In vitro Triagem de drogas contra todas as etapas do ciclo de vida de Trypanosoma cruzi usando parasitas expressando β-galactosidase
Summary
Descrevemos um ensaio colorimétrico de alta produtividade medindo β-galactosidase atividade em três estágios do ciclo de vida de Trypanosoma cruzi, o agente causador da doença de Chagas. Este ensaio pode ser usado para identificar compostos trypanocidas de forma fácil, rápida e reprodutível.
Abstract
Trypanosoma cruzi é o agente causador da doença de Chagas (ACS), uma doença endêmica de importância da saúde pública na América Latina que também afeta muitos países não endêmicas devido ao aumento da migração. Essa doença afeta cerca de 8 milhões de pessoas, com novos casos estimados em 50.000 por ano. Nas décadas de 1960 e 1970, foram introduzidos dois medicamentos para tratamento de ChD: nifurtimox e benznidazol (BZN). Ambos são eficazes em recém-nascidos e durante a fase aguda da doença, mas não na fase crônica, e seu uso está associado a efeitos colaterais importantes. Esses fatos ressaltam a necessidade urgente de intensificar a busca por novas drogas contra T. cruzi.
T. cruzi é transmitido através de vetores de insetos hematófagos das famílias Reduviidae e Hemiptera. Uma vez no hospedeiro mamífero, multiplica-se intracelularmente como a forma amastigote não sinalizada e se diferencia no trippomastigote, a corrente sanguínea não-replicativa forma infecciosa. Dentro do vetor de insetos, os tripuladores se transformam no estágio de epimastigote e se multiplicam através da fissão binária.
Este artigo descreve um ensaio baseado na medição da atividade do β-galactosidase citoplasmático lançado na cultura devido à lise de parasitas usando o substrato, clorofenol vermelho β-D-galactopyranoside (CPRG). Para isso, a cepa T. cruzi Dm28c foi transfeinada com um plasmídeo de β-galactosidase-sobreexpresso e usado para triagem farmacológica in vitro em estágios de epimastigote, tripomastigote e amastigote. Este artigo também descreve como medir a atividade enzimática em epimastigotes cultivados, células Vero infectadas com amastigotes, e tripulações liberadas das células cultivadas usando a droga de referência, benznidazol, como exemplo. Este ensaio colorimétrico é facilmente executado e pode ser dimensionado para um formato de alto rendimento e aplicado a outras cepas T. cruzi .
Introduction
A doença de Chagas (CHD), ou trippanosomiase americana, é uma doença parasitária causada pelo protozoário flagelado, Trypanosoma cruzi (T. cruzi). A CD começa com uma fase aguda assintomática ou oligossintomática que geralmente não é diagnosticada, seguida de uma fase crônica ao longo da vida. Na cronidade, ~30% dos pacientes se manifestam décadas após a infecção – uma variedade de condições debilitantes, incluindo miocardiopatia, síndromes mega-digestivas, ou ambos, com uma taxa de mortalidade variando de 0,2% a 20%1,2,3. Pacientes crônicos assintomáticos podem não ter sinais clínicos, mas permanecem soropositivos ao longo de sua vida.
Estimativas sugerem que ~7 milhões de pessoas estão infectadas em todo o mundo, principalmente da América Latina, onde o ChD é endêmico. Nesses países, t. cruzi é transmitido principalmente através de insetos de triatomina sugadores de sangue infectados (transmissão transmitida por vetores) e menos frequentemente pela transmissão oral através da ingestão de alimentos contaminados com fezes de triatomina contendo os parasitas2. Além disso, o parasita pode ser transmitido através da placenta de mães chagásicas para recém-nascidos, através de transfusões de sangue, ou durante o transplante de órgãos. Essas formas independentes de adquirir a infecção e a migração humana contribuíram para a disseminação mundial da doença, evidenciada por um número crescente de casos na América do Norte, Europa e alguns países africanos, do Mediterrâneo Oriental e do Pacífico Ocidental4. A ACS é considerada uma doença negligenciada, pois a transmissão transmitida por vetores está intimamente associada à pobreza e é um dos principais problemas de saúde pública, especialmente nos países latino-americanos de baixa renda. Embora existam tratamentos disponíveis, a mortalidade por AC Na América Latina é a mais alta entre as doenças parasitárias, incluindo a malária2.
Existem dois medicamentos registrados para o tratamento de ChD introduzidos no final da década de 1960 e início da década de 1970: nifurtimox e benznidazol5. Ambas as drogas são eficazes na fase aguda da doença em adultos, crianças e recém-nascidos infectados congênitas, bem como em crianças com infecção crônica, onde a cura é geralmente alcançada. No entanto, apenas algumas pessoas são diagnosticadas precocemente o suficiente para serem tratadas a tempo. De acordo com os últimos ensaios clínicos, ambos os fármacos têm limitações importantes em adultos e foram ineficazes na redução de sintomas em pessoas com doença crônica; portanto, seu uso nesta fase é controverso. Outras desvantagens são os períodos prolongados de tratamento exigidos (60-90 dias) e os efeitos adversos frequentes e graves observados, que levam à interrupção da terapia em proporção de pessoas infectadas 6,7. Estima-se que menos de 10% das pessoas com ACS foram diagnosticadas, e ainda menos têm acesso ao tratamento, já que muitos indivíduos afetados vivem em áreas rurais sem acesso ou pouco acesso à saúde8. Esses fatos destacam a necessidade urgente de encontrar novas drogas contra t. cruzi para permitir tratamentos mais eficientes, seguros e aplicáveis ao campo, especialmente para a fase crônica. Nesse sentido, outro desafio no desenvolvimento de compostos mais eficazes é a limitação de sistemas para avaliação da eficácia da droga in vitro e in vivo9.
Embora a biologia química e abordagens genômicas para a identificação de potenciais alvos de drogas tenham sido usadas em parasitas cinetoplastídeos, as ferramentas genômicas disponíveis em T. cruzi são limitadas em contraste com T. brucei ou Leishmania. Assim, a triagem de compostos com atividade tripanocida ainda é a abordagem mais utilizada na busca de novos candidatos a drogas quimioterápicas contra ChD. Geralmente, a descoberta de drogas em T. cruzi deve começar com o teste dos efeitos de uma nova droga em um ensaio in vitro contra a fase de epimastigote. Durante décadas, a única maneira de medir os efeitos inibitórios dos compostos candidatos em T. cruzi foi a contagem microscópica manual, que é trabalhosa, demorada e dependente do operador. Além disso, essa abordagem é adequada para avaliar um pequeno número de compostos, mas é inaceitável para a triagem de alto rendimento de grandes bibliotecas compostas. Hoje em dia, muitas investigações começam com a análise de um grande número de compostos de diferentes origens que são avaliados in vitro, testando sua capacidade de inibir o crescimento de parasitas. Tanto métodos colorimétricos quanto fluorométricos foram desenvolvidos para aumentar o rendimento nesses ensaios, melhorando a objetividade da triagem e tornando todo o processo menos tedioso9.
Um dos métodos colorimétricos mais utilizados é baseado na atividade β-galactosidase de parasitas transfeinados descritos pela primeira vez por Bucknet e colaboradores10. A enzima β-galactosidase expressa pelos parasitas recombinantes hidrolisa o substrato cromogênico, clorofenol vermelho β-D-galactopyranoside (CPRG), para o vermelho clorofenol, que pode ser facilmente medido colorimetricamente usando um espectógrafo microplato. Assim, o crescimento de parasitas na presença de uma variedade de compostos pode ser avaliado simultaneamente e quantitado em placas de microtátrica. Este método tem sido aplicado para testar drogas em formas de epimastigote (presentes no vetor de insetos), tripulações e amastigotes intracelulares, os estágios mamíferos do parasita. Além disso, vários T recombinante. cepas cruzi transfectadas com a enzima pBS:CL-Neo-01/BC-X-10 plasmid (pLacZ)10 para expressar a enzima Escherichia coli β-galactosidase já estão disponíveis (e novos podem ser construídos), o que permite a avaliação de parasitas de diferentes unidades de digitação discretas (DTUs) que podem não se comportar igualmente em direção aos mesmos compostos 10,11,12,13 . Este método já foi utilizado com sucesso para avaliar compostos para atividade contra T. cruzi na triagem de baixo e alto rendimento12,13. Abordagens semelhantes também têm sido usadas em outros parasitas protozoários, incluindo Toxoplasma gondii e Leishmania mexicana14,15.
Este artigo descreve e mostra um método detalhado para uma triagem in vitro de drogas contra todas as etapas do ciclo de vida de T. cruzi usando parasitas expressando β-galactosidase. Os ensaios aqui apresentados foram realizados com uma linha T. cruzi expressa β-galactosidase obtida pela transfecção da cepa T. cruzi Dm28c da DTU I13 com plasmid pLacZ (Dm28c/pLacZ). Além disso, o mesmo protocolo poderia ser facilmente adaptado a outras cepas para comparar o desempenho entre compostos e entre cepas de T. cruzi ou DTUs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este artigo descreve um ensaio baseado na determinação da atividade citoplasmática β-galactosidase liberada devido à lise de membrana de epimastigotes T. cruzi, trippomastigotes ou células infectadas com amastigotes na presença do substrato CPRG. Utilizamos parasitas T. cruzi Dm28c/pLacZ, uma cepa de parasita estável obtida após a transfecção com um plasmídeo de β-galactosidase construído por Buckner e coautores10. Este ensaio tem sido usado para procurar compostos …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Dr. Buckner por gentilmente fornecer o plasmídeo pLacZ. Este trabalho contou com o apoio da Agência Nacional de Promoción Científica y Tecnológica, Ministerio de Ciencia e Innovación Productiva da Argentina (PICT2016-0439, PICT2019-0526, PICT2019-4212) e Conselho de Pesquisa Reino Unido [MR/P027989/1]. Servier Medical Art foi usado para produzir figura 1 (https://smart.servier.com).
Materials
| 1 L beaker | Schott Duran | 10005227 | |
| 10 mL serological pipette sterile | Jet Biofil | GSP211010 | |
| 5 mL serological pipette sterile | Jet Biofil | GSP010005 | |
| 96-well plates | Corning | 3599 | |
| Benznidazole | Sigma Aldrich | 419656 | N-Benzyl-2-nitro-1H-imidazole-1-acetamide |
| Biosafty Cabinet | Telstar | Bio II A/P | |
| Centrifuge tube 15 mL conical bottom sterile | Tarson | 546021 | |
| Centrifuge tube 50 mL conical bottom sterile | Tarson | 546041 | |
| CO2 Incubator | Sanyo | MCO-15A | |
| CPRG | Roche | 10 884308001 | Chlorophenol Red-β-D-galactopyranoside |
| DMEM, High Glucose | Thermo Fisher Cientific | 12100046 | Powder |
| DMSO | Sintorgan | SIN-061 | Dimethylsulfoxid |
| Fetal Calf Serum | Internegocios SA | FCS FRA 500 | Sterile and heat-inactivated |
| G418 disulphate salt solution | Roche | G418-RO | stock concentration: 50 mg/mL |
| Glucose D(+) | Cicarelli | 716214 | |
| Graduated cylinder | Nalgene | 3663-1000 | |
| Hemin | Frontier Scientific | H651-9 | |
| KCl | Cicarelli | 867212 | |
| Liver Infusion | Difco | 226920 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Tarson | 500010-N | |
| Microplate Spectrophotometer | Biotek | Synergy HTX | |
| Na2HPO4 | Cicarelli | 834214 | |
| NaCl | Cicarelli | 750214 | |
| Neubauer chamber | Boeco | BOE 01 | |
| Nonidet P-40 | Antrace | NIDP40 | 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol |
| Prism | Graphpad | Statistical Analysis software | |
| Sodium Bicarbonate | Cicarelli | 929211 | NaHCO3 |
| Sorvall ST 16 Centrifuge | Thermo Fisher Cientific | 75004380 | |
| T-25 flasks | Corning | 430639 | |
| Tryptose | Merck | 1106760500 | |
| Vero cells | ATCC | CRL-1587 |
References
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