JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Biology

En kontrast mellem tre podningsteknikker, der bruges til at bestemme løbet af ukendt Fusarium oxysporum f.sp. niveum Isolater

Published: October 28, 2021
doi:
10.3791/63181
, , , , , , , , ,
1Department of Plant Pathology,University of Florida, 2University of Florida Institute of Food and Agricultural Sciences, 3Gulf Coast Research and Education Center,University of Florida, 4Horticultural Sciences Department,University of Florida, 5Tropical Research and Education Center,University of Florida, 6Department of Horticulture,University of Georgia

Summary

Håndtering af Fusarium vilje af vandmelon kræver viden om de tilstedeværende patogenløb. Her beskriver vi roddyp, inficeret kernesåning og modificerede tray-dip-podningsmetoder for at demonstrere deres effektivitet ved race-typning af den patogene svamp Fusarium oxysporum f. sp niveum (Fon).

Abstract

Fusarium vilje af vandmelon (Citrullus lanatus), forårsaget af Fusarium oxysporum f. sp. niveum (Fon), er genopstået som en stor produktionsbegrænsning i det sydøstlige USA, især i Florida. Indførelse af integrerede skadedyrsbekæmpelsesstrategier, såsom racespecifikke resistente sorter, kræver oplysninger om patogenets mangfoldighed og befolkningstæthed på avlernes marker. På trods af visse fremskridt med at udvikle molekylære diagnostiske værktøjer til identifikation af patogenisolater kræver racebestemmelse ofte bioassay-tilgange.

Race typing blev udført ved rod-dip podning, inficeret kerne såning metode, og den modificerede bakke-dip metode med hver af de fire vandmelon forskelle (Black Diamond, Charleston Grey, Calhoun Grey, Plant Introduction 296341-FR). Isolater tildeles en racebetegnelse ved beregning af sygdomsforekomst fem uger efter podning. Hvis mindre end 33% af planterne for en bestemt sort var symptomatiske, blev de kategoriseret som resistente. De sorter med en forekomst på over 33 % blev betragtet som modtagelige. Dette papir beskriver tre forskellige metoder til podning for at fastslå race, roddip, inficeret kerne og modificeret bakke-dip-podning, hvis anvendelser varierer alt efter det eksperimentelle design.

Introduction

De jordbårne svampe, der udgør Fusarium oxysporum artskomplekset (FOSC), er virkningsfulde hemibiotrofe plantepatogener, der kan forårsage alvorlig sygdom og udbyttetab i en bred vifte af afgrøder1. Fusarium vilje af vandmelon, forårsaget af F. oxysporum f. sp. niveum (Fon), har været stigende i omfang, forekomst og sværhedsgrad over hele verden i de sidste årtier 2,3. I frøplanter ligner symptomerne på Fusarium-vilje ofte dæmpning. I ældre planter bliver løvet gråt, klorotisk og nekrotisk. Til sidst udvikler planternes visning sig til fuld plantekollaps og død4. Direkte udbyttetab opstår på grund af symptomerne og plantedøden, mens indirekte udbyttetab kan forekomme på grund af solskader forårsaget af eliminering af bladbaldakinen5. Seksuel reproduktion og tilhørende reproduktive strukturer er aldrig blevet observeret i F. oxysporum. Patogenet producerer imidlertid to typer aseksuelle sporer, mikro- og makrokonidier, samt større, langsigtede overlevelsesstrukturer kaldet chlamydosporer, som kan overleve i jorden i mange år6.

FOSC er klassificeret i formae speciales baseret på observerede værtsområder, normalt begrænset til en eller nogle få værtsarter1. Selvom nyere forskning har vist, at dette artskompleks kan være en sammensætning af 15 forskellige arter, er de særlige arter, der inficerer vandmelon, i øjeblikket ukendte7. F. oxysporum f. sp. niveum (Fon) er navnet på de grupper af stammer, der udelukkende inficerer Citrullus lanatus eller den domesticerede vandmelon 8,9. F. oxysporumstammer inden for de fleste patogene formae speciales viser visse niveauer af mangfoldighed med hensyn til deres genetiske komponenter og virulens over for en værtsart. For eksempel kan en stamme inficere alle sorter af en vært, mens en anden kun kan inficere de mere modtagelige sorter. For at tage højde for en sådan variation klassificeres disse grupper uformelt i racer baseret på evolutionære relationer eller fælles fænotypiske egenskaber. Inden for Fon er fire racer (0, 1, 2 og 3) blevet karakteriseret ud fra deres patogenicitet mod et sæt udvalgte vandmelonsorter, hvor opdagelsen af race 3 for nylig fandt sted10.

På trods af denne tilsyneladende mangfoldighed kan morfologierne af sporer eller hyfer ikke skelnes mellem racerne i Fon-racer, hvilket betyder, at molekylære eller fænotypiske assays er nødvendige for at identificere et isolats unikke race11. Molekylær forskning har identificeret nogle genetiske forskelle. For eksempel er rollen som udskilt i Xylem (SIX) effektorer blevet undersøgt i årevis i F. oxysporum, og nogle af disse effektorer er blevet placeret på kromosomerne udvekslet under vandret genoverførsel12. For eksempel findes SIX6 i Fon-løb 0 og 1, men ikke i løb 213. SEKS effektorer har været impliceret i patogeniciteten af F. oxysporum f. sp. lycopersici og F. oxysporum f. sp. cubense, som forårsager Fusarium vilje på henholdsvis tomat og banan, henholdsvis 14,15,16,17. Analysen af SIX effektorprofiler blandt stammer af F. oxysporum f. sp. spiniciae, Fusarium wilt patogen på spinat, har muliggjort klassificering, der nøjagtigt afspejler genetisk og fænotypisk mangfoldighed18. Imidlertid er forskellene mellem virulensmekanismer i Fon-racer i øjeblikket ikke helt forstået, og molekylære assays udviklet ved deres anvendelse har vist inkonsekvente og unøjagtige resultater19. Derfor er fænotypiske resultater fra infektionsassays i øjeblikket den bedste måde at klassificere isolater på.

F. oxysporum inficerer oprindeligt værter gennem rødderne, før de gør sin vej op ad xylem20. Dette gør direkte podning af rødderne af en given værtskultivar til en effektiv måde at udføre race-typing på og er grundlaget for root-dip og tray-dippodningsmetoderne 21. Når man ikke inficerer en vært, bor F. oxysporum i jorden og kan forblive sovende i årevis. Voksende modtagelige vandmelonsorter i jord fra et interesseområde er en måde at teste for tilstedeværelsen af Fon. Udvidelse af denne metode til at omfatte sorter af forskellige kendte resistensniveauer i jord, der bevidst er inficeret med Fon, er også en god måde at udføre race-typing (tabel 1) og er grundlaget for den inficerede kernesåningsmetode. Den modificerede tray-dip-metode er en variation af den oprindelige tray-dip-metode, der giver mulighed for en race-typing med høj gennemstrømning, hvor mange planter og markisolater hurtigt kan undersøges22. Vigtige faktorer for et hurtigt og vellykket racetypebioassay omfatter anvendelse af sorter, der har dokumenteret forskelle i resistens over for de forskellige patogenracer, sikring af, at inokulumet er både biologisk aktivt og rigeligt under infektion, opretholdelse af et miljø, der både er befordrende for patogenet og værten, og ved hjælp af et konsekvent klassificeringssystem for sværhedsgrad eller forekomst af sygdom. Dette papir beskriver root-dip23,24, inficeret kernesåning25,26 og modificerede tray-dip22 metoder til fænotypisk race-typing baseret på de ovenfor beskrevne principper.

Protocol

1. Bestemmelse af race ved hjælp af roddypmetode (RDM) Forberedelse af forsøgsmiljøet Fordi symptomekspression er meget afhængig af miljøforholdene, skal du opretholde planter i et kontrolleret område. Overvåg relativ luftfugtighed, temperatur, fotoopår og lysintensitet (figur 1). Indstil temperaturen til 26-28 °C, relativ luftfugtighed til 50-75 %, og indstil en fotoperiode på 16 timer for at sikre tilstrækkelig plantevækst og sundhed.<…

Representative Results

Disse eksperimenter hjælper med at definere den relative resistens af almindeligt dyrkede sorter (tabel 1). Disse oplysninger kan derefter bruges til at guide ledelsesanbefalinger baseret på lokale Fon-populationer. Med andre ord, hvis race 0 eller 1 vides at være til stede i et kommercielt felt, kan landmanden være tilbøjelig til at dyrke en “resistent” sort som Calhoun Gray, Sunsugar eller tilsvarende. Resultaterne af bioassays ved hjælp af alle metoder viser, at når frøplanterne blev inficeret…

Discussion

Tre metoder til race typing er blevet præsenteret. Hver af disse metoder er bedst egnet til bestemte spørgsmål og eksperimentelle forhold. Den angrebne kernepodningsmetode (jordangreb) er måske enklere og mere ligetil, hvilket gør den særlig nyttig til vurdering af patogenicitet30. Brug af denne metode til simpel race-typing er yderst effektiv. Det kan imidlertid være en udfordring at anvende metoden til at bestemme resistensen af en bestemt sort, da hver plante muligvis ikke står over for…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi vil gerne anerkende Dr. Ali og Plant Molecular Diagnostic Laboratory samt Dr. Pingsheng Ji ved University of Georgia, hvis ledelse og støtte hjalp med at etablere vores Fon-program.

Materials

100% Fuller’s Earth Sigma-Aldrich F200-5KG
1 L glass Erlenmeyer Flask PYREX 4980-1L
15 mL falcon tubes Fisher Scientific 14-959-49B
50 mL graduated cylinder Lab Safety Supply 41121805
50 mL Eppendorf Conical Tubes Fisher Scientific 05-413-921
Aluminum foil wrap Reynolds Wrap 720
Bleach Walmart 587192290
Bunsen burner Fisher Scientific 03-391-301
CaCO3 sigma-Aldrich 239216
cell spreaders Fisher Scientific 08-100-11
Cheesecloth Lions Services, Inc 8305-01-125-0725
Clear plastic dishes Visions Wave 999RP6CLSS ~15 cm diameter
Clear vinyl tubing for mushroom bag clamps Shroom Supply 6" for small bag, 8" for medium bag, 10" for large bag
Cotton Balls Fisherbrand 22-456-885 Sterile
Ethanol Fisher Chemical A4094 100%, then combine with water to make 70% for use
Flourescent Tube Lights MaxLume Model T5 2800 K Color Temperature, 24'' or 48'' long
granulated agar VWR International 90000-786
Hand-held Spray Bottle Ability One 24122002 ~0.95 L
hemacytometer Fisher Scientific 02-671-55A Two chamber hemacytometer
Lab trays Fisher Scientific 15-236-2A
Large, sealable plastic bags Ziploc 430805 38 cm x 38 cm
Mister / watering can Bar5F B10H22
Mushroom Bag Clamp Shroom Supply 6" for small bag, 8" for medium bag, 10" for large bag
Nitrile Gloves Fisher Scientific 19-130-1597D
Organic Rye Berries Shroom Supply 0.5 gallon or 25 lb bags
P1000 pipette and tips Fisher Scientific 14-388-100
Petri dishes Fisherbrand FB0875713 Round, 100 mm diameter, 15 mm height
Planting media Jolly Gardener Pro-Line C/B
Plastic Pitcher BrandTech UX0600850 1 L or larger
Plastic planting pots Neo/SCI 01-1177 ~15 cm diameter and ~10 cm height
Plastic, autoclave-safe bin Thermo Scientific UX0601022 3 L
Quarter-strength potato dextrose agar media Cole-Parmer UX1420028 Use powder in combination with recipe for QPDA
Scientific Balance Scale, measuring in g Ohaus 30208458 Any precise scale that can hold and measure 200g will work
Size #4 cork bore Cole-Parmer NC9585352
Small Mushroom grow bag Shroom Supply 0.5 micron filter, also comes in medium and large sizes
Soil trowel Walmart 563876946
Styrofoam flats (6 x 12 cells) Speedling Model TR72A
Styrofoam flats (8 x 16 cells) Speedling Model TR128A
Syringe (5 or 10 mL) fisher Scientific 14-829-19C
Timer Walmart TM-01
V8 Original 100% Vegetable Juice Walmart 564638212
vortex Fisher Scientific 02-215-418
Watermelon Seed – Black Diamond Willhite Seed Inc 17
Watermelon Seed – Calhoun Gray Holmes Seed Company 4440
Watermelon Seed – Charleston Gray Bonnie Plants 7.15339E+11
Watermelon Seed – PI 296341-FR Contact authors Contact authors
Wheat Kernels (Maxie var.) (optional) Alachua County Feed & Seed
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Edel-Hermann, V., Lecomte, C. Current status of Fusarium oxysporum formae speciales and races. Phytopathology. 109 (4), 512-530 (2019).
  2. Everts, K. L., Himmelstein, J. C. Fusarium wilt of watermelon: Towards sustainable management of a re-emerging plant disease. Crop Protection. 73, 93-99 (2015).
  3. Martyn, R. Cucurbitaceae 2012. Proceedings of the Xth EUCARPIA Meeting on Genetics and Breeding of Cucurbitaceae. , 136-156 (2012).
  4. Roberts, P., Dufault, N., Hochmuth, R., Vallad, G., Paret, M. [PP352] Fusarium wilt (Fusarium oxysporum f. sp. niveum) of watermelon. EDIS. 2019 (5), 4 (2019).
  5. Costa, A. E. S., et al. Resistance to Fusarium wilt in watermelon accessions inoculated by chlamydospores. Scientia Horticulturae. 228, 181-186 (2018).
  6. Lombard, L., Sandoval-Denis, M., Lamprecht, S. C., Crous, P. Epitypification of Fusarium oxysporum-clearing the taxonomic chaos. Persoonia: Molecular Phylogeny and Evolution of Fungi. 43, 1 (2019).
  7. Martyn, R. D. Fusarium wilt of watermelon: 120 years of research. Horticultural Reviews. 42 (1), 349-442 (2014).
  8. Zhou, X., Everts, K. Characterization of a regional population of Fusarium oxysporum f. sp. niveum by race, cross pathogenicity, and vegetative compatibility. Phytopathology. 97 (4), 461-469 (2007).
  9. Zhou, X., Everts, K., Bruton, B. Race 3, a new and highly virulent race of Fusarium oxysporum f. sp. niveum causing Fusarium wilt in watermelon. Plant Disease. 94 (1), 92-98 (2010).
  10. Leslie, J. F., Summerell, B. A. . The Fusarium laboratory manual. , (2008).
  11. Lo Presti, L., et al. Fungal effectors and plant susceptibility. Annual Review of Plant Biology. 66, 513-545 (2015).
  12. Niu, X., et al. The FonSIX6 gene acts as an avirulence effector in the Fusarium oxysporum f. sp. niveum-watermelon pathosystem. Scientific Reports. 6 (1), 1-7 (2016).
  13. Lievens, B., Houterman, P. M., Rep, M. Effector gene screening allows unambiguous identification of Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici races and discrimination from other formae speciales. FEMS Microbiology Letters. 300 (2), 201-215 (2009).
  14. Houterman, P. M., Cornelissen, B. J., Rep, M. Suppression of plant resistance gene-based immunity by a fungal effector. PLoS Pathogens. 4 (5), 1000061 (2008).
  15. Houterman, P. M., et al. The effector protein Avr2 of the xylem-colonizing fungus Fusarium oxysporum activates the tomato resistance protein I-2 intracellularly. The Plant Journal. 58 (6), 970-978 (2009).
  16. Czislowski, E., et al. Investigation of the diversity of effector genes in the banana pathogen, Fusarium oxysporum f. sp. cubense, reveals evidence of horizontal gene transfer. Molecular Plant Pathology. 19 (5), 1155-1171 (2018).
  17. Batson, A. M., Fokkens, L., Rep, M., du Toit, L. J. Putative effector genes distinguish two pathogenicity groups of Fusarium oxysporum f. sp. spinaciae. Molecular Plant-Microbe Interactions. 34 (2), 141-156 (2021).
  18. Keinath, A. P., DuBose, V. B., Katawczik, M. M., Wechter, W. P. Identifying races of Fusarium oxysporum f. sp. niveum in South Carolina recovered from watermelon seedlings, plants, and field soil. Plant Disease. 104 (9), 2481-2488 (2020).
  19. Gordon, T. R. Fusarium oxysporum and the Fusarium wilt syndrome. Annual Review of Phytopathology. 55, 23-39 (2017).
  20. Martyn, R., Netzer, D. Resistance to races 0, 1, and 2 of Fusarium wilt of watermelon in Citrullus sp. PI-296341-FR. HortScience. 26 (4), 429-432 (1991).
  21. Meru, G., McGregor, C. Genotyping by sequencing for SNP discovery and genetic mapping of resistance to race 1 of Fusarium oxysporum in watermelon. Scientia Horticulturae. 209, 31-40 (2016).
  22. Freeman, S., Rodriguez, R. A rapid inoculation technique for assessing pathogenicity of Fusarium oxysporum f. sp. niveum and F. o. melonis on cucurbits. Plant Disease. 77 (12), 1198-1201 (1993).
  23. Martyn, R. Fusarium oxysporum f. sp. niveum race 2: A highly aggressive race new to the United States. Plant Disease. 71 (3), 233-236 (1987).
  24. Lai, X., et al. Evaluating inoculation methods to infect sugar beet with Fusarium oxysporum f. Beat and F. secorum. Plant Disease. 104 (5), 1312-1317 (2020).
  25. Kirk, W., et al. Optimizing fungicide timing for the control of Rhizoctonia crown and root rot of sugar beet using soil temperature and plant growth stages. Plant Disease. 92 (7), 1091-1098 (2008).
  26. Ferguson, A., Jeffers, S. Detecting multiple species of Phytophthora in container mixes from ornamental crop nurseries. Plant Disease. 83 (12), 1129-1136 (1999).
  27. Fong, Y., Anuar, S., Lim, H., Tham, F., Sanderson, F. A modified filter paper technique for long-term preservation of some fungal cultures. Mycologist. 14 (3), 127-130 (2000).
  28. Rice, W. N. The hemocytometer method for detecting fungus spore load carried by wheat. Proceedings of the Association of Official Seed Analysts of North America. 31, 124-127 (1939).
  29. Kleczewski, N. M., Egel, D. S. A diagnostic guide for Fusarium wilt of watermelon. Plant Health Progress. 12 (1), 27 (2011).
  30. Dhingra, O. D., Sinclair, J. B. . Basic plant pathology methods. , (2017).
  31. Latin, R., Snell, S. Comparison of methods for inoculation of muskmelon with Fusarium oxysporum f. sp. melonis. Plant Disease. 70 (4), 297-300 (1986).
  32. Martyn, R. An iInitial survey of the United States for races of Fursarium oxysporum f. HortScience. 24 (4), 696-698 (1989).
  33. Zhou, X., Everts, K. Races and inoculum density of Fusarium oxysporum f. sp. niveum in commercial watermelon fields in Maryland and Delaware. Plant Disease. 87 (6), 692-698 (2003).
  34. Fulton, J. C., et al. Phylogenetic and phenotypic characterization of Fusarium oxysporum f. sp. niveum isolates from Florida-grown watermelon. PLoS One. 16 (3), 0248364 (2021).
  35. Zhou, X., Everts, K. Quantification of root and stem colonization of watermelon by Fusarium oxysporum f. sp. niveum and its use in evaluating resistance. Phytopathology. 94 (8), 832-841 (2004).
  36. Nutter, F. W., Esker, P. D., Netto, R. A. C. Disease assessment concepts and the advancements made in improving the accuracy and precision of plant disease data. European Journal of Plant Pathology. 115 (1), 95-103 (2006).
  37. Nutter, F., Gleason, M., Jenco, J., Christians, N. Assessing the accuracy, intra-rater repeatability, and inter-rater reliability of disease assessment systems. Phytopathology. 83 (8), 806-812 (1993).
  38. Chiang, K. -. S., Bock, C. H., Lee, I. -. H., El Jarroudi, M., Delfosse, P. Plant disease severity assessment-how rater bias, assessment method, and experimental design affect hypothesis testing and resource use efficiency. Phytopathology. 106 (12), 1451-1464 (2016).
  39. Nita, M., Ellis, M., Madden, L. Reliability and accuracy of visual estimation of Phomopsis leaf blight of strawberry. Phytopathology. 93 (8), 995-1005 (2003).
  40. Zhang, Z., Zhang, J., Wang, Y., Zheng, X. Molecular detection of Fusarium oxysporum f. sp. niveum and Mycosphaerella melonis in infected plant tissues and soil. FEMS Microbiology Letters. 249 (1), 39-47 (2005).
  41. Lin, Y. -. H., et al. Development of the molecular methods for rapid detection and differentiation of Fusarium oxysporum and F. oxysporum f. sp. niveum in Taiwan. New Biotechnology. 27 (4), 409-418 (2010).
  42. van Dam, P., de Sain, M., Ter Horst, A., vander Gragt, M., Rep, M. Use of comparative genomics-based markers for discrimination of host specificity in Fusarium oxysporum. Applied and Environmental Microbiology. 84 (1), 01868 (2018).
  43. Baayen, R. P., et al. Gene genealogies and AFLP analyses in the Fusarium oxysporum complex identify monophyletic and nonmonophyletic formae speciales causing wilt and rot disease. Phytopathology. 90 (8), 891-900 (2000).
  44. O’Donnell, K., Kistler, H. C., Cigelnik, E., Ploetz, R. C. Multiple evolutionary origins of the fungus causing Panama disease of banana: concordant evidence from nuclear and mitochondrial gene genealogies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2044-2049 (1998).
  45. Laurence, M., Summerell, B., Liew, E. Fusarium oxysporum f. sp. canariensis: evidence for horizontal gene transfer of putative pathogenicity genes. Plant Pathology. 64 (5), 1068-1075 (2015).
  46. Hudson, O., et al. Marker development for differentiation of Fusarium oxysporum f. sp. Niveum race 3 from races 1 and 2. International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 822 (2021).

Tags

Fusarium WiltRace-typingBioassayInoculationWatermelonPathogenDisease ManagementPlant HealthV8 Juice MediumPotato Dextrose AgarConidiaSpore QuantificationBleachPlantletsRoot Rinsing
check_url/63181?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Fulton, J. C., Cullen, M. A., Beckham, K., Sanchez, T., Xu, Z., Stern, P., Vallad, G., Meru, G., McGregor, C., Dufault, N. S. A Contrast of Three Inoculation Techniques used to Determine the Race of Unknown Fusarium oxysporum f.sp. niveum Isolates. J. Vis. Exp. (176), e63181, doi:10.3791/63181 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image