ניגוד בין שלוש טכניקות חיסון המשמשות לקביעת הגזע של פוסאריום אוקסיספורום לא ידוע f.sp. niveum מבודד
Summary
ניהול Fusarium wilt של אבטיח דורש ידע על גזעי הפתוגנים הקיימים. כאן נתאר את טבילת השורשים, זריעת הגרעינים שורצי השורשים ושיטות החיסון המתוקנות של טבילת מגשים כדי להדגים את יעילותן בהקלדת גזע של הפטרייה הפתוגנית Fusarium oxysporum f. sp niveum (Fon).
Abstract
Fusarium wilt של אבטיח (Citrullus lanatus), הנגרם על ידי Fusarium oxysporum f. sp. niveum (Fon), התחדש כמגבלת ייצור מרכזית בדרום מזרח ארה”ב, במיוחד בפלורידה. פריסה של אסטרטגיות משולבות להדברת מזיקים, כגון זנים עמידים ספציפיים לגזע, דורשת מידע על המגוון וצפיפות האוכלוסייה של הפתוגן בשדות המגדלים. למרות התקדמות מסוימת בפיתוח כלי אבחון מולקולריים לזיהוי מבודדים של פתוגנים, קביעת גזע דורשת לעתים קרובות גישות של בדיקה ביולוגית.
הקלדת הגזעים נערכה על ידי חיסון טבילת שורשים, שיטת זריעת גרעינים שורצת, ושיטת טבילת המגש המתוקנת עם כל אחד מארבעת הפרשי האבטיחים (יהלום שחור, צ’רלסטון גריי, Calhoun Grey, מבוא לצמח 296341-FR). מבודדים מוקצים ייעוד גזע על ידי חישוב שכיחות המחלה חמישה שבועות לאחר החיסון. אם פחות מ-33% מהצמחים של זן מסוים היו סימפטומטיים, הם סווגו כעמידים. אותם זנים עם שכיחות של יותר מ-33% נחשבו רגישים. מאמר זה מתאר שלוש שיטות שונות של חיסון כדי לוודא גזע, טבילת שורשים, גרעין שורץ וחיסון טבילת מגשים שונה, שהיישומים שלהן משתנים בהתאם לתכנון הניסויי.
Introduction
הפטריות הנישאות בקרקע המרכיבות את קומפלקס המינים Fusarium oxysporum (FOSC) הן פתוגנים צמחיים המיביוטרופיים בעלי השפעה שיכולים לגרום למחלות קשות ולאובדן יבולים במגוון רחב של גידולים1. Fusarium wilt של אבטיח, הנגרם על ידי F. oxysporum f. sp. niveum (Fon), גדל בהיקפו, בשכיחותו ובחומרתו ברחבי העולם בעשורים האחרונים 2,3. בשתילים, הסימפטומים של Fusarium wilt לעתים קרובות דומים דעיכה- off. בצמחים מבוגרים יותר, העלווה הופכת לאפורה, כלורוטית ונמקית. בסופו של דבר, ההסתערות על הצמחים מתקדמת לקריסת צמחים מלאה ולמוות4. אובדן יבול ישיר מתרחש עקב הסימפטומים ומוות הצמח, בעוד שאובדן יבול עקיף יכול להתרחש עקב נזקי שמש הנגרמים על ידי חיסול חופת העלווה5. רבייה מינית ומבני רבייה נלווים מעולם לא נצפו ב– F. oxysporum. עם זאת, הפתוגן מייצר שני סוגים של נבגים א-מיניים, מיקרו ומקרוקונידיה, כמו גם מבני הישרדות גדולים יותר לטווח ארוך הנקראים כלמידוספורים, שיכולים לשרוד באדמה במשך שנים רבות6.
ה-FOSC מסווג ל-formae speciales בהתבסס על טווחי פונדקאים שנצפו, בדרך כלל מוגבלים לאחד או לכמה מינים מארחים1. למרות שמחקרים אחרונים הצביעו על כך שקומפלקס מינים זה עשוי להיות מורכב של 15 מינים שונים, המינים המסוימים שמדביקים אבטיח אינם ידועים כיום7. F. oxysporum f. sp. niveum (Fon) הוא השם לקבוצות הזנים המדביקות באופן בלעדי את Citrullus lanatus או את האבטיח המבוית 8,9. F. זני oxysporum בתוך רוב זני הפורמה הפתוגניים מציגים רמות מסוימות של מגוון ביחס למרכיבים הגנטיים שלהם ולאלימות שלהם כלפי מין פונדקאי. לדוגמה, זן אחד עשוי להדביק את כל המינים של הפונדקאי, בעוד שזן אחר עשוי להדביק רק את המינים הרגישים יותר. כדי להסביר שונות כזו, קבוצות אלה מסווגות באופן לא רשמי לגזעים המבוססים על יחסים אבולוציוניים או מאפיינים פנוטיפיים נפוצים. בתוך פון, ארבעה גזעים (0, 1, 2 ו-3) אופיינו על סמך הפתוגניות שלהם נגד קבוצה של זני אבטיחים נבחרים, כאשר הגילוי של גזע 3 התרחש לאחרונה10.
למרות המגוון לכאורה הזה, לא ניתן להבחין בין המורפולוגיות של הנבגים או ההיפרים בין הגזעים של גזעי פון, כלומר יש צורך בבדיקות מולקולריות או פנוטיפיות כדי לזהות את הגזע הייחודי של מבודד11. המחקר המולקולרי זיהה כמה הבדלים גנטיים. לדוגמה, תפקידם של אפקטים מופרשים בקסילם (SIX) נחקר במשך שנים ב– F. oxysporum, וחלק מהאפקטים הללו אותרו על הכרומוזומים שהוחלפו במהלך העברת גנים אופקית12. לדוגמה, SIX6 נמצא במירוצי Fon 0 ו-1 אך לא במרוץ 213. שישה משפיעים היו מעורבים בפתוגניות של F. oxysporum f. sp. lycopersici ו– F. oxysporum f. sp. cubense, הגורמים Fusarium wilt על עגבנייה ובננה, בהתאמה 14,15,16,17. הניתוח של שישה פרופילי אפקטור בקרב זנים של F. oxysporum f. sp. spiniciae, הפתוגן Fusarium wilt על תרד, אפשר סיווג המשקף במדויק את המגוון הגנטי והפנוטיפי18. עם זאת, ההבדלים בין מנגנוני האלימות של גזעי פון אינם מובנים כיום לחלוטין, ובדיקות מולקולריות שפותחו עם השימוש בהם הראו תוצאות לא עקביות ולא מדויקות19. לכן, תוצאות פנוטיפיות מבדיקות זיהום הן כיום הדרך הטובה ביותר לסווג מבודדים.
F. oxysporum מדביק בתחילה פונדקאים דרך השורשים לפני שהוא עושה את דרכו במעלה ה-xylem20. זה הופך את החיסון הישיר של השורשים של זן מארח נתון לדרך יעילה לבצע הקלדת גזע והוא הבסיס לשיטות חיסון השורשים-טבילה ומגש-טבילה21. כאשר לא מדביקים פונדקאי, F. oxysporum שוכן באדמה ויכול להישאר רדום במשך שנים. גידול זני אבטיח רגישים בקרקע משדה עניין הוא אחת הדרכים לבחון את נוכחותו של פון. הרחבת שיטה זו כך שתכלול תרבויות של רמות עמידות ידועות שונות בקרקע, השורצות במכוון בפון, היא גם דרך טובה לבצע הקלדת גזעים (טבלה 1) והיא הבסיס לשיטת זריעת הגרעינים שורצי הגלעין. שיטת טבילת המגש המתוקנת היא וריאציה של שיטת טבילת המגש המקורית המאפשרת הקלדת גזע בתפוקה גבוהה שבה ניתן לחקור במהירות22 צמחים רבים ומבודדי שדה. גורמים חשובים לבדיקה ביולוגית מהירה ומוצלחת של הקלדת גזע כוללים שימוש בתרבויות שתיעדו הבדלים בעמידות לגזעי הפתוגנים השונים, הבטחה שהאינוקולום פעיל ביולוגית ושופע במהלך ההדבקה, שמירה על סביבה שתורמת גם לפתוגן וגם לפונדקאי, ושימוש במערכת דירוג עקבית לחומרה או לשכיחות המחלה. מאמר זה מתאר את טבילת השורש 23,24, זריעת גרעינים שורצי25,26, ושיטות טבילת מגש22 מותאמות להקלדה פנוטיפית של גזע על בסיס העקרונות שתוארו לעיל.
Protocol
Representative Results
Discussion
הוצגו שלוש שיטות של הקלדת גזעים. כל אחת מהשיטות הללו מתאימה ביותר לשאלות מסוימות ולתנאים ניסיוניים מסוימים. שיטת חיסון הגרעין שורץ (התפשטות הקרקע) היא אולי פשוטה ופשוטה יותר, מה שהופך אותה לשימושית במיוחד להערכת פתוגניות30. שימוש בשיטה זו להקלדה פשוטה של גזעים הוא יעיל ביותר. ע…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו רוצים להודות לד”ר עלי ולמעבדה לאבחון מולקולרי של צמחים, כמו גם לד”ר פינגשנג ג’י באוניברסיטת ג’ורג’יה, שמנהיגותו ותמיכתו סייעו לבסס את תוכנית פון שלנו.
Materials
| 100% Fuller’s Earth | Sigma-Aldrich | F200-5KG | |
| 1 L glass Erlenmeyer Flask | PYREX | 4980-1L | |
| 15 mL falcon tubes | Fisher Scientific | 14-959-49B | |
| 50 mL graduated cylinder | Lab Safety Supply | 41121805 | |
| 50 mL Eppendorf Conical Tubes | Fisher Scientific | 05-413-921 | |
| Aluminum foil wrap | Reynolds Wrap | 720 | |
| Bleach | Walmart | 587192290 | |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | 03-391-301 | |
| CaCO3 | sigma-Aldrich | 239216 | |
| cell spreaders | Fisher Scientific | 08-100-11 | |
| Cheesecloth | Lions Services, Inc | 8305-01-125-0725 | |
| Clear plastic dishes | Visions Wave | 999RP6CLSS | ~15 cm diameter |
| Clear vinyl tubing for mushroom bag clamps | Shroom Supply | 6" for small bag, 8" for medium bag, 10" for large bag | |
| Cotton Balls | Fisherbrand | 22-456-885 | Sterile |
| Ethanol | Fisher Chemical | A4094 | 100%, then combine with water to make 70% for use |
| Flourescent Tube Lights | MaxLume | Model T5 | 2800 K Color Temperature, 24'' or 48'' long |
| granulated agar | VWR International | 90000-786 | |
| Hand-held Spray Bottle | Ability One | 24122002 | ~0.95 L |
| hemacytometer | Fisher Scientific | 02-671-55A | Two chamber hemacytometer |
| Lab trays | Fisher Scientific | 15-236-2A | |
| Large, sealable plastic bags | Ziploc | 430805 | 38 cm x 38 cm |
| Mister / watering can | Bar5F | B10H22 | |
| Mushroom Bag Clamp | Shroom Supply | 6" for small bag, 8" for medium bag, 10" for large bag | |
| Nitrile Gloves | Fisher Scientific | 19-130-1597D | |
| Organic Rye Berries | Shroom Supply | 0.5 gallon or 25 lb bags | |
| P1000 pipette and tips | Fisher Scientific | 14-388-100 | |
| Petri dishes | Fisherbrand | FB0875713 | Round, 100 mm diameter, 15 mm height |
| Planting media | Jolly Gardener | Pro-Line C/B | |
| Plastic Pitcher | BrandTech | UX0600850 | 1 L or larger |
| Plastic planting pots | Neo/SCI | 01-1177 | ~15 cm diameter and ~10 cm height |
| Plastic, autoclave-safe bin | Thermo Scientific | UX0601022 | 3 L |
| Quarter-strength potato dextrose agar media | Cole-Parmer | UX1420028 | Use powder in combination with recipe for QPDA |
| Scientific Balance Scale, measuring in g | Ohaus | 30208458 | Any precise scale that can hold and measure 200g will work |
| Size #4 cork bore | Cole-Parmer | NC9585352 | |
| Small Mushroom grow bag | Shroom Supply | 0.5 micron filter, also comes in medium and large sizes | |
| Soil trowel | Walmart | 563876946 | |
| Styrofoam flats (6 x 12 cells) | Speedling | Model TR72A | |
| Styrofoam flats (8 x 16 cells) | Speedling | Model TR128A | |
| Syringe (5 or 10 mL) | fisher Scientific | 14-829-19C | |
| Timer | Walmart | TM-01 | |
| V8 Original 100% Vegetable Juice | Walmart | 564638212 | |
| vortex | Fisher Scientific | 02-215-418 | |
| Watermelon Seed – Black Diamond | Willhite Seed Inc | 17 | |
| Watermelon Seed – Calhoun Gray | Holmes Seed Company | 4440 | |
| Watermelon Seed – Charleston Gray | Bonnie Plants | 7.15339E+11 | |
| Watermelon Seed – PI 296341-FR | Contact authors | Contact authors | |
| Wheat Kernels (Maxie var.) (optional) | Alachua County Feed & Seed |
References
- Edel-Hermann, V., Lecomte, C. Current status of Fusarium oxysporum formae speciales and races. Phytopathology. 109 (4), 512-530 (2019).
- Everts, K. L., Himmelstein, J. C. Fusarium wilt of watermelon: Towards sustainable management of a re-emerging plant disease. Crop Protection. 73, 93-99 (2015).
- Martyn, R. Cucurbitaceae 2012. Proceedings of the Xth EUCARPIA Meeting on Genetics and Breeding of Cucurbitaceae. , 136-156 (2012).
- Roberts, P., Dufault, N., Hochmuth, R., Vallad, G., Paret, M. [PP352] Fusarium wilt (Fusarium oxysporum f. sp. niveum) of watermelon. EDIS. 2019 (5), 4 (2019).
- Costa, A. E. S., et al. Resistance to Fusarium wilt in watermelon accessions inoculated by chlamydospores. Scientia Horticulturae. 228, 181-186 (2018).
- Lombard, L., Sandoval-Denis, M., Lamprecht, S. C., Crous, P. Epitypification of Fusarium oxysporum-clearing the taxonomic chaos. Persoonia: Molecular Phylogeny and Evolution of Fungi. 43, 1 (2019).
- Martyn, R. D. Fusarium wilt of watermelon: 120 years of research. Horticultural Reviews. 42 (1), 349-442 (2014).
- Zhou, X., Everts, K. Characterization of a regional population of Fusarium oxysporum f. sp. niveum by race, cross pathogenicity, and vegetative compatibility. Phytopathology. 97 (4), 461-469 (2007).
- Zhou, X., Everts, K., Bruton, B. Race 3, a new and highly virulent race of Fusarium oxysporum f. sp. niveum causing Fusarium wilt in watermelon. Plant Disease. 94 (1), 92-98 (2010).
- Leslie, J. F., Summerell, B. A. . The Fusarium laboratory manual. , (2008).
- Lo Presti, L., et al. Fungal effectors and plant susceptibility. Annual Review of Plant Biology. 66, 513-545 (2015).
- Niu, X., et al. The FonSIX6 gene acts as an avirulence effector in the Fusarium oxysporum f. sp. niveum-watermelon pathosystem. Scientific Reports. 6 (1), 1-7 (2016).
- Lievens, B., Houterman, P. M., Rep, M. Effector gene screening allows unambiguous identification of Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici races and discrimination from other formae speciales. FEMS Microbiology Letters. 300 (2), 201-215 (2009).
- Houterman, P. M., Cornelissen, B. J., Rep, M. Suppression of plant resistance gene-based immunity by a fungal effector. PLoS Pathogens. 4 (5), 1000061 (2008).
- Houterman, P. M., et al. The effector protein Avr2 of the xylem-colonizing fungus Fusarium oxysporum activates the tomato resistance protein I-2 intracellularly. The Plant Journal. 58 (6), 970-978 (2009).
- Czislowski, E., et al. Investigation of the diversity of effector genes in the banana pathogen, Fusarium oxysporum f. sp. cubense, reveals evidence of horizontal gene transfer. Molecular Plant Pathology. 19 (5), 1155-1171 (2018).
- Batson, A. M., Fokkens, L., Rep, M., du Toit, L. J. Putative effector genes distinguish two pathogenicity groups of Fusarium oxysporum f. sp. spinaciae. Molecular Plant-Microbe Interactions. 34 (2), 141-156 (2021).
- Keinath, A. P., DuBose, V. B., Katawczik, M. M., Wechter, W. P. Identifying races of Fusarium oxysporum f. sp. niveum in South Carolina recovered from watermelon seedlings, plants, and field soil. Plant Disease. 104 (9), 2481-2488 (2020).
- Gordon, T. R. Fusarium oxysporum and the Fusarium wilt syndrome. Annual Review of Phytopathology. 55, 23-39 (2017).
- Martyn, R., Netzer, D. Resistance to races 0, 1, and 2 of Fusarium wilt of watermelon in Citrullus sp. PI-296341-FR. HortScience. 26 (4), 429-432 (1991).
- Meru, G., McGregor, C. Genotyping by sequencing for SNP discovery and genetic mapping of resistance to race 1 of Fusarium oxysporum in watermelon. Scientia Horticulturae. 209, 31-40 (2016).
- Freeman, S., Rodriguez, R. A rapid inoculation technique for assessing pathogenicity of Fusarium oxysporum f. sp. niveum and F. o. melonis on cucurbits. Plant Disease. 77 (12), 1198-1201 (1993).
- Martyn, R. Fusarium oxysporum f. sp. niveum race 2: A highly aggressive race new to the United States. Plant Disease. 71 (3), 233-236 (1987).
- Lai, X., et al. Evaluating inoculation methods to infect sugar beet with Fusarium oxysporum f. Beat and F. secorum. Plant Disease. 104 (5), 1312-1317 (2020).
- Kirk, W., et al. Optimizing fungicide timing for the control of Rhizoctonia crown and root rot of sugar beet using soil temperature and plant growth stages. Plant Disease. 92 (7), 1091-1098 (2008).
- Ferguson, A., Jeffers, S. Detecting multiple species of Phytophthora in container mixes from ornamental crop nurseries. Plant Disease. 83 (12), 1129-1136 (1999).
- Fong, Y., Anuar, S., Lim, H., Tham, F., Sanderson, F. A modified filter paper technique for long-term preservation of some fungal cultures. Mycologist. 14 (3), 127-130 (2000).
- Rice, W. N. The hemocytometer method for detecting fungus spore load carried by wheat. Proceedings of the Association of Official Seed Analysts of North America. 31, 124-127 (1939).
- Kleczewski, N. M., Egel, D. S. A diagnostic guide for Fusarium wilt of watermelon. Plant Health Progress. 12 (1), 27 (2011).
- Dhingra, O. D., Sinclair, J. B. . Basic plant pathology methods. , (2017).
- Latin, R., Snell, S. Comparison of methods for inoculation of muskmelon with Fusarium oxysporum f. sp. melonis. Plant Disease. 70 (4), 297-300 (1986).
- Martyn, R. An iInitial survey of the United States for races of Fursarium oxysporum f. HortScience. 24 (4), 696-698 (1989).
- Zhou, X., Everts, K. Races and inoculum density of Fusarium oxysporum f. sp. niveum in commercial watermelon fields in Maryland and Delaware. Plant Disease. 87 (6), 692-698 (2003).
- Fulton, J. C., et al. Phylogenetic and phenotypic characterization of Fusarium oxysporum f. sp. niveum isolates from Florida-grown watermelon. PLoS One. 16 (3), 0248364 (2021).
- Zhou, X., Everts, K. Quantification of root and stem colonization of watermelon by Fusarium oxysporum f. sp. niveum and its use in evaluating resistance. Phytopathology. 94 (8), 832-841 (2004).
- Nutter, F. W., Esker, P. D., Netto, R. A. C. Disease assessment concepts and the advancements made in improving the accuracy and precision of plant disease data. European Journal of Plant Pathology. 115 (1), 95-103 (2006).
- Nutter, F., Gleason, M., Jenco, J., Christians, N. Assessing the accuracy, intra-rater repeatability, and inter-rater reliability of disease assessment systems. Phytopathology. 83 (8), 806-812 (1993).
- Chiang, K. -. S., Bock, C. H., Lee, I. -. H., El Jarroudi, M., Delfosse, P. Plant disease severity assessment-how rater bias, assessment method, and experimental design affect hypothesis testing and resource use efficiency. Phytopathology. 106 (12), 1451-1464 (2016).
- Nita, M., Ellis, M., Madden, L. Reliability and accuracy of visual estimation of Phomopsis leaf blight of strawberry. Phytopathology. 93 (8), 995-1005 (2003).
- Zhang, Z., Zhang, J., Wang, Y., Zheng, X. Molecular detection of Fusarium oxysporum f. sp. niveum and Mycosphaerella melonis in infected plant tissues and soil. FEMS Microbiology Letters. 249 (1), 39-47 (2005).
- Lin, Y. -. H., et al. Development of the molecular methods for rapid detection and differentiation of Fusarium oxysporum and F. oxysporum f. sp. niveum in Taiwan. New Biotechnology. 27 (4), 409-418 (2010).
- van Dam, P., de Sain, M., Ter Horst, A., vander Gragt, M., Rep, M. Use of comparative genomics-based markers for discrimination of host specificity in Fusarium oxysporum. Applied and Environmental Microbiology. 84 (1), 01868 (2018).
- Baayen, R. P., et al. Gene genealogies and AFLP analyses in the Fusarium oxysporum complex identify monophyletic and nonmonophyletic formae speciales causing wilt and rot disease. Phytopathology. 90 (8), 891-900 (2000).
- O’Donnell, K., Kistler, H. C., Cigelnik, E., Ploetz, R. C. Multiple evolutionary origins of the fungus causing Panama disease of banana: concordant evidence from nuclear and mitochondrial gene genealogies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2044-2049 (1998).
- Laurence, M., Summerell, B., Liew, E. Fusarium oxysporum f. sp. canariensis: evidence for horizontal gene transfer of putative pathogenicity genes. Plant Pathology. 64 (5), 1068-1075 (2015).
- Hudson, O., et al. Marker development for differentiation of Fusarium oxysporum f. sp. Niveum race 3 from races 1 and 2. International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 822 (2021).
