Stikksårskademodell av voksenoptisk tektum ved bruk av sebrafisk og medaka for komparativ analyse av regenerativ kapasitet
Summary
En mekanisk hjerneskademodell hos den voksne sebrafisken er beskrevet for å undersøke de molekylære mekanismene som regulerer deres høye regenerative kapasitet. Metoden forklarer å skape en stikksårskade i optisk tektum av flere arter av liten fisk for å evaluere de regenerative responsene ved hjelp av fluorescerende immunfarging.
Abstract
Mens sebrafisk har en overlegen kapasitet til å regenerere sentralnervesystemet (CNS), har medaka en lavere CNS-regenerativ kapasitet. En hjerneskademodell ble utviklet i det voksne optiske tektumet til sebrafisk og medaka, og komparative histologiske og molekylære analyser ble utført for å belyse de molekylære mekanismene som regulerer den høye regenerative kapasiteten til dette vevet på tvers av disse fiskeartene. Her presenteres en stikksårskademodell for den voksne optiske tektum ved hjelp av nål og histologiske analyser for proliferasjon og differensiering av nevrale stamceller (NSC). En nål ble manuelt satt inn i det sentrale området av optisk tektum, og deretter ble fisken intrakardialt perfundert, og hjernen deres ble dissekert. Disse vevene ble deretter kryoseksjonert og evaluert ved hjelp av immunfarging mot passende NSC-proliferasjons- og differensieringsmarkører. Denne tektumskademodellen gir robuste og reproduserbare resultater i både sebrafisk og medaka, noe som gjør det mulig å sammenligne NSC-responser etter skade. Denne metoden er tilgjengelig for små teleoster, inkludert sebrafisk, medaka og afrikansk killifish, og gjør det mulig for oss å sammenligne deres regenerative kapasitet og undersøke unike molekylære mekanismer.
Introduction
Sebrafisk (Danio rerio) har økt evne til å regenerere sentralnervesystemet (CNS) sammenlignet med andre pattedyr 1,2,3. Nylig, for bedre å forstå de molekylære mekanismene som ligger til grunn for denne økte regenerative kapasiteten, har komparative analyser av vevregenerering ved hjelp av neste generasjons sekvenseringsteknologi blitt utført 4,5,6. Hjernestrukturene hos sebrafisk og tetrapoder er ganske forskjellige: 7,8,9. Dette betyr at flere hjerneskademodeller med små fisk med lignende hjernestrukturer og biologiske egenskaper er utviklet for å lette undersøkelsen av de underliggende molekylære mekanismene som bidrar til denne økte regenerative kapasiteten.
I tillegg er medaka (Oryzias latipes) et populært laboratoriedyr med lav kapasitet for hjerte- og nevronregenerering10,11,12,13 sammenlignet med sebrafisk. Sebrafisk og medaka har lignende hjernestrukturer og nisjer for voksne nevrale stamceller (NSC)14,15,16,17. I sebrafisk og medaka omfatter optisk tektum to typer NSC, nevroepitellignende stamceller og radiale gliaceller (RGC)15,18. En stikksårskade for optisk tektum hos voksne sebrafisk ble tidligere utviklet, og denne modellen ble brukt til å undersøke molekylære mekanismer som regulerer hjernens regenerering hos disse dyrene 19,20,21,22,23. Denne unge voksne sebrafiskstikkskademodellen induserte regenerativ nevrogenese fra RGC 19,24,25. Denne stikksårskaden i optisk tektum er en robust og reproduserbar metode 13,19,20,21,22,23,24,25. Når samme skademodell ble anvendt på voksen medaka, ble den lave nevrogene kapasiteten til RGC i medaka optisk tektum avslørt via komparativ analyse av RGC-proliferasjon og differensiering etter skade13.
Stikksårskademodeller i optisk tektum er også utviklet i mummichog modell26, men detaljer om tektumskaden er ikke godt dokumentert sammenlignet med telencefalisk skade27. Stikksårskaden i optisk tektum ved bruk av sebrafisk og medaka gjør det mulig å undersøke differensialcellulære responser og genuttrykk mellom arter med differensiell regenerativ kapasitet. Denne protokollen beskriver hvordan man utfører en stikksårskade i optisk tektum ved hjelp av en injeksjonsnål. Denne metoden kan brukes på små fisk som sebrafisk og medaka. Prosessene for prøvepreparering for histologisk analyse og cellulær proliferasjon og differensieringsanalyse ved bruk av fluorescerende immunhistokjemi og kryoseksjoner er forklart her.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskrives et sett med metoder som kan brukes til å indusere stikksårskader i optisk tektum ved hjelp av en nål for å lette evalueringen av RGC-proliferasjon og differensiering etter hjerneskade. Nålmedierte stikksår er en enkel, effektivt implementert metode som kan brukes på mange eksperimentelle prøver ved hjelp av et standard sett med verktøy. Stikksårskademodeller for flere regioner i sebrafiskhjernen er utviklet 3,19,29.…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av JSPS KAKENHI Grant Number 18K14824 og 21K15195 og et internt tilskudd fra AIST, Japan.
Materials
| 10 mL syringe | TERUMO | SS-10ESZ | |
| 1M Tris-HCl (pH 9.0) | NIPPON GENE | 314-90381 | |
| 30 G needle | Dentronics | HS-2739A | |
| 4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Wako | 163-20145 | |
| Aluminum block | 115 x 80 x 37 mm (W x D x H) is enough size to freeze 6 cryomolds | ||
| Anti-BLBP | Millipore | ABN14 | 1:500 |
| Anti-BrdU | Abcam | ab1893 | 1:500 |
| Anti-HuC | Invitrogen | A21271 | 1:100 |
| Anti-PCNA | Santa Cruz Biotechnology | sc-56 | 1:200 |
| Brmodeoxyuridine | Wako | 023-15563 | |
| Confocal microscope C1 plus | Nikon | ||
| Cryomold | Sakura Finetek Japan | 4565 | 10 x 10 x 5 mm (W x D x H) |
| Cryostat | Leica | CM1960 | |
| Danio rerio WT strains RW | |||
| Extension tube | TERUMO | SF-ET3520 | |
| Fluoromount (TM) Aqueous Mounting Medium, for use with fluorescent dye-stained tissues | SIGMA-ALDRICH | F4680-25ML | |
| Forceps | DUMONT | 11252-20 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32723 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11035 | |
| Hoechst 33342 solution | Dojindo | 23491-52-3 | |
| Hydrochloric Acid | Wako | 080-01066 | |
| Incubation Chamber for 10 slides Dark Orange | COSMO BIO CO., LTD. | 10DO | |
| MAS coat sliding glass | Matsunami glass | MAS-01 | |
| Micro cover glass | Matsunami glass | C024451 | |
| Microscopy | Nikon | SMZ745T | |
| Normal horse serum blocking solution | VECTOR LABRATORIES | S-2000-20 | |
| O.C.T Compound | Sakura Finetek Japan | 83-1824 | |
| Oryzias latipes WT strains Cab | |||
| PAP Pen Super-Liquid Blocker | DAIDO SANGYO | PAP-S | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4 | TaKaRa | T9181 | |
| Styrofoam tray | 100 x 100 x 10 mm (W x D x H) styrofoam sheet is available as tray | ||
| Sucrose | Wako | 196-00015 | 30 % (w/v) Sucrose in PBS |
| Tricaine (MS-222) | nacarai tesque | 14805-24 | |
| Trisodium Citrate Dihydrate | Wako | 191-01785 | |
| Triton X-100 | Wako | 04605-250 |
References
- Becker, T., Wullimann, M. F., Becker, C. G., Bernhardt, R. R., Schachner, M. Axonal regrowth after spinal cord transection in adult zebrafish. Journal of Comparative Neurology. 377 (4), 577-595 (1997).
- Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish. BMC Developmental Biology. 6, 36 (2006).
- März, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strähle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Developmental Dynamics. 240 (9), 2221-2231 (2011).
- Kang, J., et al. Modulation of tissue repair by regeneration enhancer elements. Nature. 532 (7598), 201-206 (2016).
- Simões, F. C., et al. Macrophages directly contribute collagen to scar formation during zebrafish heart regeneration and mouse heart repair. Nature Communications. 11 (1), 600 (2020).
- Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370 (6519), (2020).
- Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
- Diotel, N., Lübke, L., Strähle, U., Rastegar, S. Common and distinct features of adult neurogenesis and regeneration in the telencephalon of zebrafish and mammals. Frontiers in Neuroscience. 14, 568930 (2020).
- Labusch, M., Mancini, L., Morizet, D., Bally-Cuif, L. Conserved and divergent features of adult neurogenesis in zebrafish. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 525 (2020).
- Ito, K., et al. Differential reparative phenotypes between zebrafish and medaka after cardiac injury. Developmental Dynamics. 243 (9), 1106-1115 (2014).
- Lai, S. L., et al. Reciprocal analyses in zebrafish and medaka reveal that harnessing the immune response promotes cardiac regeneration. eLife. 6, 25605 (2017).
- Lust, K., Wittbrodt, J. Activating the regenerative potential of Müller glia cells in a regeneration-deficient retina. eLife. 7, 32319 (2018).
- Shimizu, Y., Kawasaki, T. Differential regenerative capacity of the optic tectum of adult medaka and zebrafish. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 686755 (2021).
- Adolf, B., et al. Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon. Developmental Biology. 295 (1), 278-293 (2006).
- Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate. Developmental Biology. 295 (1), 263-277 (2006).
- Alunni, A., et al. Evidence for neural stem cells in the medaka optic tectum proliferation zones. Developmental Neurobiology. 70 (10), 693-713 (2010).
- Kuroyanagi, Y., et al. Proliferation zones in adult medaka (Oryzias latipes) brain. Brain Research. 1323, 33-40 (2010).
- Ito, Y., Tanaka, H., Okamoto, H., Ohshima, T. Characterization of neural stem cells and their progeny in the adult zebrafish optic tectum. Developmental Biology. 342 (1), 26-38 (2010).
- Shimizu, Y., Ueda, Y., Ohshima, T. Wnt signaling regulates proliferation and differentiation of radial glia in regenerative processes after stab injury in the optic tectum of adult zebrafish. Glia. 66 (7), 1382-1394 (2018).
- Ueda, Y., Shimizu, Y., Shimizu, N., Ishitani, T., Ohshima, T. Involvement of sonic hedgehog and notch signaling in regenerative neurogenesis in adult zebrafish optic tectum after stab injury. Journal of Comparative Neurology. 526 (15), 2360-2372 (2018).
- Kiyooka, M., Shimizu, Y., Ohshima, T. Histone deacetylase inhibition promotes regenerative neurogenesis after stab wound injury in the adult zebrafish optic tectum. Biochemical and Biophysical Research Communications. 529 (2), 366-371 (2020).
- Shimizu, Y., Kawasaki, T. Histone acetyltransferase EP300 regulates the proliferation and differentiation of neural stem cells during adult neurogenesis and regenerative neurogenesis in the zebrafish optic tectum. Neuroscience Letters. 756, 135978 (2021).
- Shimizu, Y., Kiyooka, M., Ohshima, T. Transcriptome analyses reveal IL6/Stat3 signaling involvement in radial glia proliferation after stab wound injury in the adult zebrafish optic tectum. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 668408 (2021).
- Lindsey, B. W., et al. Midbrain tectal stem cells display diverse regenerative capacities in zebrafish. Scientific Reports. 9 (1), 4420 (2019).
- Yu, S., He, J. Stochastic cell-cycle entry and cell-state-dependent fate outputs of injury-reactivated tectal radial glia in zebrafish. eLife. 8, 48660 (2019).
- Bisese, E. C., et al. The acute transcriptome response of the midbrain/diencephalon to injury in the adult mummichog (Fundulus heteroclitus). Molecular Brain. 12 (1), 119 (2019).
- Schmidt, R., Beil, T., Strähle, U., Rastegar, S. Stab wound injury of the zebrafish adult telencephalon: a method to investigate vertebrate brain neurogenesis and regeneration. Journal of Visualized Experiments. (4), e51753 (2014).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio) 5th ed. , (2007).
- Kaslin, J., Kroehne, V., Ganz, J., Hans, S., Brand, M. Distinct roles of neuroepithelial-like and radial glia-like progenitor cells in cerebellar regeneration. Development. 144 (8), 1462-1471 (2017).
- Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies. Developmental Dynamics. 236 (4), 1025-1035 (2007).
- Shimizu, Y., Ito, Y., Tanaka, H., Ohshima, T. Radial glial cell-specific ablation in the adult zebrafish brain. Genesis. 53 (7), 431-439 (2015).
- Godoy, R., et al. Dopaminergic neurons regenerate following chemogenetic ablation in the olfactory bulb of adult zebrafish (Danio rerio). Scientific Reports. 10 (1), 12825 (2020).
- Sawahata, M., Izumi, Y., Akaike, A., Kume, T. In vivo brain ischemia-reperfusion model induced by hypoxia-reoxygenation using zebrafish larvae. Brain Research Bulletin. 173, 45-52 (2021).
