro de uma caixa de latências no terceiro ensaio. O gráfico indica que a maioria das moscas entra no compartimento superior dentro de 7,5-12,5 s. (F) Distribuição de frequência exibindo o número de moscas dentro de uma caixa de choques no terceiro ensaio. O gráfico mostra que a maioria das moscas femininas recebeu choques de 1-2 no último julgamento. Abreviaturas: **- P<0.01, ***-P<0.001, ****- P<0.0001. ANOVA unidirecional com o teste de múltiplas comparações de Tukey. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Comparação do comportamento passivo de evasão e aliciamento em D. simula machos e fêmeas. (A) Latência média (s) por ensaio. O gráfico não mostra diferenças estatisticamente significativas entre machos e fêmeas nas latências. (B) Um número médio de choques recebidos por ensaio. O gráfico não mostra diferenças estatisticamente significativas entre homens e mulheres no número de choques recebidos. (C) A duração total das lutas de preparação em ensaios 1-3. Embora não houvesse diferenças estatisticamente significativas entre machos e fêmeas, as moscas fêmeas apresentaram uma diminuição considerável no comportamento de aliciamento durante os ensaios 2 e 3 em comparação com o ensaio 1. Abreviaturas: *- P<0.05. ANOVA unidirecional com o teste de múltiplas comparações de Tukey. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Efeito do WD no comportamento de evasão passiva do homem. (A) Latência média (s) por ensaio. O gráfico mostra que o WD aumentou significativamente a latência nos grupos WD e WDE. (B) Um número médio de choques recebidos por ensaio. O gráfico mostra um aumento estatisticamente significativo no número de choques recebidos por moscas no WD nos ensaios 1 e 2. Curiosamente, o exercício de voo negou significativamente o efeito do WD de acordo com o teste t do Student. Abreviaturas: Dieta de controle de CD, dieta de controle de CDE com exercício, dieta WD-western, dieta ocidental WDE com exercício. *- P<0,05, **- P<0,01. ANOVA unidirecional com o teste de múltiplas comparações de Tukey. #- P<0,05, Teste t estudantil. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Ensaios | Julgamento 1 | Julgamento 2 | Julgamento 3 | Julgamento 4 |
| Latência (s) | 16.15±2.64 | 49.08±6.2 | 64,72±6,8 | 102.1±12.1 |
| Choques | 2.18±0.19 | 1.41±0.29 | 0,76±0.25 | 0,33±0.22 |
| As múltiplas comparações de Latncy Tukey entre os ensaios | Resumo | Valor P ajustado | ||
| 1 vs. 2 | **** | <0.0001 | ||
| 1 vs. 3 | **** | <0.0001 | ||
| 1 vs. 4 | **** | <0.0001 | ||
| 2 vs. 3 | Ns | 0.2043 | ||
| 2 vs. 4 | **** | <0.0001 | ||
| 3 vs. 4 | ** | 0.0099 | ||
| Choca as múltiplas comparações de Tukey entre os ensaios | Resumo | Valor P ajustado | ||
| 1 vs. 2 | Ns | 0.0646 | ||
| 1 vs. 3 | *** | 0.0004 | ||
| 1 vs. 4 | **** | <0.0001 | ||
| 2 vs. 3 | Ns | 0.2569 | ||
| 2 vs. 4 | * | 0.0253 | ||
| 3 vs. 4 | Ns | 0.694 | ||
Tabela 1: Efeito do treinamento para evitar choque elétrico em D. melanogaster machos. Os dados para latências e choques recebidos são apresentados como meios ± SEM. ANOVA unidirecional com o teste de múltiplas comparações de Tukey.
| Ensaios | Julgamento 1 | Julgamento 2 | Julgamento 3 |
| Latência (s) | 16/10±0.78 | 22.64±2.1 | 30.63±2.69 |
| Choques | 2.36±0.13 | 1,84±0,17 | 1.24±0.14 |
| As múltiplas comparações de Latncy Tukey entre os ensaios | Resumo | Valor P ajustado | |
| 1 vs. 2 | **** | <0.0001 | |
| 1 vs. 3 | **** | <0.0001 | |
| 2 vs. 3 | * | 0.0229 | |
| Choca as múltiplas comparações de Tukey entre os ensaios | Resumo | Valor P ajustado | |
| 1 vs. 2 | * | 0.0166 | |
| 1 vs. 3 | **** | <0.0001 | |
| 2 vs. 3 | * | 0.0172 | |
Tabela 2: Efeito do treinamento para evitar choque elétrico em D. simulados masculinos. Os dados para latências e choques recebidos são apresentados como meios ± SEM. ANOVA unidirecional com o teste de múltiplas comparações de Tukey.
| Ensaios | Julgamento 1 | Julgamento 2 | Julgamento 3 |
| Latência (s) | 12.07±0.89 | 20.98±2.63 | 23.20±2.16 |
| Choques | 2.65±0.12 | 1.98±0.12 | 1.49±0.11 |
| As múltiplas comparações de Latncy Tukey entre os ensaios | Resumo | Valor P ajustado | |
| 1 vs. 2 | ** | 0.0023 | |
| 1 vs. 3 | **** | <0.0001 | |
| 2 vs. 3 | ** | 0.0028 | |
| Choca as múltiplas comparações de Tukey entre os ensaios | Resumo | Valor P ajustado | |
| 1 vs. 2 | **** | <0.0001 | |
| 1 vs. 3 | **** | <0.0001 | |
| 2 vs. 3 | *** | 0.0003 | |
Tabela 3: Efeito do treinamento sobre a prevenção do choque elétrico em D. simulans fêmeas. Os dados para latências e choques recebidos são apresentados como meios ± SEM. ANOVA unidirecional com o teste de múltiplas comparações de Tukey.
| Ensaios | Julgamento 1 | Julgamento 2 | Julgamento 3 |
| Preparação masculina (s) | 14.42±1.02 | 18.47±2.82 | 18.23±2.75 |
| Aliciamento feminino (s) | 9.15±1.39 | 14.03±2.26 | 15:50±2.38 |
| As múltiplas comparações de Tukey entre os homens de ensaios | Resumo | Valor P ajustado | |
| 1 vs. 2 | Ns | 0.4384 | |
| 1 vs. 3 | Ns | 0.4873 | |
| 2 vs. 3 | Ns | 0.9971 | |
| As múltiplas comparações de Tukey entre as fêmeas dos ensaios | Resumo | Valor P ajustado | |
| 1 vs. 2 | * | 0.0299 | |
| 1 vs. 3 | * | 0.0426 | |
| 2 vs.3 | Ns | 0.8481 | |
Tabela 4: Efeito da evasão passiva no comportamento de preparação de simuladores D. Os dados são apresentados como meios ± SEM. ANOVA unidirecional com os múltiplos testes de comparações da Tukey.
| Latências | Julgamento 1 | Julgamento 2 |
| CD | 16.26±2.28 | 45,85±4,09 |
| CDE | 15.28±2.75 | 33.59±5.19 |
| ANÃ BRANCA | 13.49±1.58 | 28.33±3.7 |
| WDE | 13:00±1.95 | 30.23±3.79 |
| Latência As múltiplas comparações de Tukey entre os grupos Trial 1 | Resumo | Valor P ajustado |
| CD vs. CDE | Ns | 0.9916 |
| CD vs. WD | Ns | 0.7369 |
| CD vs. WDE | Ns | 0.6475 |
| CDE vs. WD | Ns | 0.9523 |
| CDE vs. WDE | Ns | 0.9122 |
| WD vs. WDE | Ns | 0.9981 |
| Comparações múltiplas de Latência Tukey entre grupos Trial 2 | Resumo | Valor P ajustado |
| CD vs. CDE | Ns | 0.2785 |
| CD vs. WD | ** | 0.0082 |
| CD vs. WDE | * | 0.0283 |
| CDE vs. WD | Ns | 0.8578 |
| CDE vs. WDE | Ns | 0.9594 |
| WD vs. WDE | Ns | 0.9844 |
| Choques | Julgamento 1 | Julgamento 2 |
| CD | 1.95±0.21 | 0,94±0.4 |
| CDE | 2.0±0.28 | 1.0±0.23 |
| ANÃ BRANCA | 3.05±0.26 | 2.36±0.41 |
| WDE | 2.49±0.24 | 1.36±0.23 |
| Choca as múltiplas comparações de Tukey entre os grupos Trial 1 | Resumo | Valor P ajustado |
| CD vs. CDE | Ns | 0.9992 |
| CD vs. WD | ** | 0.005 |
| CD vs. WDE | Ns | 0.3765 |
| CDE vs. WD | Ns | 0.0523 |
| CDE vs. WDE | Ns | 0.6446 |
| WD vs. WDE | Ns | 0.3268 |
| Choca as múltiplas comparações de Tukey entre os grupos Trial 2 | Resumo | Valor P ajustado |
| CD vs. CDE | Ns | 0.9996 |
| CD vs. WD | * | 0.0194 |
| CD vs. WDE | Ns | 0.8246 |
| CDE vs. WD | * | 0.0122 |
| CDE vs. WDE | Ns | 0.9306 |
| WD vs. WDE | Ns | 0.1508 |
Tabela 5: Efeito do WD e exercício sobre evitar choque elétrico em D. simulados machos. Os dados para latências e choques recebidos são apresentados como meios ± SEM. ANOVA unidirecional com o teste de múltiplas comparações de Tukey. Abreviaturas: Dieta de controle de CD, dieta de controle de CDE com exercício, dieta WD-western, dieta ocidental WDE com exercício.
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Discussion
Evitar estímulos ameaçadores é uma característica crucial do comportamento adaptativo em várias espécies, desde a elegância C. até a humana32. Procedimentos de aprendizagem de evasão que normalmente implicam a fuga de um evento aversivo, são comumente usados tarefas comportamentais para investigar processos de aprendizagem e memória em roedores de laboratório13 desde a década de 1970 32. Em procedimentos de evasão ativa, um estímulo indiferente ou sinal condicionado (CS) é seguido por um evento aversivo ou sinal incondicionado (EUA), que os animais aprendem a evitar realizando uma tarefa comportamental específica. Em procedimentos de evasão passiva, um animal precisa evitar os EUA aversivos associando um comportamento previamente punido com um contexto ambiental específico33. Latências mais longas do teste de retenção indicando melhor memória sugerem que o animal desenvolveu uma representação detalhada da experiência de treinamento13. O treinamento de evasão passiva consiste em um único ensaio; no entanto, os mecanismos cerebrais subjacentes à aquisição dessa tarefa são complexos à medida que o animal aprende a associar várias informações, incluindo estímulos ambientais, espaciais e aversivos13. Alterar esses estímulos permite estudar tipos episódicos e contextuais de memória13.
O paradigma descrito aqui adotou o comportamento de evasão passiva em roedores para voar adulto como um sistema modelo. Embora vários procedimentos tenham sido desenvolvidos para estudar o aprendizado e a memória em moscas, incluindo olfativo7,8, visual9 e condicionamento de namoro10, esses ensaios são bastante demorados e requerem uma configuração complexa. O protocolo descrito aqui é um simples ensaio comportamental para estudar o aprendizado aversivo associativo em moscas, que consiste em 1 min de ensaios e pode ser facilmente configurado com alguns suprimentos disponíveis. O protocolo potencialmente permite a manipulação adicional das pistas ambientais, com a adição de estímulos olfativos, visuais e outros contextuais, alterando cores ou padrões geométricos para o compartimento inferior ou adicionando pistas olfativas na tampa da câmara superior. Além disso, este ensaio pode ser facilmente adaptado para estudar memória de curto prazo, memória de médio prazo e memória resistente à anestesia, manipulando intervalos entre ensaios e submetendo moscas à anestesia.
O ensaio funcionou igualmente bem em D. melanogaster e D. simulans moscas machos e fêmeas, demonstrando que o paradigma poderia ser adaptado a diferentes espécies D. As mudanças no comportamento da mosca caracterizadas pelo aumento das latências e diminuição do número de choques foram estatisticamente significativas no segundo ensaio e se fortaleceriam com os ensaios subsequentes. Curiosamente, se moscas ingênuas fossem habituadas ao aparelho sem choque elétrico, elas entrariam no compartimento superior um pouco mais rápido no segundo e terceiro testes. No entanto, a diminuição das latências não foi estatisticamente significante (dados não apresentados). Não foram observadas diferenças estatisticamente significativas entre os sexos, embora as moscas fêmeas tivessem latências um pouco mais longas e recebesse um pouco mais de choques. Essa diferença pode ser devido a uma combinação de fatores, incluindo a falha das fêmeas em associar o choque com o compartimento superior, um geotaxis mais forte, ou possivelmente porque as fêmeas são ligeiramente maiores e mais lentas que os machos. A duração total das lutas de preparação foi significativamente menor no segundo e terceiro ensaios em moscas fêmeas, o que traça um paralelo entre d . e comportamentos de ansiedade de roedores26.
Curiosamente, como mostrado nas Figuras 3E e Figura 4E, as latências no terceiro julgamento foram divididas em dois extremos (menos de 30 s e 60 s). Essas diferenças, no entanto, não foram observadas no 4º ensaio indicando que a maioria das moscas eventualmente adquiriu a tarefa (Figura 2E). Embora as razões exatas para as diferenças individuais no desenvolvimento de tarefas de evasão passiva não sejam claras, as populações naturais podem conter polimorfismo e mutações que influenciam o aprendizado e a memória3,5,34,35. Um estudo recente mostrou que o polimorfismo no forrageamento (para) lócus codificando uma quinase proteica dependente de CGMP (PKG) pode mediar estratégias alternativas na aprendizagem do comportamento forrageamento34. Moscas com o alelo "rover" e maior atividade têm melhor memória de curto prazo, enquanto moscas com o alelo "sitter" e comportamento sedentário mostram melhor memória de longo prazo34.
O ensaio revelou que o WD prejudicou significativamente o aprendizado e a memória em moscas, o que ficou evidente por latências mais curtas e recebendo mais choques no segundo ensaio. O maior número de choques no primeiro ensaio após o WD poderia indicar déficits na memória de curto prazo e uma falha em fazer associações entre contexto ambiental específico e um choque elétrico. Curiosamente, os exercícios de voo atenuaram parcialmente o efeito negativo do WD, uma vez que as moscas do WDE receberam significativamente menos choques no segundo teste. Isso sugere que o exercício de voo poderia reverter o impacto da sobrecarga metabólica e melhorar o desempenho cognitivo. Esses dados são apoiados por nossa observação prévia sobre os efeitos benéficos do exercício de voo na fisiologia, reprodução e comportamento de mosca31.
Um dos passos críticos no protocolo descrito é transferir as moscas do frasco individual para a câmara inferior. Moscas estressadas entrariam no compartimento superior muito rapidamente ou não entrariam. As moscas que não entraram no compartimento superior no primeiro ensaio ainda poderiam entrar no compartimento superior depois de serem transferidas de volta para um frasco individual e dadas uma quebra de 5 minutos. No entanto, é melhor excluir essas moscas do experimento. A idade da mosca é outro fator crucial, pois os geotaxis negativos tornaram-se significativamente mais fracos em moscas de 30 dias (dados não mostrados). Assim, mais moscas não entrariam na câmara superior no primeiro julgamento e seriam excluídas do experimento.
A vantagem do ensaio descrito é que é uma tarefa comportamental simples que produz dados reprodutíveis tanto em D. melanogaster quanto em D. simuladores moscas masculinas e femininas. O ensaio poderia ajudar no estudo de mecanismos básicos subjacentes à aprendizagem e aos prejuízos de memória resultantes de várias manipulações genéticas, farmacológicas e dietéticas. Além disso, uma vez que os ensaios de retenção podem ser realizados em diferentes momentos após o treinamento inicial, a memória de curto prazo, intermediária e de longo prazo pode ser potencialmente interrogada separadamente.
Há também limitações potenciais com esta tarefa de um teste, incluindo variabilidade entre sujeitos e diferenças de idade (discutidas acima). O aprendizado e a memória também podem ser influenciados por vários fatores, incluindo o estado comportamental no momento da aprendizagem, manipulações experimentais e respostas ao estresse36. Uma vez que os EUA são dados no compartimento com uma grade de cobre, a entrada de animais às vezes é difícil de avaliar, a menos que os feixes de fotos e câmeras infravermelhas possam ser instalados para rastreamento de vídeo no futuro.
Em conjunto, o ensaio aqui apresentado é um procedimento simples, confiável e reprodutível que permite estudar mecanismos de memória. Poderia potencialmente abrir novos caminhos para uma análise detalhada da consolidação da memória em moscas, incluindo interações gene-drogas, tanto em aspectos contextuais quanto episódicos da memória.
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Disclosures
Os autores não declaram conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado em partes pelo NIH R15ES029673 (AKM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bloomington Formulation diet | Nutri-Fly | 66-112 | Available from Genesee Scientific Inc., San Diego, CA |
| 1000 µL Blue tip | Fisher | NC9546243 | |
| 17 x 100 mm 14 mL polypropylene culture tube | VWR | 60818-689 | |
| Aduino-based Automatic Kontrol Module | In-house | AKM-007 | This unit is optional. Complete description, schematics, wiring diagram and a code are provided at the ECU Digital Market - https://digitalmarket.ecu.edu/akmmodule |
| Dual-Display 2-Channel Digital Clock/Timer | Digi-Sense | AO-94440-10 | https://www.amazon.com/Cole-Parmer-AO-94440-10-Dual-Display-2-Channel-Jumbo-Digit/dp/B00PR0809G/ref=sr_1_5?dchild=1&keywords=Dual-Display+timer+jumbo&qid=1627660660&sr= 8-5#customerReviews |
| Electronic Finger Counter | N/A | N/A | https://www.amazon.com/gp/product/B01M8IRK6F/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1 |
| Fisherbrand Sparkleen 1 Detergent | Fisher Scientific | 04-320-4 | |
| Fly mouth aspirator | In-house | Prepared as described in reference 19. | |
| Grass S88 stimulator | N/A | N/A | Could be replaced with any stimulator which can provide described parameters |
| Kim-wipes | Fisher Scientific | 06-666 | Kimberly-Clark Professional 34120 |
| Metal block for fly immobilization | In-house | 4 x 13 x 23.5cm aluminum block | |
| Nutiva USDA Certified Organic, non-GMO, Red Palm Oil | Nutiva | N/A | https://www.amazon.com/Nutiva-Certified-Cold-Filtered-Unrefined-Ecuadorian/dp/B00JJ1E83G/ref=sxts_rp_s1_0?cv_ct_cx=Nutiva+USDA+Certified+Organic%2C+non-GMO%2C+Red+Palm+Oil&dchild=1&keywords=Nutiva+USDA+Certified+Organic%2C+non-GMO%2C+Red+Palm+Oil&pd_rd_i=B00JJ1E83G&pd_ rd_r=f35e9d2f-afe4-44b6-afc2-1c9cd705be18&pd_rd_w= R3Zb4&pd_rd_wg=eUv1m&pf_rd_ p=c6bde456-f877-4246-800f-44405f638777&pf _rd_r=M94N11RC7NH333EMJ66Y &psc=1&qid=1627661533&sr=1-1-f0029781-b79b-4b60-9cb0-eeda4dea34d6 |
| Shock tube | CelExplorer | TMA-201 | https://www.celexplorer.com/product_detail.asp?id=217&MainType=110&SubType=8 |
| Stopwatch | Accusplit | A601XLN | https://www.amazon.com/gp/product/B0007ZGZYI/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1 |
| Transparent vinyl tubing (3/4” OD, 5/8” ID) | Lowes | Avaiable from Lowes |
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Comportamento Questão 176 Evasão passiva aprendizagem aversiva aprendizagem associativa memória Drosophila dieta ocidental exercício de vooErratum
Formal Correction: Erratum: Drosophila Passive Avoidance Behavior as a New Paradigm to Study Associative Aversive Learning
Posted by JoVE Editors on 02/23/2022.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Drosophila Passive Avoidance Behavior as a New Paradigm to Study Associative Aversive Learning. The Representative Results and Discussion sections were updated.
In the Representative Results, the legend for Figure 5 was updated from:
Figure 5: Comparison of passive avoidance and grooming behavior in D. simulans males and females. (A) Average latency (s) per trial. The graph shows no statistically significant differences between males and females in the latencies. (B) An average number of received shocks per trial. The graph shows no statistically significant differences between males and females in the number of received shocks. (C) The total duration of grooming bouts in trials 1-3. While there were no statistically significant differences between males and females, the female flies showed a considerable increase in grooming behavior during trials 2 and 3 compared to trial 1. Abbreviations: *- P<0.05. One-way ANOVA with Tukey's multiple comparisons test.
to:
Figure 5: Comparison of passive avoidance and grooming behavior in D. simulans males and females. (A) Average latency (s) per trial. The graph shows no statistically significant differences between males and females in the latencies. (B) An average number of received shocks per trial. The graph shows no statistically significant differences between males and females in the number of received shocks. (C) The total duration of grooming bouts in trials 1-3. While there were no statistically significant differences between males and females, the female flies showed a considerable decrease in grooming behavior during trials 2 and 3 compared to trial 1. Abbreviations: *- P<0.05. One-way ANOVA with Tukey's multiple comparisons test.
In the Discussion, the third paragraph was updated from:
The assay worked equally well in D. melanogaster and D. simulans male and female flies, demonstrating that the paradigm could be adapted to different D. species. The changes in fly behavior characterized by increased latencies and decreased number of shocks were statistically significant in the second trial and would strengthen with subsequent trials. Interestingly, if naïve flies were habituated to the apparatus without electric shock, they would enter the upper compartment a little faster on the second and the third trials. However, the decrease in latencies was not statistically significant (data not shown). No statistically significant differences were observed between sexes, although female flies had somewhat longer latencies and received slightly more shocks. This difference could be due to a combination of factors, including females' failure to associate the shock with the upper compartment, a stronger geotaxis, or possibly because females are slightly larger and slower than males. The total duration of grooming bouts was significantly higher in the second and third trials in female flies, which draws a parallel between D. and rodent anxiety-like behaviors26.
to:
The assay worked equally well in D. melanogaster and D. simulans male and female flies, demonstrating that the paradigm could be adapted to different D. species. The changes in fly behavior characterized by increased latencies and decreased number of shocks were statistically significant in the second trial and would strengthen with subsequent trials. Interestingly, if naïve flies were habituated to the apparatus without electric shock, they would enter the upper compartment a little faster on the second and the third trials. However, the decrease in latencies was not statistically significant (data not shown). No statistically significant differences were observed between sexes, although female flies had somewhat longer latencies and received slightly more shocks. This difference could be due to a combination of factors, including females' failure to associate the shock with the upper compartment, a stronger geotaxis, or possibly because females are slightly larger and slower than males. The total duration of grooming bouts was significantly lower in the second and third trials in female flies, which draws a parallel between D. and rodent anxiety-like behaviors26.
