Ensayo de extremidades recombinantes de pollo para comprender la morfogénesis, los patrones y los primeros pasos en la diferenciación celular
Summary
Las extremidades recombinantes son un potente modelo experimental que permite estudiar el proceso de diferenciación celular y la generación de patrones bajo la influencia de señales embrionarias. Este protocolo presenta un método detallado para generar extremidades recombinantes con células mesodérmicas de extremidades de pollo, adaptables a otros tipos de células obtenidas de diferentes organismos.
Abstract
La diferenciación celular es el proceso afinado del compromiso celular que conduce a la formación de diferentes tipos de células especializadas durante el establecimiento de tejidos y órganos en desarrollo. Este proceso se mantiene activamente en la edad adulta. La diferenciación celular es un proceso continuo durante el desarrollo y la homeostasis de los órganos. Comprender los primeros pasos de la diferenciación celular es fundamental para conocer otros procesos complejos como la morfogénesis. Por lo tanto, las extremidades de pollo recombinantes son un modelo experimental que permite el estudio de la diferenciación celular y la generación de patrones bajo señales de patrones embrionarios. Este modelo experimental imita un entorno in vivo ; ensambla células reagregadas en una cubierta ectodérmica obtenida de una yema de extremidad temprana. Posteriormente, los ectodermos se transfieren e implantan en un receptor embrionario de pollito para permitir su desarrollo. Este ensayo se utilizó principalmente para evaluar las células de las yemas de las extremidades mesodérmicas; sin embargo, se puede aplicar a otras células madre o progenitoras de otros organismos.
Introduction
La extremidad de los vertebrados es un modelo formidable para estudiar la diferenciación celular, la proliferación celular, la muerte celular, la formación de patrones y la morfogénesis 1,2. Durante el desarrollo, las extremidades emergen como protuberancias de las células derivadas del mesodermo de la placa lateral1. Las yemas de las extremidades consisten en un núcleo central de células mesodérmicas cubiertas por un ectodermo. De esta estructura temprana, emerge una extremidad completa y bien formada. Después de que surge la yema de la extremidad, se reconocen tres ejes: (1) el eje proximo-distal ([PD] hombro a dedos), (2) el eje dorso-ventral ([DV] desde el dorso de la mano hasta la palma de la mano) y (3) el anterior-posterior ([AP] pulgar a dedo). El eje proximal-distal depende de la cresta ectodérmica apical (AER), ectodermo especializado ubicado en la punta distal de la yema de la extremidad. El REA es necesario para el crecimiento, el mantenimiento de la supervivencia, la proliferación y el estado indiferenciado de las células que reciben señales 2,3. Por otro lado, la zona de actividad polarizante (ZPA) controla el patrón anteroposterior4, mientras que el dorsal y el ectodermo controlan el patrón dorsoventral 7,8. La integración de patrones tridimensionales implica una diafonía compleja entre estos tres ejes5. A pesar de comprender la vía molecular durante el desarrollo de las extremidades, las preguntas abiertas sobre los mecanismos que controlan el patrón y el crecimiento adecuado para formar una extremidad completa permanecen sin respuesta.
Edgar Zwilling desarrolló el sistema de extremidades recombinantes (RL) en 1964 para estudiar las interacciones entre las células mesenquimales de las extremidades y el ectodermo en las extremidades en desarrollo6. El sistema RL ensambla el mesodermo de la yema de la extremidad disociada-reagregada en el ectodermo de la extremidad embrionaria para injertarlo en la parte dorsal de un embrión de pollito donante. Las señales proporcionadas por el ectodermo inducen la expresión de genes de diferenciación y genes de patrones de manera espacio-temporal, induciendo así la formación de una estructura similar a una extremidad que puede recapitular los programas celulares que ocurren durante el desarrollo de las extremidades 7,8,9.
El modelo RL es valioso para comprender las propiedades de los componentes de las extremidades y la interacción entre las células mesodérmicas y ectodérmicas6. Un RL se puede definir como una estructura similar a una extremidad creada por el ensamblaje experimental o recombinación de células mesodérmicas de la yema de la extremidad dentro de una cubierta ectodérmica6. La morfogénesis de la RL depende de las características de las células mesodérmicas (u otros tipos) que responderán a las señales de patrones ectodérmicos. Una de las ventajas de este sistema experimental es su versatilidad. Esta característica permite la creación de múltiples combinaciones variando la fuente de células mesodérmicas, como células de diferentes etapas de desarrollo, de diferentes posiciones a lo largo de la extremidad, o células enteras (no disociadas) o reagregadas 7,8,9,10. Otro ejemplo es la capacidad de obtener el ectodermo embrionario de especies distintas del pollo, por ejemplo, tortuga11, codorniz o ratón12.
En este sentido, la técnica RL ayuda a estudiar el desarrollo de las extremidades y las interacciones entre las células mesenquimales y ectodérmicas de las extremidades desde un punto de vista evolutivo. Esta técnica también tiene un gran potencial para analizar la capacidad de diferentes fuentes de células progenitoras para diferenciarse en una estructura similar a una extremidad aprovechando las señales proporcionadas por el ectodermo embrionario 12,13,14. A diferencia de los cultivos in vitro, el RL permite evaluar la diferenciación y el potencial morfogenético de una población celular mediante la interpretación de las señales embrionarias de una extremidad en desarrollo 9,15.
En este protocolo, se proporciona una guía paso a paso para realizar RL exitosa con células de brotes de extremidades mesodérmicas reagregadas, abriendo así la posibilidad de adaptar este protocolo con diferentes fuentes de células reagregadas o incluso diferentes fuentes de ectodermo.
Protocol
Representative Results
Discussion
En general, el protocolo RL se puede dividir en cinco pasos: (1) incubación de embriones, (2) obtención de células mesodérmicas de extremidades para llenar los ectodermos, (3) obtención de ectodermos, (4) ensamblaje de células mesodérmicas dentro de las cubiertas ectodérmicas y (5) trasplante de los ectodermos llenos en los embriones huésped. La principal limitación de la técnica RL es el protocolo largo y detallado, que tiene muchos puntos críticos que requieren paciencia para funcionar adecuadamente. Para c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Estefanía Garay-Pacheco por las imágenes de la Figura 2 y a María Valeria Chimal-Montes de Oca por las obras de arte. Este trabajo fue apoyado por la Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA)-Universidad Nacional Autónoma de México [números de subvención IN211117 e IN213314] y el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) [número de subvención 1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia] otorgado a JC-M. JC M-L recibió una beca postdoctoral del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887).
Materials
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A5268 | |
| Angled slit knife | Alcon | 2.75mm DB | |
| Blunt forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| Collagenase type IV | Gibco | 1704-019 | |
| DMEM-HG | Sigma | D5796 | |
| Egg incubator | Incumatic de Mexico | Incumatic 1000 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000069 | |
| Fine surgical forceps | Fine Science Tools | 9115-10 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma | H6648 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Micropipet | NA | NA | |
| Palladium wire | GoodFellow | 7440 05-3 | |
| Petri dish | Nest | 705001 | |
| Pippette | crmglobe | PF1016 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Tape | NA | NA | |
| Trypsin porcine | Merck | 9002 07-7 | |
| Tungsten needle | GoodFellow | E74-15096/01 |
References
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