Rejeneratif Kapasitenin Karşılaştırmalı Analizi için Zebra Balığı ve Medaka Kullanan Yetişkin Optik Tektumunun Bıçak Yarası Yaralanma Modeli
Summary
Yetişkin zebra balıklarında mekanik bir beyin hasarı modeli, yüksek rejeneratif kapasitelerini düzenleyen moleküler mekanizmaları araştırmak için tanımlanmıştır. Yöntem, floresan immünoboyama kullanarak rejeneratif yanıtları değerlendirmek için birden fazla küçük balık türünün optik tektumunda bir bıçak yarası yaralanması oluşturmayı açıklar.
Abstract
Zebra balığı, merkezi sinir sistemini (CNS) yenilemek için üstün bir kapasiteye sahipken, medaka daha düşük bir CNS rejeneratif kapasitesine sahiptir. Zebra balığı ve medaka’nın yetişkin optik tektumunda bir beyin hasarı modeli geliştirilmiş ve bu balık türleri arasında bu dokunun yüksek rejeneratif kapasitesini düzenleyen moleküler mekanizmaları aydınlatmak için karşılaştırmalı histolojik ve moleküler analizler yapılmıştır. Burada erişkin optik tektum için nöral kök hücrelerin (NSC) proliferasyonu ve farklılaşması için bir iğne ve histolojik analizler kullanılarak bir bıçak yarası yaralanma modeli sunulmuştur. Optik tektumun merkezi bölgesine manuel olarak bir iğne sokuldu ve daha sonra balıklar intrakardiyal olarak perfüze edildi ve beyinleri diseke edildi. Bu dokular daha sonra kriyoseksiyona tabi tutuldu ve uygun NSC proliferasyonu ve farklılaşma belirteçlerine karşı immün boyama kullanılarak değerlendirildi. Bu tektum yaralanma modeli, hem zebra balığı hem de medaka’da sağlam ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlar ve yaralanma sonrası NSC yanıtlarını karşılaştırmaya olanak tanır. Bu yöntem, zebra balığı, medaka ve Afrika killifish dahil olmak üzere küçük teleostlar için mevcuttur ve rejeneratif kapasitelerini karşılaştırmamızı ve benzersiz moleküler mekanizmaları araştırmamızı sağlar.
Introduction
Zebra balığı (Danio rerio), diğer memelilere kıyasla merkezi sinir sistemini (CNS) yenileme yeteneğinde artışa sahiptir 1,2,3. Son zamanlarda, bu artan rejeneratif kapasitenin altında yatan moleküler mekanizmaları daha iyi anlamak için, yeni nesil dizileme teknolojisi kullanılarak doku rejenerasyonunun karşılaştırmalı analizleri yapılmıştır 4,5,6. Zebra balığı ve tetrapodlardaki beyin yapıları oldukça farklıdır 7,8,9. Bu, benzer beyin yapılarına ve biyolojik özelliklere sahip küçük balıkların kullanıldığı birkaç beyin hasarı modelinin, bu artan rejeneratif kapasiteye katkıda bulunan altta yatan moleküler mekanizmaların araştırılmasını kolaylaştırmak için geliştirildiği anlamına gelir.
Ek olarak, medaka (Oryzias latipes), zebra balığı ile karşılaştırıldığında 10,11,12,13 kalp ve nöronal rejenerasyon için düşük kapasiteye sahip popüler bir laboratuvar hayvanıdır. Zebra balığı ve medaka, yetişkin nöral kök hücreler (NSC’ler) için benzer beyin yapılarına ve nişlere sahiptir14,15,16,17. Zebra balığı ve medaka’da, optik tektum iki tip NSC, nöroepitel benzeri kök hücreler ve radyal glial hücreler (RGC’ler) içerir15,18. Yetişkin zebra balıklarının optik tektumunda bıçak yarası yaralanması daha önce geliştirilmiş ve bu model bu hayvanlarda beyin rejenerasyonunu düzenleyen moleküler mekanizmaları araştırmak için kullanılmıştır 19,20,21,22,23. Bu genç yetişkin zebra balığı bıçak yarası yaralanma modeli, RGC’lerden 19,24,25 rejeneratif nörogeneze neden olmuştur. Optik tektumdaki bu bıçak yarası yaralanması sağlam ve tekrarlanabilir bir yöntemdir 13,19,20,21,22,23,24,25. Aynı yaralanma modeli erişkin medakaya uygulandığında, medaka optik tektumdaki RGC’lerin düşük nörojenik kapasitesi, yaralanma sonrası RGC proliferasyonu ve farklılaşmasının karşılaştırmalı analizi ile ortaya konmuştur13.
Optik tektumdaki bıçak yarası yaralanma modelleri mummichog modelleri26’da da geliştirilmiştir, ancak tektum yaralanmasının ayrıntıları telensefalik yaralanma27 ile karşılaştırıldığında iyi belgelenmemiştir. Zebra balığı ve medaka kullanılarak optik tektumda bıçak yarası yaralanması, diferansiyel rejeneratif kapasiteye sahip türler arasındaki diferansiyel hücresel tepkilerin ve gen ekspresyonunun araştırılmasına olanak sağlar. Bu protokol, bir enjeksiyon iğnesi kullanılarak optik tektumda bıçak yarası yaralanmasının nasıl gerçekleştirileceğini açıklar. Bu yöntem zebra balığı ve medaka gibi küçük balıklara uygulanabilir. Burada histolojik analiz için numune hazırlama ve floresan immünohistokimya ve kriyoseksiyonlar kullanılarak hücresel proliferasyon ve farklılaşma analizi süreçleri açıklanmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, beyin hasarı sonrası RGC proliferasyonunun ve farklılaşmasının değerlendirilmesini kolaylaştırmak için bir iğne kullanarak optik tektumda bıçak yarası yaralanmalarını indüklemek için kullanılabilecek bir dizi yöntem açıklanmaktadır. İğne aracılı bıçak yaraları, standart bir alet seti kullanılarak birçok deneysel örneğe uygulanabilen basit, verimli bir şekilde uygulanan bir yöntemdir. Zebra balığı beyninin çeşitli bölgeleri için bıçak yarası yaralanma modelleri gelişt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, JSPS KAKENHI Hibe Numarası 18K14824 ve 21K15195 ve AIST, Japonya’nın dahili hibesi ile desteklenmiştir.
Materials
| 10 mL syringe | TERUMO | SS-10ESZ | |
| 1M Tris-HCl (pH 9.0) | NIPPON GENE | 314-90381 | |
| 30 G needle | Dentronics | HS-2739A | |
| 4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Wako | 163-20145 | |
| Aluminum block | 115 x 80 x 37 mm (W x D x H) is enough size to freeze 6 cryomolds | ||
| Anti-BLBP | Millipore | ABN14 | 1:500 |
| Anti-BrdU | Abcam | ab1893 | 1:500 |
| Anti-HuC | Invitrogen | A21271 | 1:100 |
| Anti-PCNA | Santa Cruz Biotechnology | sc-56 | 1:200 |
| Brmodeoxyuridine | Wako | 023-15563 | |
| Confocal microscope C1 plus | Nikon | ||
| Cryomold | Sakura Finetek Japan | 4565 | 10 x 10 x 5 mm (W x D x H) |
| Cryostat | Leica | CM1960 | |
| Danio rerio WT strains RW | |||
| Extension tube | TERUMO | SF-ET3520 | |
| Fluoromount (TM) Aqueous Mounting Medium, for use with fluorescent dye-stained tissues | SIGMA-ALDRICH | F4680-25ML | |
| Forceps | DUMONT | 11252-20 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32723 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11035 | |
| Hoechst 33342 solution | Dojindo | 23491-52-3 | |
| Hydrochloric Acid | Wako | 080-01066 | |
| Incubation Chamber for 10 slides Dark Orange | COSMO BIO CO., LTD. | 10DO | |
| MAS coat sliding glass | Matsunami glass | MAS-01 | |
| Micro cover glass | Matsunami glass | C024451 | |
| Microscopy | Nikon | SMZ745T | |
| Normal horse serum blocking solution | VECTOR LABRATORIES | S-2000-20 | |
| O.C.T Compound | Sakura Finetek Japan | 83-1824 | |
| Oryzias latipes WT strains Cab | |||
| PAP Pen Super-Liquid Blocker | DAIDO SANGYO | PAP-S | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4 | TaKaRa | T9181 | |
| Styrofoam tray | 100 x 100 x 10 mm (W x D x H) styrofoam sheet is available as tray | ||
| Sucrose | Wako | 196-00015 | 30 % (w/v) Sucrose in PBS |
| Tricaine (MS-222) | nacarai tesque | 14805-24 | |
| Trisodium Citrate Dihydrate | Wako | 191-01785 | |
| Triton X-100 | Wako | 04605-250 |
References
- Becker, T., Wullimann, M. F., Becker, C. G., Bernhardt, R. R., Schachner, M. Axonal regrowth after spinal cord transection in adult zebrafish. Journal of Comparative Neurology. 377 (4), 577-595 (1997).
- Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish. BMC Developmental Biology. 6, 36 (2006).
- März, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strähle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Developmental Dynamics. 240 (9), 2221-2231 (2011).
- Kang, J., et al. Modulation of tissue repair by regeneration enhancer elements. Nature. 532 (7598), 201-206 (2016).
- Simões, F. C., et al. Macrophages directly contribute collagen to scar formation during zebrafish heart regeneration and mouse heart repair. Nature Communications. 11 (1), 600 (2020).
- Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370 (6519), (2020).
- Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
- Diotel, N., Lübke, L., Strähle, U., Rastegar, S. Common and distinct features of adult neurogenesis and regeneration in the telencephalon of zebrafish and mammals. Frontiers in Neuroscience. 14, 568930 (2020).
- Labusch, M., Mancini, L., Morizet, D., Bally-Cuif, L. Conserved and divergent features of adult neurogenesis in zebrafish. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 525 (2020).
- Ito, K., et al. Differential reparative phenotypes between zebrafish and medaka after cardiac injury. Developmental Dynamics. 243 (9), 1106-1115 (2014).
- Lai, S. L., et al. Reciprocal analyses in zebrafish and medaka reveal that harnessing the immune response promotes cardiac regeneration. eLife. 6, 25605 (2017).
- Lust, K., Wittbrodt, J. Activating the regenerative potential of Müller glia cells in a regeneration-deficient retina. eLife. 7, 32319 (2018).
- Shimizu, Y., Kawasaki, T. Differential regenerative capacity of the optic tectum of adult medaka and zebrafish. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 686755 (2021).
- Adolf, B., et al. Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon. Developmental Biology. 295 (1), 278-293 (2006).
- Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate. Developmental Biology. 295 (1), 263-277 (2006).
- Alunni, A., et al. Evidence for neural stem cells in the medaka optic tectum proliferation zones. Developmental Neurobiology. 70 (10), 693-713 (2010).
- Kuroyanagi, Y., et al. Proliferation zones in adult medaka (Oryzias latipes) brain. Brain Research. 1323, 33-40 (2010).
- Ito, Y., Tanaka, H., Okamoto, H., Ohshima, T. Characterization of neural stem cells and their progeny in the adult zebrafish optic tectum. Developmental Biology. 342 (1), 26-38 (2010).
- Shimizu, Y., Ueda, Y., Ohshima, T. Wnt signaling regulates proliferation and differentiation of radial glia in regenerative processes after stab injury in the optic tectum of adult zebrafish. Glia. 66 (7), 1382-1394 (2018).
- Ueda, Y., Shimizu, Y., Shimizu, N., Ishitani, T., Ohshima, T. Involvement of sonic hedgehog and notch signaling in regenerative neurogenesis in adult zebrafish optic tectum after stab injury. Journal of Comparative Neurology. 526 (15), 2360-2372 (2018).
- Kiyooka, M., Shimizu, Y., Ohshima, T. Histone deacetylase inhibition promotes regenerative neurogenesis after stab wound injury in the adult zebrafish optic tectum. Biochemical and Biophysical Research Communications. 529 (2), 366-371 (2020).
- Shimizu, Y., Kawasaki, T. Histone acetyltransferase EP300 regulates the proliferation and differentiation of neural stem cells during adult neurogenesis and regenerative neurogenesis in the zebrafish optic tectum. Neuroscience Letters. 756, 135978 (2021).
- Shimizu, Y., Kiyooka, M., Ohshima, T. Transcriptome analyses reveal IL6/Stat3 signaling involvement in radial glia proliferation after stab wound injury in the adult zebrafish optic tectum. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 668408 (2021).
- Lindsey, B. W., et al. Midbrain tectal stem cells display diverse regenerative capacities in zebrafish. Scientific Reports. 9 (1), 4420 (2019).
- Yu, S., He, J. Stochastic cell-cycle entry and cell-state-dependent fate outputs of injury-reactivated tectal radial glia in zebrafish. eLife. 8, 48660 (2019).
- Bisese, E. C., et al. The acute transcriptome response of the midbrain/diencephalon to injury in the adult mummichog (Fundulus heteroclitus). Molecular Brain. 12 (1), 119 (2019).
- Schmidt, R., Beil, T., Strähle, U., Rastegar, S. Stab wound injury of the zebrafish adult telencephalon: a method to investigate vertebrate brain neurogenesis and regeneration. Journal of Visualized Experiments. (4), e51753 (2014).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio) 5th ed. , (2007).
- Kaslin, J., Kroehne, V., Ganz, J., Hans, S., Brand, M. Distinct roles of neuroepithelial-like and radial glia-like progenitor cells in cerebellar regeneration. Development. 144 (8), 1462-1471 (2017).
- Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies. Developmental Dynamics. 236 (4), 1025-1035 (2007).
- Shimizu, Y., Ito, Y., Tanaka, H., Ohshima, T. Radial glial cell-specific ablation in the adult zebrafish brain. Genesis. 53 (7), 431-439 (2015).
- Godoy, R., et al. Dopaminergic neurons regenerate following chemogenetic ablation in the olfactory bulb of adult zebrafish (Danio rerio). Scientific Reports. 10 (1), 12825 (2020).
- Sawahata, M., Izumi, Y., Akaike, A., Kume, T. In vivo brain ischemia-reperfusion model induced by hypoxia-reoxygenation using zebrafish larvae. Brain Research Bulletin. 173, 45-52 (2021).
