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Biology

未知の フザリウム・オキシスポラム f.spの人種を決定するために使用された3つの接種技術の対照。 ニベウム 分離

Published: October 28, 2021
doi:
10.3791/63181
, , , , , , , , ,
1Department of Plant Pathology,University of Florida, 2University of Florida Institute of Food and Agricultural Sciences, 3Gulf Coast Research and Education Center,University of Florida, 4Horticultural Sciences Department,University of Florida, 5Tropical Research and Education Center,University of Florida, 6Department of Horticulture,University of Georgia

Summary

スイカのフザリウムのしおれを管理するには、存在する病原体種族の知識が必要です。ここでは、病原性真菌 Fusarium oxysporum f. sp niveum (Fon)のレースタイピングにおけるそれらの有効性を実証するために、根浸漬、寄生カーネル播種、および改変トレイディップ接種法について説明する。

Abstract

フザリウム・オキシスポラム・f・sp・ニベウム(Fon)によって引き起こされるスイカ(Citrullus lanatus)のフザリウム萎凋病は、米国南東部、特にフロリダ州で主要な生産制約として再浮上している。人種特異的な耐性品種などの統合害虫管理戦略を展開するには、栽培者の畑における病原体の多様性と個体群密度に関する情報が必要です。病原体分離株を同定するための分子診断ツールの開発にはいくらかの進歩があるものの、人種決定にはしばしばバイオアッセイアプローチが必要である。

レースタイピングは、4つのスイカディファレンシャル(ブラックダイヤモンド、チャールストングレー、カルフーングレー、植物紹介296341-FR)のそれぞれを用いて、ルートディップ接種、寄生カーネル播種法、および改変トレイディップ法によって実施した。分離株は、接種後5週間で疾患発生率の計算によって人種指定が割り当てられる。特定の品種の植物の33%未満が症候性であった場合、それらは耐性として分類された。発生率が33%を超える品種は感受性とみなされた。本稿では、種族、根浸漬、寄生核、および改変トレイディップ接種を確かめるための3つの異なる接種方法について説明するが、その接種方法は実験計画によって異なる。

Introduction

フザリウム・オキシスポラム種複合体(FOSC)を構成する土壌媒介性真菌は、多様な作物において重篤な病害および収量損失を引き起こす可能性のある、影響力のある半生物栄養性植物病原体である1。F. oxysporum f. sp. niveum(Fon)によって引き起こされるスイカのフザリウム萎凋病は、過去数十年で世界中で範囲、発生率、および重症度が増加しています2,3。苗木では、フザリウムの萎凋病の症状はしばしば減衰に似ています。古い植物では、葉は灰色、クロロチック、および壊死性になります。最終的に、植物のしおれは完全な植物崩壊および死に進行する4。直接的な収量損失は、症状および植物死のために起こり得、一方、間接的な収量損失は、葉面キャノピー5の除去によって引き起こされる太陽の損傷のために起こり得る。有性生殖および関連する生殖構造は、F. oxysporumにおいて観察されたことがない。しかし、病原体は、マイクロコニジアとマクロコニジアの2種類の無性胞子と、クラミドス胞子と呼ばれるより大きく長期的な生存構造を産生し、土壌中で長年生存することができます6。

FOSCは、観察された宿主範囲に基づいてフォルマ科特異種に分類され、通常は1種または数種の宿主種に限定される1。最近の研究は、この種複合体が15種の異なる種の複合体である可能性があることを示しているが、スイカに感染する特定の種は現在不明である7。F. oxysporum f. sp. niveum (Fon) は、シトルラス・ラナトゥスまたは家畜化されたスイカ 8,9 に排他的に感染する系統のグループの名前です。ほとんどの病原性フォルマ科の特殊動物に属するF. oxysporum株は、宿主種に対する遺伝的構成要素および毒性に関して一定レベルの多様性を示す。例えば、ある株は宿主のすべての品種に感染するかもしれないが、別の株はより感受性の高い品種にのみ感染するかもしれない。このような変動を説明するために、これらのグループは、進化的関係または共通の表現型特性に基づいて非公式に人種に分類される。Fon内では、4つの種族(0、1、2、および3)が、選択されたスイカ品種のセットに対する病原性に基づいて特徴付けられており、最近10の種族3の発見が起こった。

この見かけ上の多様性にもかかわらず、胞子または菌糸の形態はフォン種族の種族間で区別できないため、単離物の固有の種族を同定するためには分子または表現型アッセイが必要である11。分子研究は、いくつかの遺伝的な違いを特定しました。例えば、Secreted in Xylem(SIX)エフェクターの役割は、F. oxysporumにおいて長年にわたって研究されており、これらのエフェクターのいくつかは、水平遺伝子導入中に交換される染色体上に配置されている12。たとえば、SIX6 は Fon レース 0 と 1 には見られますが、レース 213 には見つかりません。SIXエフェクターは、トマトおよびバナナにフザリウム萎凋病を引き起こすF. oxysporum f. sp. lycopersiciおよびF. oxysporum f. sp. cubenseの病原性に関与している14,15,16,17。ホウレンソウのフザリウム萎凋病原体であるF. oxysporum f. sp. spiniciaeの系統間のSIXエフェクタープロファイルの解析により、遺伝的および表現型の多様性を正確に反映した分類が可能になった18。しかし、Fon種族の病原性メカニズムの違いは現在完全には理解されておらず、その使用時に開発された分子アッセイは一貫性のない不正確な結果を示している19。したがって、感染アッセイからの表現型結果は、現在、分離株を分類するための最良の方法である。

F. oxysporumは、最初に根を通って宿主に感染し、その後、木部20を登る。これは、所与の宿主品種の根の直接接種をレースタイピングを行うための有効な方法とし、ルートディップおよびトレイディップ接種方法21の基礎となる。宿主に感染していないとき、F. oxysporumは土壌に存在し、何年も休眠状態のままにすることができます。関心のある畑から土壌中に影響を受けやすいスイカ栽培品種を栽培することは、Fonの存在をテストする1つの方法です。故意にFonを蔓延させた土壌中に異なる既知のレベルの抵抗性の品種を含めるようにこの方法を拡張することも、レースタイピングを行う良い方法であり(表1)、寄生カーネル播種法の基礎である。修正トレイディップ法は、オリジナルのトレイディップ法のバリエーションであり、多くの植物や畑の分離株を迅速に調査できるハイスループットのレースタイピングを可能にします22。迅速かつ成功したレースタイピングバイオアッセイの重要な要素には、異なる病原体種に対する耐性の違いを文書化した品種の使用、接種物が感染時に生物学的に活性で豊富であることを保証すること、病原体と宿主の両方を助長する環境を維持すること、および疾患の重症度または発生率について一貫した評価システムを使用することが含まれる。本稿では、上記の原理に基づく表現型レースタイピングのためのルートディップ23,24、寄生カーネルシーディング25,26、および修正トレイディップ22法について説明する。

Protocol

1. ルートディップ法(RDM)による人種の決定 実験環境の整備 症状発現は環境条件に大きく依存するため、管理区域で植物を維持する。相対湿度、温度、光周期、および光強度を監視します(図1)。 温度を26〜28°C、相対湿度を50〜75%に設定し、16時間の光周期を設定して、植物の成長と健康を確保します。注:低酸素症、苗のしおれ、および…

Representative Results

これらの実験は、一般的に栽培されている品種の相対的な耐性を定義するのに役立ちます(表1)。この情報は、地元のフォン個体数に基づいて管理上の推奨事項を導くために使用できます。言い換えれば、人種0または1が商業分野に存在することが知られている場合、農家はカルフーングレイ、サンシュガー、または同等の「耐性」品種を栽培する傾向があるかもしれません。すべ…

Discussion

レースタイピングの3つの方法が提示されている。これらの方法のそれぞれは、特定の質問および実験条件に最も適している。寄生カーネル接種法(土壌侵入)は、おそらくより単純でより単純であり、病原性の評価に特に有用である30。この方法を単純なレースタイピングに使用すると、非常に効果的です。しかし、各植物が同じ程度の感染または曝露に直面しない可能性が?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

アリ博士と植物分子診断研究所、ジョージア大学の平盛智博士のリーダーシップと支援がFonプログラムの確立に貢献したことに感謝します。

Materials

100% Fuller’s Earth Sigma-Aldrich F200-5KG
1 L glass Erlenmeyer Flask PYREX 4980-1L
15 mL falcon tubes Fisher Scientific 14-959-49B
50 mL graduated cylinder Lab Safety Supply 41121805
50 mL Eppendorf Conical Tubes Fisher Scientific 05-413-921
Aluminum foil wrap Reynolds Wrap 720
Bleach Walmart 587192290
Bunsen burner Fisher Scientific 03-391-301
CaCO3 sigma-Aldrich 239216
cell spreaders Fisher Scientific 08-100-11
Cheesecloth Lions Services, Inc 8305-01-125-0725
Clear plastic dishes Visions Wave 999RP6CLSS ~15 cm diameter
Clear vinyl tubing for mushroom bag clamps Shroom Supply 6" for small bag, 8" for medium bag, 10" for large bag
Cotton Balls Fisherbrand 22-456-885 Sterile
Ethanol Fisher Chemical A4094 100%, then combine with water to make 70% for use
Flourescent Tube Lights MaxLume Model T5 2800 K Color Temperature, 24'' or 48'' long
granulated agar VWR International 90000-786
Hand-held Spray Bottle Ability One 24122002 ~0.95 L
hemacytometer Fisher Scientific 02-671-55A Two chamber hemacytometer
Lab trays Fisher Scientific 15-236-2A
Large, sealable plastic bags Ziploc 430805 38 cm x 38 cm
Mister / watering can Bar5F B10H22
Mushroom Bag Clamp Shroom Supply 6" for small bag, 8" for medium bag, 10" for large bag
Nitrile Gloves Fisher Scientific 19-130-1597D
Organic Rye Berries Shroom Supply 0.5 gallon or 25 lb bags
P1000 pipette and tips Fisher Scientific 14-388-100
Petri dishes Fisherbrand FB0875713 Round, 100 mm diameter, 15 mm height
Planting media Jolly Gardener Pro-Line C/B
Plastic Pitcher BrandTech UX0600850 1 L or larger
Plastic planting pots Neo/SCI 01-1177 ~15 cm diameter and ~10 cm height
Plastic, autoclave-safe bin Thermo Scientific UX0601022 3 L
Quarter-strength potato dextrose agar media Cole-Parmer UX1420028 Use powder in combination with recipe for QPDA
Scientific Balance Scale, measuring in g Ohaus 30208458 Any precise scale that can hold and measure 200g will work
Size #4 cork bore Cole-Parmer NC9585352
Small Mushroom grow bag Shroom Supply 0.5 micron filter, also comes in medium and large sizes
Soil trowel Walmart 563876946
Styrofoam flats (6 x 12 cells) Speedling Model TR72A
Styrofoam flats (8 x 16 cells) Speedling Model TR128A
Syringe (5 or 10 mL) fisher Scientific 14-829-19C
Timer Walmart TM-01
V8 Original 100% Vegetable Juice Walmart 564638212
vortex Fisher Scientific 02-215-418
Watermelon Seed – Black Diamond Willhite Seed Inc 17
Watermelon Seed – Calhoun Gray Holmes Seed Company 4440
Watermelon Seed – Charleston Gray Bonnie Plants 7.15339E+11
Watermelon Seed – PI 296341-FR Contact authors Contact authors
Wheat Kernels (Maxie var.) (optional) Alachua County Feed & Seed
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References

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Fulton, J. C., Cullen, M. A., Beckham, K., Sanchez, T., Xu, Z., Stern, P., Vallad, G., Meru, G., McGregor, C., Dufault, N. S. A Contrast of Three Inoculation Techniques used to Determine the Race of Unknown Fusarium oxysporum f.sp. niveum Isolates. J. Vis. Exp. (176), e63181, doi:10.3791/63181 (2021).
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