JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

En kontrast av tre inokuleringstekniker som används för att bestämma rasen av okända Fusarium oxysporum f.sp. niveum Isolat

Published: October 28, 2021
doi:
10.3791/63181
, , , , , , , , ,
1Department of Plant Pathology,University of Florida, 2University of Florida Institute of Food and Agricultural Sciences, 3Gulf Coast Research and Education Center,University of Florida, 4Horticultural Sciences Department,University of Florida, 5Tropical Research and Education Center,University of Florida, 6Department of Horticulture,University of Georgia

Summary

Hantering av Fusarium-vissnande av vattenmelon kräver kunskap om de patogenraser som finns. Här beskriver vi rotdopp, angripen kärnsådd och modifierade brick-dip-inokuleringsmetoder för att visa deras effektivitet vid rastypning av den patogena svampen Fusarium oxysporum f. sp niveum (Fon).

Abstract

Fusarium vissnar av vattenmelon (Citrullus lanatus), orsakad av Fusarium oxysporum f. sp. niveum (Fon), har återkommit som en stor produktionsbegränsning i sydöstra USA, särskilt i Florida. Införandet av integrerade strategier för växtskydd, såsom rasspecifika resistenta sorter, kräver information om patogenens mångfald och befolkningstäthet på odlarnas fält. Trots vissa framsteg när det gäller att utveckla molekylära diagnostiska verktyg för att identifiera patogenisolat kräver rasbestämning ofta bioassay-metoder.

Race typing utfördes genom root-dip inokulering, infekterad kärnsåddmetod och den modifierade brickdoppmetoden med var och en av de fyra vattenmelondifferenserna (Black Diamond, Charleston Grey, Calhoun Grey, Plant Introduction 296341-FR). Isolat tilldelas en rasbeteckning genom beräkning av sjukdomsincidens fem veckor efter ympning. Om mindre än 33% av växterna för en viss sort var symptomatiska, kategoriserades de som resistenta. De sorter med en incidens större än 33% betraktades som mottagliga. Denna uppsats beskriver tre olika metoder för ympning för att fastställa ras, rotdopp, infekterad kärna och modifierad brickdopp-ympning, vars tillämpningar varierar beroende på den experimentella designen.

Introduction

De jordburna svamparna som utgör Fusarium oxysporum-artkomplexet (FOSC) är påverkande hemibiotrofa växtpatogener som kan orsaka allvarlig sjukdom och avkastningsförlust i ett brett spektrum av grödor1. Fusarium vissnar av vattenmelon, orsakad av F. oxysporum f. sp. niveum (Fon), har ökat i omfattning, förekomst och svårighetsgrad över hela världen under de senaste decennierna 2,3. I plantor liknar symtomen på Fusarium ofta dämpning. I äldre växter blir lövverket grått, klorotiskt och nekrotiskt. Så småningom fortskrider växternas vissnande till full växtkollaps och död4. Direkt avkastningsförlust uppstår på grund av symtomen och växtdöden, medan indirekt avkastningsförlust kan uppstå på grund av solskador orsakade av eliminering av bladtaket5. Sexuell reproduktion och tillhörande reproduktionsstrukturer har aldrig observerats i F. oxysporum. Patogenen producerar emellertid två typer av asexuella sporer, mikro- och makrokonidier, liksom större, långsiktiga överlevnadsstrukturer som kallas klamydosporer, som kan överleva i jorden i många år6.

FOSC klassificeras i formae speciales baserat på observerade värdområden, vanligtvis begränsade till en eller ett fåtal värdarter1. Även om ny forskning har visat att detta artkomplex kan vara en sammansättning av 15 olika arter, är de specifika arter som infekterar vattenmelon för närvarande okända7. niveum (Fon) är namnet på de grupper av stammar som uteslutande infekterar Citrullus lanatus eller den domesticerade vattenmelonen 8,9. F. oxysporumstammar inom de flesta patogena formae speciales uppvisar vissa nivåer av mångfald med avseende på deras genetiska komponenter och virulens mot en värdart. Till exempel kan en stam infektera alla sorter av en värd, medan en annan bara kan infektera de mer mottagliga sorterna. För att ta hänsyn till sådan variation klassificeras dessa grupper informellt i raser baserat på evolutionära relationer eller vanliga fenotypiska egenskaper. Inom Fon har fyra raser (0, 1, 2 och 3) karakteriserats baserat på deras patogenicitet mot en uppsättning utvalda vattenmelonsorter, med upptäckten av ras 3 som nyligen inträffade10.

Trots denna uppenbara mångfald kan morfologierna hos sporer eller hyfer inte särskiljas mellan raserna av Fon-raser, vilket innebär att molekylära eller fenotypiska analyser behövs för att identifiera ett isolats unika ras11. Molekylär forskning har identifierat vissa genetiska skillnader. Till exempel har rollen av utsöndrade i Xylem (SIX) effektorer studerats i åratal i F. oxysporum, och några av dessa effektorer har lokaliserats på kromosomerna som utbyts under horisontell genöverföring12. Till exempel finns SIX6 i Fon-loppen 0 och 1 men inte i lopp 213. SIX effektorer har varit inblandade i patogeniciteten hos F. oxysporum f. sp. lycopersici och F. oxysporum f. sp. cubense, vilket orsakar Fusarium-vissnande på tomat respektive banan, 14,15,16,17. Analysen av SIX effektorprofiler bland stammar av F. oxysporum f. sp. spiniciae, Fusarium-vildpatogenen på spenat, har möjliggjort klassificering som exakt återspeglar genetisk och fenotypisk mångfald18. Skillnaderna mellan virulensmekanismer hos Fon-raser är emellertid för närvarande inte helt förstådda, och molekylära analyser som utvecklats vid deras användning har visat inkonsekventa och felaktiga resultat19. Därför är fenotypiska resultat från infektionsanalyser för närvarande det bästa sättet att klassificera isolat.

F. oxysporum infekterar initialt värdar genom rötterna innan de tar sig upp i xylem20. Detta gör direkt ympning av rötterna hos en given värdsort till ett effektivt sätt att utföra rastypning och ligger till grund för rot-dip och brick-dip-inokuleringsmetoderna21. När man inte infekterar en värd ligger F. oxysporum i jorden och kan förbli vilande i flera år. Att odla mottagliga vattenmelonsorter i jord från ett intresseområde är ett sätt att testa för närvaron av Fon. Att utvidga denna metod till att omfatta sorter med olika kända resistensnivåer i jord som medvetet är angripen av Fon är också ett bra sätt att utföra race-typing (tabell 1) och är grunden för den infekterade kärnsåddmetoden. Den modifierade brickdoppmetoden är en variant av den ursprungliga brickdoppmetoden som möjliggör en racetypning med hög genomströmning där många växter och fältisolat kan undersökas snabbt22. Viktiga faktorer för en snabb och framgångsrik bioassay av rastypning inkluderar att använda sorter som har dokumenterade skillnader i resistens mot de olika patogenraserna, säkerställa att ympningen är både biologiskt aktiv och riklig under infektion, upprätthålla en miljö som både är gynnsam för patogenen och värden och använda ett konsekvent klassificeringssystem för svårighetsgrad eller förekomst av sjukdom. Detta dokument beskriver rotdopp23,24, angripen kärnsådd25,26 och modifierade brickdopp22-metoder för fenotypisk rastypning baserat på de principer som beskrivs ovan.

Protocol

1. Bestämning av ras med root-dip-metod (RDM) Förberedelse av experimentmiljön Eftersom symtomuttryck är mycket beroende av miljöförhållanden, behåll växter i ett kontrollerat område. Övervaka relativ luftfuktighet, temperatur, fotoperiod och ljusintensitet (figur 1). Ställ in temperaturen på 26-28 ° C, relativ luftfuktighet till 50-75% och ställ in en 16 timmars fotoperiod för att säkerställa tillräcklig växttillväxt och hälsa…

Representative Results

Dessa experiment hjälper till att definiera den relativa resistensen hos vanligt odlade sorter (tabell 1). Denna information kan sedan användas för att vägleda ledningsrekommendationer baserade på lokala Fon-populationer. Med andra ord, om ras 0 eller 1 är känd för att vara närvarande i ett kommersiellt fält, kan bonden vara benägen att odla en “resistent” sort som Calhoun Gray, Sunsugar eller motsvarande. Resultaten av bioassays med alla metoder visar att när plantorna infekterades med ett R…

Discussion

Tre metoder för rasskrivning har presenterats. Var och en av dessa metoder passar bäst för särskilda frågor och experimentella förhållanden. Den infekterade kärninokuleringsmetoden (jordangrepp) är kanske enklare och enklare, vilket gör den särskilt användbar för bedömning av patogenicitet30. Att använda denna metod för enkel race-typing är mycket effektiv. Att använda metoden för att bestämma resistensen hos en viss sort kan dock vara utmanande, med tanke på att varje växt k…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi vill erkänna Dr. Ali och Plant Molecular Diagnostic Laboratory samt Dr. Pingsheng Ji vid University of Georgia, vars ledarskap och stöd hjälpte till att etablera vårt Fon-program.

Materials

100% Fuller’s Earth Sigma-Aldrich F200-5KG
1 L glass Erlenmeyer Flask PYREX 4980-1L
15 mL falcon tubes Fisher Scientific 14-959-49B
50 mL graduated cylinder Lab Safety Supply 41121805
50 mL Eppendorf Conical Tubes Fisher Scientific 05-413-921
Aluminum foil wrap Reynolds Wrap 720
Bleach Walmart 587192290
Bunsen burner Fisher Scientific 03-391-301
CaCO3 sigma-Aldrich 239216
cell spreaders Fisher Scientific 08-100-11
Cheesecloth Lions Services, Inc 8305-01-125-0725
Clear plastic dishes Visions Wave 999RP6CLSS ~15 cm diameter
Clear vinyl tubing for mushroom bag clamps Shroom Supply 6" for small bag, 8" for medium bag, 10" for large bag
Cotton Balls Fisherbrand 22-456-885 Sterile
Ethanol Fisher Chemical A4094 100%, then combine with water to make 70% for use
Flourescent Tube Lights MaxLume Model T5 2800 K Color Temperature, 24'' or 48'' long
granulated agar VWR International 90000-786
Hand-held Spray Bottle Ability One 24122002 ~0.95 L
hemacytometer Fisher Scientific 02-671-55A Two chamber hemacytometer
Lab trays Fisher Scientific 15-236-2A
Large, sealable plastic bags Ziploc 430805 38 cm x 38 cm
Mister / watering can Bar5F B10H22
Mushroom Bag Clamp Shroom Supply 6" for small bag, 8" for medium bag, 10" for large bag
Nitrile Gloves Fisher Scientific 19-130-1597D
Organic Rye Berries Shroom Supply 0.5 gallon or 25 lb bags
P1000 pipette and tips Fisher Scientific 14-388-100
Petri dishes Fisherbrand FB0875713 Round, 100 mm diameter, 15 mm height
Planting media Jolly Gardener Pro-Line C/B
Plastic Pitcher BrandTech UX0600850 1 L or larger
Plastic planting pots Neo/SCI 01-1177 ~15 cm diameter and ~10 cm height
Plastic, autoclave-safe bin Thermo Scientific UX0601022 3 L
Quarter-strength potato dextrose agar media Cole-Parmer UX1420028 Use powder in combination with recipe for QPDA
Scientific Balance Scale, measuring in g Ohaus 30208458 Any precise scale that can hold and measure 200g will work
Size #4 cork bore Cole-Parmer NC9585352
Small Mushroom grow bag Shroom Supply 0.5 micron filter, also comes in medium and large sizes
Soil trowel Walmart 563876946
Styrofoam flats (6 x 12 cells) Speedling Model TR72A
Styrofoam flats (8 x 16 cells) Speedling Model TR128A
Syringe (5 or 10 mL) fisher Scientific 14-829-19C
Timer Walmart TM-01
V8 Original 100% Vegetable Juice Walmart 564638212
vortex Fisher Scientific 02-215-418
Watermelon Seed – Black Diamond Willhite Seed Inc 17
Watermelon Seed – Calhoun Gray Holmes Seed Company 4440
Watermelon Seed – Charleston Gray Bonnie Plants 7.15339E+11
Watermelon Seed – PI 296341-FR Contact authors Contact authors
Wheat Kernels (Maxie var.) (optional) Alachua County Feed & Seed
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Edel-Hermann, V., Lecomte, C. Current status of Fusarium oxysporum formae speciales and races. Phytopathology. 109 (4), 512-530 (2019).
  2. Everts, K. L., Himmelstein, J. C. Fusarium wilt of watermelon: Towards sustainable management of a re-emerging plant disease. Crop Protection. 73, 93-99 (2015).
  3. Martyn, R. Cucurbitaceae 2012. Proceedings of the Xth EUCARPIA Meeting on Genetics and Breeding of Cucurbitaceae. , 136-156 (2012).
  4. Roberts, P., Dufault, N., Hochmuth, R., Vallad, G., Paret, M. [PP352] Fusarium wilt (Fusarium oxysporum f. sp. niveum) of watermelon. EDIS. 2019 (5), 4 (2019).
  5. Costa, A. E. S., et al. Resistance to Fusarium wilt in watermelon accessions inoculated by chlamydospores. Scientia Horticulturae. 228, 181-186 (2018).
  6. Lombard, L., Sandoval-Denis, M., Lamprecht, S. C., Crous, P. Epitypification of Fusarium oxysporum-clearing the taxonomic chaos. Persoonia: Molecular Phylogeny and Evolution of Fungi. 43, 1 (2019).
  7. Martyn, R. D. Fusarium wilt of watermelon: 120 years of research. Horticultural Reviews. 42 (1), 349-442 (2014).
  8. Zhou, X., Everts, K. Characterization of a regional population of Fusarium oxysporum f. sp. niveum by race, cross pathogenicity, and vegetative compatibility. Phytopathology. 97 (4), 461-469 (2007).
  9. Zhou, X., Everts, K., Bruton, B. Race 3, a new and highly virulent race of Fusarium oxysporum f. sp. niveum causing Fusarium wilt in watermelon. Plant Disease. 94 (1), 92-98 (2010).
  10. Leslie, J. F., Summerell, B. A. . The Fusarium laboratory manual. , (2008).
  11. Lo Presti, L., et al. Fungal effectors and plant susceptibility. Annual Review of Plant Biology. 66, 513-545 (2015).
  12. Niu, X., et al. The FonSIX6 gene acts as an avirulence effector in the Fusarium oxysporum f. sp. niveum-watermelon pathosystem. Scientific Reports. 6 (1), 1-7 (2016).
  13. Lievens, B., Houterman, P. M., Rep, M. Effector gene screening allows unambiguous identification of Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici races and discrimination from other formae speciales. FEMS Microbiology Letters. 300 (2), 201-215 (2009).
  14. Houterman, P. M., Cornelissen, B. J., Rep, M. Suppression of plant resistance gene-based immunity by a fungal effector. PLoS Pathogens. 4 (5), 1000061 (2008).
  15. Houterman, P. M., et al. The effector protein Avr2 of the xylem-colonizing fungus Fusarium oxysporum activates the tomato resistance protein I-2 intracellularly. The Plant Journal. 58 (6), 970-978 (2009).
  16. Czislowski, E., et al. Investigation of the diversity of effector genes in the banana pathogen, Fusarium oxysporum f. sp. cubense, reveals evidence of horizontal gene transfer. Molecular Plant Pathology. 19 (5), 1155-1171 (2018).
  17. Batson, A. M., Fokkens, L., Rep, M., du Toit, L. J. Putative effector genes distinguish two pathogenicity groups of Fusarium oxysporum f. sp. spinaciae. Molecular Plant-Microbe Interactions. 34 (2), 141-156 (2021).
  18. Keinath, A. P., DuBose, V. B., Katawczik, M. M., Wechter, W. P. Identifying races of Fusarium oxysporum f. sp. niveum in South Carolina recovered from watermelon seedlings, plants, and field soil. Plant Disease. 104 (9), 2481-2488 (2020).
  19. Gordon, T. R. Fusarium oxysporum and the Fusarium wilt syndrome. Annual Review of Phytopathology. 55, 23-39 (2017).
  20. Martyn, R., Netzer, D. Resistance to races 0, 1, and 2 of Fusarium wilt of watermelon in Citrullus sp. PI-296341-FR. HortScience. 26 (4), 429-432 (1991).
  21. Meru, G., McGregor, C. Genotyping by sequencing for SNP discovery and genetic mapping of resistance to race 1 of Fusarium oxysporum in watermelon. Scientia Horticulturae. 209, 31-40 (2016).
  22. Freeman, S., Rodriguez, R. A rapid inoculation technique for assessing pathogenicity of Fusarium oxysporum f. sp. niveum and F. o. melonis on cucurbits. Plant Disease. 77 (12), 1198-1201 (1993).
  23. Martyn, R. Fusarium oxysporum f. sp. niveum race 2: A highly aggressive race new to the United States. Plant Disease. 71 (3), 233-236 (1987).
  24. Lai, X., et al. Evaluating inoculation methods to infect sugar beet with Fusarium oxysporum f. Beat and F. secorum. Plant Disease. 104 (5), 1312-1317 (2020).
  25. Kirk, W., et al. Optimizing fungicide timing for the control of Rhizoctonia crown and root rot of sugar beet using soil temperature and plant growth stages. Plant Disease. 92 (7), 1091-1098 (2008).
  26. Ferguson, A., Jeffers, S. Detecting multiple species of Phytophthora in container mixes from ornamental crop nurseries. Plant Disease. 83 (12), 1129-1136 (1999).
  27. Fong, Y., Anuar, S., Lim, H., Tham, F., Sanderson, F. A modified filter paper technique for long-term preservation of some fungal cultures. Mycologist. 14 (3), 127-130 (2000).
  28. Rice, W. N. The hemocytometer method for detecting fungus spore load carried by wheat. Proceedings of the Association of Official Seed Analysts of North America. 31, 124-127 (1939).
  29. Kleczewski, N. M., Egel, D. S. A diagnostic guide for Fusarium wilt of watermelon. Plant Health Progress. 12 (1), 27 (2011).
  30. Dhingra, O. D., Sinclair, J. B. . Basic plant pathology methods. , (2017).
  31. Latin, R., Snell, S. Comparison of methods for inoculation of muskmelon with Fusarium oxysporum f. sp. melonis. Plant Disease. 70 (4), 297-300 (1986).
  32. Martyn, R. An iInitial survey of the United States for races of Fursarium oxysporum f. HortScience. 24 (4), 696-698 (1989).
  33. Zhou, X., Everts, K. Races and inoculum density of Fusarium oxysporum f. sp. niveum in commercial watermelon fields in Maryland and Delaware. Plant Disease. 87 (6), 692-698 (2003).
  34. Fulton, J. C., et al. Phylogenetic and phenotypic characterization of Fusarium oxysporum f. sp. niveum isolates from Florida-grown watermelon. PLoS One. 16 (3), 0248364 (2021).
  35. Zhou, X., Everts, K. Quantification of root and stem colonization of watermelon by Fusarium oxysporum f. sp. niveum and its use in evaluating resistance. Phytopathology. 94 (8), 832-841 (2004).
  36. Nutter, F. W., Esker, P. D., Netto, R. A. C. Disease assessment concepts and the advancements made in improving the accuracy and precision of plant disease data. European Journal of Plant Pathology. 115 (1), 95-103 (2006).
  37. Nutter, F., Gleason, M., Jenco, J., Christians, N. Assessing the accuracy, intra-rater repeatability, and inter-rater reliability of disease assessment systems. Phytopathology. 83 (8), 806-812 (1993).
  38. Chiang, K. -. S., Bock, C. H., Lee, I. -. H., El Jarroudi, M., Delfosse, P. Plant disease severity assessment-how rater bias, assessment method, and experimental design affect hypothesis testing and resource use efficiency. Phytopathology. 106 (12), 1451-1464 (2016).
  39. Nita, M., Ellis, M., Madden, L. Reliability and accuracy of visual estimation of Phomopsis leaf blight of strawberry. Phytopathology. 93 (8), 995-1005 (2003).
  40. Zhang, Z., Zhang, J., Wang, Y., Zheng, X. Molecular detection of Fusarium oxysporum f. sp. niveum and Mycosphaerella melonis in infected plant tissues and soil. FEMS Microbiology Letters. 249 (1), 39-47 (2005).
  41. Lin, Y. -. H., et al. Development of the molecular methods for rapid detection and differentiation of Fusarium oxysporum and F. oxysporum f. sp. niveum in Taiwan. New Biotechnology. 27 (4), 409-418 (2010).
  42. van Dam, P., de Sain, M., Ter Horst, A., vander Gragt, M., Rep, M. Use of comparative genomics-based markers for discrimination of host specificity in Fusarium oxysporum. Applied and Environmental Microbiology. 84 (1), 01868 (2018).
  43. Baayen, R. P., et al. Gene genealogies and AFLP analyses in the Fusarium oxysporum complex identify monophyletic and nonmonophyletic formae speciales causing wilt and rot disease. Phytopathology. 90 (8), 891-900 (2000).
  44. O’Donnell, K., Kistler, H. C., Cigelnik, E., Ploetz, R. C. Multiple evolutionary origins of the fungus causing Panama disease of banana: concordant evidence from nuclear and mitochondrial gene genealogies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2044-2049 (1998).
  45. Laurence, M., Summerell, B., Liew, E. Fusarium oxysporum f. sp. canariensis: evidence for horizontal gene transfer of putative pathogenicity genes. Plant Pathology. 64 (5), 1068-1075 (2015).
  46. Hudson, O., et al. Marker development for differentiation of Fusarium oxysporum f. sp. Niveum race 3 from races 1 and 2. International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 822 (2021).

Tags

Fusarium WiltRace-typingBioassayInoculationWatermelonPathogenDisease ManagementPlant HealthV8 Juice MediumPotato Dextrose AgarConidiaSpore QuantificationBleachPlantletsRoot Rinsing
check_url/63181?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Fulton, J. C., Cullen, M. A., Beckham, K., Sanchez, T., Xu, Z., Stern, P., Vallad, G., Meru, G., McGregor, C., Dufault, N. S. A Contrast of Three Inoculation Techniques used to Determine the Race of Unknown Fusarium oxysporum f.sp. niveum Isolates. J. Vis. Exp. (176), e63181, doi:10.3791/63181 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image