In vitro Lægemiddelscreening mod alle livscyklusfaser af Trypanosoma cruzi ved hjælp af parasitter, der udtrykker β-galactosidase
Summary
Vi beskriver et kolorimetrisk assay med høj kapacitet, der måler β-galactosidaseaktivitet i tre livscyklusfaser af Trypanosoma cruzi, det forårsagende middel til Chagas sygdom. Dette assay kan bruges til at identificere trypanocidale forbindelser på en nem, hurtig og reproducerbar måde.
Abstract
Trypanosoma cruzi er årsag til Chagas sygdom (ChD), en endemisk sygdom af folkesundhedsmæssig betydning i Latinamerika, der også påvirker mange ikke-endemiske lande på grund af stigningen i migration. Denne sygdom rammer næsten 8 millioner mennesker, med nye tilfælde anslået til 50.000 om året. I 1960’erne og 70’erne blev der introduceret to lægemidler til ChD-behandling: nifurtimox og benznidazol (BZN). Begge er effektive hos nyfødte og i den akutte fase af sygdommen, men ikke i den kroniske fase, og deres anvendelse er forbundet med vigtige bivirkninger. Disse kendsgerninger understreger det presserende behov for at intensivere søgningen efter nye lægemidler mod T. cruzi.
T. cruzi overføres gennem hæmatofagiske insektvektorer af Familierne Reduviidae og Hemiptera. En gang i pattedyrværten multipliceres den intracellulært som den ikke-flagellerede amastigoteform og differentierer sig til trypomastigote, blodbanen ikke-replikativ infektiv form. Inde i insektvektoren omdannes trypomastigotes til epimastigotestadiet og formere sig gennem binær fission.
Dette papir beskriver et assay baseret på måling af aktiviteten af den cytoplasmatiske β-galactosidase frigivet i kulturen på grund af parasitter lysis ved anvendelse af substratet, chlorophenolrød β-D-galactopyranosid (CPRG). Til dette blev T. cruzi Dm28c-stammen transficeret med et β-galactosidase-overekspressionerende plasmid og anvendt til in vitro farmakologisk screening i epimastigote-, trypomastigote- og amastigotestadier. Dette papir beskriver også, hvordan man måler den enzymatiske aktivitet i dyrkede epimastigotes, inficerede Vero-celler med amastigotes og trypomastigotes frigivet fra de dyrkede celler ved hjælp af referencelægemidlet benznidazol, som et eksempel. Dette kolorimetriske assay udføres let og kan skaleres til et format med høj kapacitet og påføres andre T. cruzi-stammer .
Introduction
Chagas sygdom (ChD), eller amerikansk trypanosomiasis, er en parasitisk sygdom forårsaget af den flagellerede protozo, Trypanosoma cruzi (T. cruzi). ChD begynder med en asymptomatisk eller oligosymptomatisk akut fase, der normalt er udiagnosticeret, efterfulgt af en livslang kronisk fase. I kronisk tilstand manifesterer ~ 30% af patienterne årtier efter infektionen – en række svækkende tilstande, herunder myokardopati, mega-fordøjelsessyndromer eller begge dele, med en dødelighed på mellem 0,2% og 20% 1,2,3. Asymptomatiske kroniske patienter har muligvis ingen kliniske tegn, men forbliver seropositive gennem hele deres liv.
Skøn tyder på, at ~ 7 millioner mennesker er smittet over hele verden, hovedsagelig fra Latinamerika, hvor ChD er endemisk. I disse lande overføres T. cruzi hovedsageligt gennem inficerede blodsugende triatominbugs (vektorbåren transmission) og sjældnere ved oral transmission gennem indtagelse af mad forurenet med triatominafføring indeholdende parasitterne2. Derudover kan parasitten overføres via moderkagen fra chagasiske mødre til nyfødte, gennem blodtransfusioner eller under organtransplantation. Disse vektoruafhængige måder at erhverve infektionen og menneskelig migration har bidraget til den verdensomspændende spredning af sygdommen, hvilket fremgår af et stigende antal tilfælde i Nordamerika, Europa og nogle afrikanske, østlige Middelhavs- og vestlige Stillehavslande4. ChD betragtes som en forsømt sygdom, da vektorbåren transmission er tæt forbundet med fattigdom og er et førende folkesundhedsproblem, især i latinamerikanske lavindkomstlande. Selvom der er tilgængelige behandlinger, er dødeligheden på grund af ChD i Latinamerika den højeste blandt parasitære sygdomme, herunder malaria2.
Der er to registrerede lægemidler til ChD-behandling introduceret i slutningen af 1960’erne og begyndelsen af 1970’erne: nifurtimox og benznidazol5. Begge lægemidler er effektive i den akutte fase af sygdommen hos voksne, børn og medfødt inficerede nyfødte såvel som hos børn med kronisk infektion, hvor helbredelse normalt opnås. Men kun få mennesker diagnosticeres tidligt nok til at blive behandlet i tide. Ifølge de seneste kliniske forsøg har begge lægemidler vigtige begrænsninger hos voksne og var ineffektive til at reducere symptomer hos mennesker med kronisk sygdom; derfor er deres anvendelse i denne fase kontroversiel. Andre ulemper er de forlængede behandlingsperioder, der kræves (60-90 dage) og de hyppige, alvorlige bivirkninger, der observeres, hvilket fører til seponering af behandlingen hos en andel af inficerede mennesker 6,7. Det anslås, at færre end 10% af befolkningen med ChD er blevet diagnosticeret, og endnu færre har adgang til behandling, da mange berørte personer bor i landdistrikter med ingen eller knap adgang til sundhedspleje8. Disse fakta understreger det presserende behov for at finde nye lægemidler mod T. cruzi for at muliggøre mere effektive, sikre og anvendelige behandlinger, især for den kroniske fase. I denne henseende er en anden udfordring i udviklingen af mere effektive forbindelser begrænsningen af systemer til vurdering af lægemiddeleffektivitet in vitro og in vivo9.
Selvom kemisk biologi og genomiske tilgange til identifikation af potentielle lægemiddelmål er blevet anvendt i kinetoplastidparasitter, er de tilgængelige genomiske værktøjer i T. cruzi begrænsede i modsætning til T. brucei eller Leishmania. Screening af forbindelser med trypanocidal aktivitet er således stadig den mest anvendte tilgang i søgen efter nye kemoterapeutiske lægemiddelkandidater mod ChD. Normalt skal lægemiddelopdagelse i T. cruzi starte med at teste virkningerne af et nyt lægemiddel i et in vitro-assay mod epimastigotestadiet. I årtier var den eneste måde at måle de hæmmende virkninger af kandidatforbindelser på T. cruzi manuel mikroskopisk tælling, hvilket er besværligt, tidskrævende og operatørafhængigt. Desuden er denne fremgangsmåde velegnet til analyse af et lille antal forbindelser, men er uacceptabel til screening med høj kapacitet af store sammensatte biblioteker. I dag begynder mange undersøgelser med analysen af et stort antal forbindelser fra forskellige oprindelser, der analyseres in vitro, og tester deres evne til at hæmme parasitvækst. Både kolorimetriske og fluorometriske metoder er udviklet til at øge gennemstrømningen i disse assays, forbedre objektiviteten af screeningen og gøre hele processen mindre kedelig9.
En af de mest anvendte kolorimetriske metoder er baseret på β-galactosidaseaktiviteten af transinficerede parasitter, der først blev beskrevet af Bucknet og samarbejdspartnere10. Det β-galactosidaseenzym udtrykt af de rekombinante parasitter hydrolyserer det kromoogene substrat, chlorophenolrødt β-D-galactopyranosid (CPRG), til chlorophenolrødt, som let kan måles kolorimetrisk ved hjælp af et mikropladespektrofotometer. Således kan parasitvækst i nærværelse af en række forbindelser samtidig evalueres og kvantificeres i mikrotiterplader. Denne metode er blevet anvendt til at teste lægemidler i epimastigoteformer (til stede i insektvektoren), trypomastigotes og intracellulære amastigotes, parasitens pattedyrstadier. Endvidere er flere rekombinante T. cruzi-stammer transficeret med pBS: CL-Neo-01 / BC-X-10 plasmid (pLacZ)10 til at udtrykke Escherichia coli β-galactosidase enzymet allerede tilgængelige (og nye kan konstrueres), hvilket gør det muligt at evaluere parasitter fra forskellige diskrete typningsenheder (DTU’er), der muligvis ikke opfører sig ens over for de samme forbindelser 10,11,12,13 . Denne metode er allerede blevet anvendt med succes til at evaluere forbindelser for aktivitet mod T. cruzi i screening med lav og høj kapacitet12,13. Lignende tilgange er også blevet anvendt i andre protozoiske parasitter, herunder Toxoplasma gondii og Leishmania mexicana14,15.
Dette papir beskriver og viser en detaljeret metode til en in vitro-lægemiddelscreening mod alle livscyklusstadier af T. cruzi ved hjælp af parasitter, der udtrykker β-galactosidase. De analyser, der præsenteres her, er udført med en β-galactosidase-ekspressiv T. cruzi-linje opnået ved transfektion af T. cruzi Dm28c stamme fra DTU I13 med pLacZ plasmid (Dm28c / pLacZ). Derudover kunne den samme protokol let tilpasses andre stammer for at sammenligne ydeevnen mellem forbindelser og mellem T. cruzi-stammer eller DTU’er.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette papir beskriver et assay baseret på bestemmelse af den cytoplasmatiske β-galactosidaseaktivitet frigivet på grund af membranlyse af T. cruzi epimastigotes, trypomastigotes eller inficerede celler med amastigotes i nærværelse af substratet CPRG. Vi brugte T. cruzi Dm28c /pLacZ parasitter, en stabil parasitstamme opnået efter transfektion med et β-galactosidase-bærende plasmid konstrueret af Buckner og medforfattere10. Dette assay er blevet brugt til at søge efter an…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Buckner for venligt at levere pLacZ plasmid. Dette arbejde blev støttet af Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica, Ministerio de Ciencia e Innovación Productiva fra Argentina (PICT2016-0439, PICT2019-0526, PICT2019-4212) og Research Council United Kingdom [MR/P027989/1]. Servier Medical Art blev brugt til at producere figur 1 (https://smart.servier.com).
Materials
| 1 L beaker | Schott Duran | 10005227 | |
| 10 mL serological pipette sterile | Jet Biofil | GSP211010 | |
| 5 mL serological pipette sterile | Jet Biofil | GSP010005 | |
| 96-well plates | Corning | 3599 | |
| Benznidazole | Sigma Aldrich | 419656 | N-Benzyl-2-nitro-1H-imidazole-1-acetamide |
| Biosafty Cabinet | Telstar | Bio II A/P | |
| Centrifuge tube 15 mL conical bottom sterile | Tarson | 546021 | |
| Centrifuge tube 50 mL conical bottom sterile | Tarson | 546041 | |
| CO2 Incubator | Sanyo | MCO-15A | |
| CPRG | Roche | 10 884308001 | Chlorophenol Red-β-D-galactopyranoside |
| DMEM, High Glucose | Thermo Fisher Cientific | 12100046 | Powder |
| DMSO | Sintorgan | SIN-061 | Dimethylsulfoxid |
| Fetal Calf Serum | Internegocios SA | FCS FRA 500 | Sterile and heat-inactivated |
| G418 disulphate salt solution | Roche | G418-RO | stock concentration: 50 mg/mL |
| Glucose D(+) | Cicarelli | 716214 | |
| Graduated cylinder | Nalgene | 3663-1000 | |
| Hemin | Frontier Scientific | H651-9 | |
| KCl | Cicarelli | 867212 | |
| Liver Infusion | Difco | 226920 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Tarson | 500010-N | |
| Microplate Spectrophotometer | Biotek | Synergy HTX | |
| Na2HPO4 | Cicarelli | 834214 | |
| NaCl | Cicarelli | 750214 | |
| Neubauer chamber | Boeco | BOE 01 | |
| Nonidet P-40 | Antrace | NIDP40 | 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol |
| Prism | Graphpad | Statistical Analysis software | |
| Sodium Bicarbonate | Cicarelli | 929211 | NaHCO3 |
| Sorvall ST 16 Centrifuge | Thermo Fisher Cientific | 75004380 | |
| T-25 flasks | Corning | 430639 | |
| Tryptose | Merck | 1106760500 | |
| Vero cells | ATCC | CRL-1587 |
References
- Rassi, A., Rassi, A., Rassi, S. G. Predictors of mortality in chronic Chagas disease: a systematic review of observational studies. Circulation. 115 (9), 1101-1108 (2007).
- Pérez-Molina, J. A., Molina, I. Chagas disease. The Lancet. 391 (10115), 82-94 (2018).
- Messenger, L. A., Miles, M. A., Bern, C. Between a bug and a hard place: Trypanosoma cruzi genetic diversity and the clinical outcomes of Chagas disease. Expert Review of Anti-infective Therapy. 13 (8), 995-1029 (2015).
- Steverding, D. The history of Chagas disease. Parasites & Vectors. 7, 317 (2014).
- Viotti, R., et al. Towards a paradigm shift in the treatment of chronic Chagas disease. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (2), 635-639 (2014).
- Bern, C. Chagas’ Disease. The New England Journal of Medicine. 373 (19), 1882 (2015).
- Bustamante, J. M., Tarleton, R. L. Methodological advances in drug discovery for Chagas disease. Expert Opinion on Drug Discovery. 6 (6), 653-661 (2011).
- Buckner, F. S., Verlinde, C. L., La Flamme, A. C., Van Voorhis, W. C. Efficient technique for screening drugs for activity against Trypanosoma cruzi using parasites expressing beta-galactosidase. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 40 (11), 2592-2597 (1996).
- Vega, C., Rolón, M., Martínez-Fernández, A. R., Escario, J. A., Gómez-Barrio, A. A new pharmacological screening assay with Trypanosoma cruzi epimastigotes expressing beta-galactosidase. Parasitology Research. 95 (4), 296-298 (2005).
- Bettiol, E., et al. Identification of three classes of heteroaromatic compounds with activity against intracellular Trypanosoma cruzi by chemical library screening. PLoS Neglected Tropical Diseases. 3 (2), 384 (2009).
- Gulin, J. E. N., et al. Optimization and biological validation of an in vitro assay using the transfected Dm28c/pLacZ Trypanosoma cruzi strain. Biology Methods and Protocols. 6 (1), 004 (2021).
- da Silva Santos, A. C., Moura, D. M. N., Dos Santos, T. A. R., de Melo Neto, O. P., Pereira, V. R. A. Assessment of Leishmania cell lines expressing high levels of beta-galactosidase as alternative tools for the evaluation of anti-leishmanial drug activity. Journal of Microbiological Methods. 166, 105732 (2019).
- McFadden, D. C., Seeber, F., Boothroyd, J. C. Use of Toxoplasma gondii expressing beta-galactosidase for colorimetric assessment of drug activity in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (9), 1849-1853 (1997).
- Moreno-Viguri, E., et al. In vitro and in vivo anti-Trypanosoma cruzi activity of new arylamine Mannich base-type derivatives. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (24), 10929-10945 (2016).
- García, P., Alonso, V. L., Serra, E., Escalante, A. M., Furlan, R. L. E. Discovery of a biologically active bromodomain inhibitor by target-directed dynamic combinatorial chemistry. ACS Medicinal Chemistry Letters. 9 (10), 1002-1006 (2018).
- Vela, A., et al. In vitro susceptibility of Trypanosoma cruzi discrete typing units (DTUs) to benznidazole: A systematic review and meta-analysis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 15 (3), 0009269 (2021).
- Alonso-Padilla, J., Rodríguez, A. High throughput screening for anti-Trypanosoma cruzi drug discovery. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (12), 3259 (2014).
- Martinez-Peinado, N., et al. Amaryllidaceae alkaloids with anti-Trypanosoma cruzi activity. Parasites & Vectors. 13 (1), 299 (2020).
- Puente, V., Demaria, A., Frank, F. M., Batlle, A., Lombardo, M. E. Anti-parasitic effect of vitamin C alone and in combination with benznidazole against Trypanosoma cruzi. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (9), 0006764 (2018).
- Muelas-Serrano, S., Nogal-Ruiz, J. J., Gómez-Barrio, A. Setting of a colorimetric method to determine the viability of Trypanosoma cruzi epimastigotes. Parasitology Research. 86 (12), 999-1002 (2000).
