Erzeugung von Nullmutanten zur Aufklärung der Rolle bakterieller Glykosyltransferasen in der bakteriellen Motilität
Summary
Hier beschreiben wir die Konstruktion von Nullmutanten von Aeromonas in spezifischen Glykosyltransferasen oder Regionen, die Glykosyltransferasen enthalten, die Motilitätsassays und die Flagellenreinigung, die durchgeführt wurden, um die Beteiligung und Funktion ihrer kodierten Enzyme bei der Biosynthese eines Glykans zu bestimmen, sowie die Rolle dieses Glykans in der bakteriellen Pathogenese.
Abstract
Die Untersuchung der Glykosylierung in Prokaryoten ist ein schnell wachsendes Gebiet. Bakterien beherbergen auf ihrer Oberfläche unterschiedliche glykosylierte Strukturen, deren Glykane einen stammspezifischen Barcode bilden. Die assoziierten Glykane zeigen eine höhere Vielfalt in der Zuckerzusammensetzung und -struktur als die von Eukaryoten und sind wichtig für bakterielle Wirtserkennungsprozesse und die Interaktion mit der Umwelt. In pathogenen Bakterien waren Glykoproteine an verschiedenen Stadien des Infektionsprozesses beteiligt, und Glykanmodifikationen können bestimmte Funktionen von Glykoproteinen beeinträchtigen. Trotz der Fortschritte beim Verständnis der Zusammensetzung, Struktur und Biosynthesewege von Glykanen bleibt das Verständnis der Rolle von Glykoproteinen bei der Pathogenität oder der Wechselwirkung mit der Umwelt sehr begrenzt. Darüber hinaus werden bei einigen Bakterien die für die Proteinglykosylierung erforderlichen Enzyme mit anderen Polysaccharid-Biosynthesewegen, wie Lipopolysaccharid- und Kapsel-Biosynthesewegen, geteilt. Die funktionelle Bedeutung der Glykosylierung wurde in mehreren Bakterien durch Mutation spezifischer Gene aufgeklärt, von denen angenommen wird, dass sie am Glykosylierungsprozess beteiligt sind, und durch die Untersuchung seiner Auswirkungen auf die Expression des Zielglykoproteins und des modifizierenden Glykans. Mesophile Aeromonas haben ein einzelnes und O-glykosyliertes polares Flagellum. Flagellar-Glykane zeigen eine Vielfalt in der Kohlenhydratzusammensetzung und Kettenlänge zwischen Aeromonas-Stämmen. Alle bisher analysierten Stämme zeigen jedoch ein Pseudaminsäurederivat als verbindenden Zucker, der Serin- oder Threoninreste modifiziert. Das Pseudaminsäurederivat wird für die Anordnung polarer Flagellen benötigt, und sein Verlust hat Auswirkungen auf die Adhäsion, die Bildung von Biofilmen und die Besiedlung. Das in diesem Artikel beschriebene Protokoll beschreibt, wie die Konstruktion von Nullmutanten verwendet werden kann, um die Beteiligung von Genen oder Genomregionen, die mutmaßliche Glykosyltransferasen enthalten, an der Biosynthese eines Flagellenglykans zu verstehen. Dazu gehört auch das Potenzial, die Funktion der beteiligten Glykosyltransferasen und die Rolle des Glykans zu verstehen. Dies wird erreicht, indem die Glykanmangel-Mutante mit der Wildtyp-Sorte verglichen wird.
Introduction
Die Proteinglykosylierung wurde sowohl bei Gram-positiven als auch bei Gram-negativen Bakterien beschrieben und besteht aus der kovalenten Bindung eines Glykans an eine Aminosäure-Seitenkette 1,2. In Prokaryoten geschieht dieser Prozess normalerweise über zwei wichtige enzymatische Mechanismen: O- und N-Glykosylierung 3. Bei der O-Glykosylierung wird das Glykan an die Hydroxylgruppe eines Serin (Ser) oder Threonin (Thr) Rückstands gebunden. Bei der N-Glykosylierung ist das Glykan an den Seitenkettenamidstickstoff eines Asparagins (Asn)-Rests innerhalb der Tripeptidsequenzen Asn-X-Ser/Thr gebunden, wobei X eine beliebige Aminosäure außer Prolin sein könnte.
Glykane können lineare oder verzweigte Strukturen annehmen und bestehen aus Monosacchariden oder Polysacchariden, die kovalent durch glykosidische Bindungen verbunden sind. In Prokaryoten zeigen Glykane im Vergleich zu eukaryotischen Glykanen in der Regel eine Vielfalt in der Zuckerzusammensetzung und -struktur4. Darüber hinaus wurden zwei verschiedene bakterielle Glykosylierungswege beschrieben, die sich darin unterscheiden, wie das Glykan zusammengesetzt und auf das Akzeptorprotein übertragen wird: sequentielle und en-bloc-Glykosylierung 5,6. Für die sequentielle Glykosylierung wird das komplexe Glykan durch sukzessive Zugabe von Monosacchariden direkt auf dem Protein aufgebaut. Bei der en-bloc-Glykosylierung wird ein vormontiertes Glykan von einem lipidgebundenen Oligosaccharid durch eine spezialisierte Oligosaccharyltransferase (OTase) auf das Protein übertragen. Es wurde gezeigt, dass beide Signalwege an N- und O-Glykosylierungsprozessen beteiligt sind7.
Die Proteinglykosylierung spielt eine Rolle bei der Modulation der physikalisch-chemischen und biologischen Eigenschaften von Proteinen. Das Vorhandensein eines Glykans kann beeinflussen, wie das Protein mit seinem Liganden interagiert, was sich auf die biologische Aktivität des Proteins auswirkt, aber auch die Proteinstabilität, Löslichkeit, Anfälligkeit für Proteolyse, Immunogenität und Mikroben-Wirt-Interaktionenbeeinflussen kann 8,9. Mehrere Glykosylierungsparameter, wie die Anzahl der Glykane, die Zusammensetzung des Glykans, die Position und der Bindungsmechanismus, könnten jedoch auch die Proteinfunktion und -struktur beeinflussen.
Glykosyltransferasen (GTs) sind die Schlüsselenzyme bei der Biosynthese komplexer Glykane und Glykokonjugate. Diese Enzyme katalysieren die glykosidische Bindungsbildung zwischen einem Zuckeranteil aus einem aktivierten Donormolekül und einem spezifischen Substratakzeptor. GTs können sowohl Nukleotide als auch Nicht-Nukleotide als Donormoleküle verwenden und auf verschiedene Substratakzeptoren wie Proteine, Saccharide, Nukleinsäuren und Lipideabzielen 10. Daher ist das Verständnis von GTs auf molekularer Ebene wichtig, um ihre Wirkmechanismen und Spezifität zu identifizieren, und ermöglicht auch das Verständnis, wie die Zuckerzusammensetzung von Glykanen, die relevante Moleküle modifizieren, mit der Pathogenität zusammenhängt. Die Carbohydrate Active Enzymdatenbank (CAZy)11 klassifiziert GTs nach ihrer Sequenzhomologie, was ein prädiktives Werkzeug darstellt, da in den meisten GT-Familien die strukturelle Falte und die Wirkmechanismen invariant sind. Vier Gründe machen es jedoch schwierig, die Substratspezifität vieler GTs vorherzusagen: 1) In Prokaryoten wurde kein klares Sequenzmotiv bestimmt, das die Substratspezifität bestimmt 12, 2) viele GTs und OTasen zeigen Substratpromiskuität13,14, 3) funktionelle GTs sind in rekombinanter Form schwer in hoher Ausbeute herzustellen und 4) die Identifizierung von Donor- und Akzeptorsubstraten ist komplex. Trotzdem haben neuere Mutagenesestudien es ermöglicht, signifikante Fortschritte im Verständnis katalytischer Mechanismen zu erzielen und die Bindung von GTs zu subtrahieren.
Bei Bakterien scheint die O-Glykosylierung häufiger anzutreffen als die N-Glykosylierung. Die O-Glykosylierungsstellen zeigen keine Konsenssequenz, und viele der O-glykosylierten Proteine sind sezernierte oder zelloberflächennahe Proteine, wie Flagelline, Pili oder Autotransporter1. Die Flagellinglykosylierung zeigt eine Variabilität in der Anzahl der Akzeptorstellen, der Glykanzusammensetzung und der Struktur. Zum Beispiel haben Burkholderia spp Flagelline nur eine Akzeptorstelle, während in Campylobacter jejuni Flagelline bis zu 19 Akzeptorstellen15,16 haben. Darüber hinaus ist das Glykan für einige Bakterien ein einzelnes Monosaccharid, während andere Bakterien heterogene Glykane besitzen, die von verschiedenen Monosacchariden kompromittiert sind, um Oligosaccharide zu bilden. Diese Heterogenität tritt sogar bei Stämmen derselben Art auf. Helicobacter-Flagelline werden nur durch Psedaminsäure (PseAc)17 modifiziert, und Campylobacter-Flagellanine können durch PseAc, die Acetamidino-Form der Psedaminsäure (PseAm) oder Legionaminsäure (LegAm) und Glykane, die von diesen Zuckern abgeleitet sind, mit Acetyl, N-Acetylglucosamin oder Propionsubstitutionen18,19 modifiziert werden. In Aeromonas werden Flagelline durch Glykane modifiziert, deren Zusammensetzung von einem einzelnen PseAc-Säurederivat bis zu einem Heteropolysaccharid20 reicht, und die Bindung von Glykanen an die Flagellinmonomere erfolgt immer über ein PseAc-Derivat.
Im Allgemeinen ist die Glykosylierung von Flagellinen für die Flagella-Filament-Assemblierung, Motilität, Virulenz und Wirtsspezifität unerlässlich. Während jedoch Flagellins von C. jejuni16, H. pylori17 und Aeromonas sp. 21 kann sich nicht zu Filament zusammensetzen, es sei denn, die Proteinmonomere sind glykosyliert, Pseudomonas spp. und Burkholderia spp. 15 erfordern keine Glykosylierung für die Flagellenmontage. Darüber hinaus beeinflussen bei einigen C. jejuni-Stämmen Veränderungen in der Zuckerzusammensetzung des Flagellenglykans die Bakterien-Wirt-Interaktion und können eine Rolle bei der Umgehung bestimmter Immunantwortenspielen 16. Autoagglutination ist ein weiteres phänotypisches Merkmal, das durch Modifikationen in der Zusammensetzung von Glykanen, die mit Flagellinen assoziiert sind, beeinflusst wird. Eine geringere Autoagglutination führt zu einer Verringerung der Fähigkeit, Mikrokolonien und Biofilm22 zu bilden. Bei einigen Bakterien war die Fähigkeit von Flagellen, eine entzündungsfördernde Reaktion auszulösen, mit der Flagellin-Glykosylierung verbunden. So induziert in P. aeruginosa glykosyliertes Flagellin eine höhere entzündungsfördernde Reaktion als unglykosyliertes23.
Aeromonas sind gramnegative Bakterien, die in der Umwelt allgegenwärtig sind, wodurch sie sich an der Schnittstelle aller One Health-Komponenten befinden können 24. Mesophile Aeromonas haben ein einzelnes polares Flagellum, das konstitutiv produziert wird. Mehr als die Hälfte der klinischen Isolate exprimieren auch laterales Flakellin, induzierbar in hochviskosen Medien oder Platten. Verschiedene Studien haben beide Flagellentypen mit den frühen Stadien der bakteriellen Pathogenese in Verbindung gebracht25. Während die bisher berichteten polaren Flagelline bei 5-8 Ser- oder Thr-Resten ihrer zentralen immunogenen Domänen O-glykosyliert sind, sind laterale Flagellaline nicht in allen Stämmen O-glykosyliert. Obwohl polare Flagellenglykane aus verschiedenen Stämmen eine Vielfalt in ihrer Kohlenhydratzusammensetzung und Kettenlänge20 aufweisen, hat sich gezeigt, dass der verbindende Zucker ein Pseudaminsäurederivat ist.
Das Ziel dieses Manuskripts ist es, eine Methode zur Gewinnung von Nullmutanten in spezifischen GTs oder chromosomalen Regionen, die GTs enthalten, zu beschreiben, um ihre Beteiligung an der Biosynthese relevanter Polysaccharide und an der bakteriellen Pathogenität sowie die Rolle des Glykans selbst zu analysieren. Als Beispiel identifizieren und löschen wir eine chromosomale Region, die GTs von Aeromonas enthält, um ihre Beteiligung an der polaren Flagellin-Glykosylierung festzustellen und die Rolle des Flagellin-Glykans zu analysieren. Wir zeigen, wie man ein spezifisches GT löscht, um seine Funktion bei der Biosynthese dieses Glykans und die Rolle des modifizierten Glykans zu bestimmen. Obwohl Aeromonas als Beispiel verwendet wird, kann das Prinzip verwendet werden, um Flagellenglykosylierungsinseln anderer gramnegativer Bakterien zu identifizieren und zu untersuchen und die Funktion von GTs zu analysieren, die an der Biosynthese anderer Glykane wie dem O-Antigen-Lipopolysaccharid beteiligt sind.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der entscheidende frühe Schritt dieser Methode ist die Identifizierung von Regionen, die an der Glykosylierung von Flagellen und mutmaßlichen GTs beteiligt sind, da diese Enzyme eine hohe Homologie aufweisen und an vielen Prozessen beteiligt sind. Die bioinformatische Analyse von Aeromonas-Genomen in öffentlichen Datenbanken zeigt, dass diese Region an die polare Flagellenregion 2 angrenzt, die die Flagellin-Gene in vielen Stämmen enthält und Gene enthält, die an der Biosynthese von Pseudaminsäure<sup cla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom National Research Council Canada für den Plan Nacional de I + D (Ministerio de Economía y Competitividad, Spanien) und für die Generalitat de Catalunya (Centre de Referència en Biotecnologia) unterstützt.
Materials
| ABI PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit | Applied Biosystems | 4337455 | Used for sequencing |
| AccuPrime Taq DNA Polymerase, high fidelity | Invitrogen | 12346-086 | Used for amplification of AB, CD and AD fragments |
| Agarose | Conda-Pronadise | 8008 | Used for DNA electrophoresis |
| Alkaline phosphatase, calf intestinal (CIAP) | Promega | M1821 | Used to remove phosphate at the 5’ end |
| Bacto agar | Becton Dickinson | 214010 | Use for motility analysis |
| BamHI | Promega | R6021 | Used for endonuclease restriction |
| BglII | Promega | R6081 | Used for endonuclease restriction |
| BioDoc-It Imagin System | UVP | Bio-imaging station used for DNA visualization | |
| Biotaq polymerase | Bioline | BIO-21040 | Used for colony screening |
| Cesium chloride | Applichem | A1126,0100 | Used for flagella purification |
| Chloramphenicol | Applichem | A1806,0025 | Used for triparental mating |
| Cytiva illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit | Cytivia | 28-9034-71 | Used for purification of PCR amplicons and DNA fragments. |
| EDTA | Applichem | 131026.1211 | Used for DNA electrophoresis |
| Electroporation cuvettes 2 mm gap | VWR | 732-1133 | Used for transformation |
| Ethidium bromide | Applichem | A1152,0025 | Use for DNA visualization |
| HyperLadder 1 Kb marker | Bioline | BIO-33053 | DNA marker |
| Invitrogen Easy-DNA gDNA Purification Kit | Invitrogen | 10750204 | Used for bacterial chromosomal DNA purification |
| Luria-Bertani (LB) Miller agar | Condalab | 996 | Used for Escherichia coli culture |
| Luria-Bertani (LB) Miller broth | Condalab | 1551 | Used for Escherichia coli culture |
| Nanodrop ND-1000 | NanoDrop Techonologies Inc | Spectrophotometer used for DNA quantification | |
| Rifampicin | Applichem | A2220,0005 | Used for triparental mating |
| SOC Medium | Invitrogen | 15544034 | Used for electroporation recovery |
| Spectinomycin | Applichem | A3834,0005 | Used for triparental mating |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman | 331362 | Used for flagella purification |
| T4 DNA ligase | Invitrogen | 15224017 | Used for ligation reaction |
| Trypticasein soy agar | Condalab | 1068 | Used for Aeromonas grown |
| Trypticasein soy broth | Condalab | 1224 | Used for Aeromonas grown |
| Tryptone | Condalab | 1612 | Use for motility analysis |
| Tris | Applichem | A2264,0500 | Used for DNA electrophoresis and flagella purification |
| Triton X-100 | Applichem | A4975,0100 | Used for bacterial lysis |
| Ultra Clear tubes (14 mm x 89 mm) | Beckman | 344059 | Used for flagella purification |
| Veriti 96 well Thermal Cycler | Applied Biosystems | Used for PCR reactions | |
| Zyppy Plasmid Miniprep II Kit | Zymmo research | D4020 | Used for isolation of plasmid DNA |
References
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