ゼブラフィッシュとメダカを用いた成体視神経筋の刺創損傷モデルによる再生能力の比較解析
Summary
成体ゼブラフィッシュの機械的脳損傷モデルを用いて、ゼブラフィッシュの高い再生能力を調節する分子機構を調べることが記載されている。この方法は、蛍光免疫染色を用いて再生応答を評価するために、複数の種の小魚の視蓋に刺創損傷を作り出すことを説明している。
Abstract
ゼブラフィッシュは中枢神経系(CNS)の再生能力が優れていますが、メダカはCNSの再生能力が低いです。ゼブラフィッシュとメダカの成体視蓋で脳損傷モデルを開発し、これらの魚種全体でこの組織の高い再生能力を制御する分子メカニズムを解明するために、比較組織学的および分子学的解析を行いました。ここでは、針を使用した成人の視蓋の刺創損傷モデルと、神経幹細胞(NSC)の増殖と分化のための組織学的分析を示します。針を視蓋の中央領域に手動で挿入し、次に魚を心臓内に灌流し、そしてそれらの脳を解剖した。次に、これらの組織を凍結切片化し、適切なNSC増殖および分化マーカーに対して免疫染色を使用して評価しました。このテクタム損傷モデルは、ゼブラフィッシュとメダカの両方で堅牢で再現性のある結果を提供し、損傷後のNSC反応を比較することができます。この方法は、ゼブラフィッシュ、メダカ、アフリカメダカなどの小型硬骨魚に利用でき、それらの再生能力を比較し、独自の分子メカニズムを調べることができます。
Introduction
ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、他の哺乳類と比較して中枢神経系(CNS)を再生する能力が向上しています1,2,3。最近、この再生能力の増加の根底にある分子メカニズムをよりよく理解するために、次世代シーケンシング技術を使用した組織再生の比較分析が行われています4,5,6。ゼブラフィッシュとテトラポッドの脳構造はかなり異なります7,8,9。これは、この再生能力の増加に寄与する基礎となる分子メカニズムの研究を容易にするために、同様の脳構造と生物学的特徴を持つ小魚を使用したいくつかの脳損傷モデルが開発されたことを意味します。
さらに、メダカ(Oryzias latipes)は、ゼブラフィッシュと比較して心臓およびニューロンの再生能力が低い人気のある実験動物です10,11,12,13。ゼブラフィッシュとメダカは、成体神経幹細胞(NSC)の脳構造とニッチが似ています14,15,16,17。ゼブラフィッシュとメダカでは、視蓋には神経上皮様幹細胞と放射状グリア細胞(RGC)の2種類のNSCが含まれています15,18。成体ゼブラフィッシュの視蓋の刺創損傷は以前に開発されており、このモデルを使用して、これらの動物の脳再生を制御する分子メカニズムを調査しました19,20,21,22,23。この若年成体のゼブラフィッシュ刺し傷損傷モデルは、RGCs19,24,25から再生神経新生を誘導した。視蓋におけるこの刺し傷損傷は、堅牢で再現性のある方法である13、19、20、21、22、23、24、25。同じ損傷モデルを成人メダカに適用したところ、損傷後のRGC増殖と分化の比較解析により、メダカ視野におけるRGCの神経原性能力が低いことが明らかになりました13。
視蓋の刺し傷損傷モデルは、ミイラモデル26でも開発されていますが、終脳損傷と比較した場合、蓋損傷の詳細は十分に文書化されていません27。ゼブラフィッシュとメダカを用いた視蓋の刺創損傷により、再生能力の異なる種間の細胞応答と遺伝子発現の違いを調べることができます。このプロトコルは、注射針を使用して視蓋の刺し傷損傷を行う方法を説明しています。この方法は、ゼブラフィッシュやメダカなどの小魚にも適用できます。ここでは、蛍光免疫組織化学および凍結切片を用いた組織学的解析および細胞増殖および分化解析のためのサンプル調製のプロセスについて説明します。
Protocol
すべての実験プロトコルは、国立研究開発法人産業技術総合研究所の動物管理・利用委員会で承認されました。ゼブラフィッシュとメダカは、標準的な手順28に従って維持されました。 1.成人の視蓋の刺し傷損傷 麻酔用の0.4%(w / v)トリカインストック溶液を調製します。100 mLのストック溶液の場合、400 mgのトリカインメタンスルホン?…
Representative Results
右半球への針挿入による視蓋の刺し傷損傷(図1、 図4A、 図5A)は、放射状グリア細胞(RGC)の増殖や新生児ニューロンの生成など、さまざまな細胞応答を誘導します。同様に、ゼブラフィッシュとメダカの高齢集団は、再生応答における老化の影響を打ち消すために使用されました。その後、凍結切片に対して蛍光免疫染色を行?…
Discussion
ここでは、脳損傷後のRGC増殖および分化の評価を容易にするために針を利用して視蓋に刺創損傷を誘発するために使用できる一連の方法について説明する。針介在刺創は、シンプルで効率的に実装された方法であり、標準的なツールセットを使用して多くの実験サンプルに適用できます。ゼブラフィッシュ脳のいくつかの領域についての刺し傷損傷モデルが開発されている3…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、JSPS科研費18K14824、21K15195、および産総研学内助成の支援を受けて行われました。
Materials
| 10 mL syringe | TERUMO | SS-10ESZ | |
| 1M Tris-HCl (pH 9.0) | NIPPON GENE | 314-90381 | |
| 30 G needle | Dentronics | HS-2739A | |
| 4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Wako | 163-20145 | |
| Aluminum block | 115 x 80 x 37 mm (W x D x H) is enough size to freeze 6 cryomolds | ||
| Anti-BLBP | Millipore | ABN14 | 1:500 |
| Anti-BrdU | Abcam | ab1893 | 1:500 |
| Anti-HuC | Invitrogen | A21271 | 1:100 |
| Anti-PCNA | Santa Cruz Biotechnology | sc-56 | 1:200 |
| Brmodeoxyuridine | Wako | 023-15563 | |
| Confocal microscope C1 plus | Nikon | ||
| Cryomold | Sakura Finetek Japan | 4565 | 10 x 10 x 5 mm (W x D x H) |
| Cryostat | Leica | CM1960 | |
| Danio rerio WT strains RW | |||
| Extension tube | TERUMO | SF-ET3520 | |
| Fluoromount (TM) Aqueous Mounting Medium, for use with fluorescent dye-stained tissues | SIGMA-ALDRICH | F4680-25ML | |
| Forceps | DUMONT | 11252-20 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32723 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11035 | |
| Hoechst 33342 solution | Dojindo | 23491-52-3 | |
| Hydrochloric Acid | Wako | 080-01066 | |
| Incubation Chamber for 10 slides Dark Orange | COSMO BIO CO., LTD. | 10DO | |
| MAS coat sliding glass | Matsunami glass | MAS-01 | |
| Micro cover glass | Matsunami glass | C024451 | |
| Microscopy | Nikon | SMZ745T | |
| Normal horse serum blocking solution | VECTOR LABRATORIES | S-2000-20 | |
| O.C.T Compound | Sakura Finetek Japan | 83-1824 | |
| Oryzias latipes WT strains Cab | |||
| PAP Pen Super-Liquid Blocker | DAIDO SANGYO | PAP-S | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4 | TaKaRa | T9181 | |
| Styrofoam tray | 100 x 100 x 10 mm (W x D x H) styrofoam sheet is available as tray | ||
| Sucrose | Wako | 196-00015 | 30 % (w/v) Sucrose in PBS |
| Tricaine (MS-222) | nacarai tesque | 14805-24 | |
| Trisodium Citrate Dihydrate | Wako | 191-01785 | |
| Triton X-100 | Wako | 04605-250 |
References
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Cite This Article
Shimizu, Y., Kawasaki, T. Stab Wound Injury Model of the Adult Optic Tectum Using Zebrafish and Medaka for the Comparative Analysis of Regenerative Capacity. J. Vis. Exp. (180), e63166, doi:10.3791/63166 (2022).