재생 능력의 비교 분석을 위해 Zebrafish와 Medaka를 사용한 성인 시신경의 찔린 상처 부상 모델
Summary
성인 제브라피쉬의 기계적 뇌 손상 모델은 높은 재생 능력을 조절하는 분자 메커니즘을 조사하기 위해 설명됩니다. 이 방법은 형광 면역 염색을 사용하여 재생 반응을 평가하기 위해 여러 종의 작은 물고기의 시신경에 찔린 상처 손상을 만드는 것을 설명합니다.
Abstract
제브라피쉬는 중추신경계(CNS) 재생 능력이 우수하지만 메다카는 CNS 재생 능력이 낮습니다. 제브라피쉬와 메다카의 성체 시신경에서 뇌 손상 모델을 개발했으며 이러한 어종에 걸쳐 이 조직의 높은 재생 능력을 조절하는 분자 메커니즘을 밝히기 위해 비교 조직학적 및 분자 분석이 수행되었습니다. 여기에서는 바늘을 사용하여 성인 시신경에 대한 찔린 상처 손상 모델과 신경 줄기 세포(NSC)의 증식 및 분화를 위한 조직학적 분석을 제시합니다. 바늘을 시신경의 중앙 영역에 수동으로 삽입 한 다음 물고기를 심장 내로 관류하고 뇌를 해부했습니다. 이어서, 이들 조직을 냉동 절개하고, 적절한 NSC 증식 및 분화 마커에 대한 면역염색을 사용하여 평가하였다. 이 tectum 손상 모델은 제브라피쉬와 메다카 모두에서 강력하고 재현 가능한 결과를 제공하여 손상 후 NSC 반응을 비교할 수 있습니다. 이 방법은 제브라피쉬, 메다카, 아프리카 송사리를 포함한 작은 경골에 사용할 수 있으며 재생 능력을 비교하고 고유한 분자 메커니즘을 조사할 수 있습니다.
Introduction
제브라피쉬(Danio rerio)는 다른 포유류에 비해 중추신경계(CNS)를 재생하는 능력이 증가했다 1,2,3. 최근에, 이러한 증가된 재생 능력의 기초가 되는 분자 메커니즘을 더 잘 이해하기 위해, 차세대 시퀀싱 기술을 이용한 조직 재생의 비교 분석이 수행되었다 4,5,6. 제브라 피쉬와 테트라포드의 뇌 구조는 상당히 다릅니다 7,8,9. 이것은 유사한 뇌 구조와 생물학적 특징을 가진 작은 물고기를 사용하는 여러 뇌 손상 모델이 이러한 재생 능력 증가에 기여하는 기본 분자 메커니즘의 조사를 용이하게 하기 위해 개발되었음을 의미합니다.
또한, 메다카 (Oryzias latipes)는 제브라 피쉬에 비해 심장 및 신경 재생 능력이 낮은 인기있는 실험실 동물입니다 10,11,12,13. 제브라피쉬와 메다카는 성체 신경 줄기 세포(NSC)에 대해 유사한 뇌 구조와 틈새를 가지고 있습니다.14,15,16,17. 제브라피쉬와 메다카에서 시신경은 두 가지 유형의 NSC, 신경상피 유사 줄기 세포와 방사상 신경교 세포(RGC)를 포함합니다15,18. 성인 제브라피쉬의 시신경에 대한 찔린 상처 손상이 이전에 개발되었으며, 이 모델은 이 동물 19,20,21,22,23에서 뇌 재생을 조절하는 분자 메커니즘을 조사하는 데 사용되었습니다. 이 젊은 성인 제브라피쉬 찔린 상처 부상 모델은 RGC 19,24,25에서 재생 신경 발생을 유도했습니다. 시신경의 이 찔린 상처는 견고하고 재현 가능한 방법이다 13,19,20,21,22,23,24,25. 동일한 손상 모델을 성인 메다카에 적용했을 때, 메다카 시신경에서 RGC의 낮은 신경원성 능력은 손상 후 RGC 증식 및 분화의 비교 분석을 통해 밝혀졌습니다13.
시신경의 칼에 찔린 상처 손상 모델도 mummichog 모델26에서 개발되었지만, tectum 손상의 세부 사항은 종뇌 손상27과 비교할 때 잘 문서화되지 않았습니다. 제브라피쉬와 메다카를 사용한 시신경의 찔린 상처 손상은 차등 재생 능력을 가진 종 간의 차등 세포 반응과 유전자 발현을 조사할 수 있게 해줍니다. 이 프로토콜은 주사 바늘을 사용하여 시신경에 찔린 상처 손상을 수행하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 제브라피쉬와 메다카와 같은 작은 물고기에 적용할 수 있습니다. 형광 면역조직화학 및 냉동 절편을 사용한 조직학적 분석과 세포 증식 및 분화 분석을 위한 시료 전처리 공정이 여기에 설명되어 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서는 뇌 손상 후 RGC 증식 및 분화의 평가를 용이하게 하기 위해 바늘을 사용하여 시신경에 찔린 상처 손상을 유도하는 데 사용할 수 있는 일련의 방법이 설명되어 있습니다. 바늘 매개 찔린 상처는 표준 도구 세트를 사용하여 많은 실험 샘플에 적용할 수 있는 간단하고 효율적으로 구현된 방법입니다. 제브라피쉬 뇌의 여러 영역에 대한 찔린 상처 손상 모델이 개발되었습니다 3…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 JSPS KAKENHI 보조금 번호 18K14824 및 21K15195와 일본 AIST의 내부 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| 10 mL syringe | TERUMO | SS-10ESZ | |
| 1M Tris-HCl (pH 9.0) | NIPPON GENE | 314-90381 | |
| 30 G needle | Dentronics | HS-2739A | |
| 4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Wako | 163-20145 | |
| Aluminum block | 115 x 80 x 37 mm (W x D x H) is enough size to freeze 6 cryomolds | ||
| Anti-BLBP | Millipore | ABN14 | 1:500 |
| Anti-BrdU | Abcam | ab1893 | 1:500 |
| Anti-HuC | Invitrogen | A21271 | 1:100 |
| Anti-PCNA | Santa Cruz Biotechnology | sc-56 | 1:200 |
| Brmodeoxyuridine | Wako | 023-15563 | |
| Confocal microscope C1 plus | Nikon | ||
| Cryomold | Sakura Finetek Japan | 4565 | 10 x 10 x 5 mm (W x D x H) |
| Cryostat | Leica | CM1960 | |
| Danio rerio WT strains RW | |||
| Extension tube | TERUMO | SF-ET3520 | |
| Fluoromount (TM) Aqueous Mounting Medium, for use with fluorescent dye-stained tissues | SIGMA-ALDRICH | F4680-25ML | |
| Forceps | DUMONT | 11252-20 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32723 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11035 | |
| Hoechst 33342 solution | Dojindo | 23491-52-3 | |
| Hydrochloric Acid | Wako | 080-01066 | |
| Incubation Chamber for 10 slides Dark Orange | COSMO BIO CO., LTD. | 10DO | |
| MAS coat sliding glass | Matsunami glass | MAS-01 | |
| Micro cover glass | Matsunami glass | C024451 | |
| Microscopy | Nikon | SMZ745T | |
| Normal horse serum blocking solution | VECTOR LABRATORIES | S-2000-20 | |
| O.C.T Compound | Sakura Finetek Japan | 83-1824 | |
| Oryzias latipes WT strains Cab | |||
| PAP Pen Super-Liquid Blocker | DAIDO SANGYO | PAP-S | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4 | TaKaRa | T9181 | |
| Styrofoam tray | 100 x 100 x 10 mm (W x D x H) styrofoam sheet is available as tray | ||
| Sucrose | Wako | 196-00015 | 30 % (w/v) Sucrose in PBS |
| Tricaine (MS-222) | nacarai tesque | 14805-24 | |
| Trisodium Citrate Dihydrate | Wako | 191-01785 | |
| Triton X-100 | Wako | 04605-250 |
References
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