توليد الطفرات الخالية لتوضيح دور الجليكوسيل ترانسفيراز البكتيري في الحركة البكتيرية

Summary

هنا ، نصف بناء طفرات فارغة من Aeromonas في جليكوزيل ترانسفيراز محددة أو مناطق تحتوي على جليكوزيل ترانسفيراز ، ومقايسات الحركة ، وتنقية السوط التي أجريت لتحديد مشاركة ووظيفة إنزيماتها المشفرة في التخليق الحيوي للجليكان ، وكذلك دور هذا الجلايكان في التسبب البكتيري.

Abstract

دراسة الجليكوزيل في بدائيات النوى هي منطقة سريعة النمو. تؤوي البكتيريا هياكل جليكوزيلية مختلفة على سطحها تشكل جليكان رمزا شريطيا خاصا بالسلالة. تظهر الجليكان المرتبطة بها تنوعا أعلى في تكوين السكر وبنيته مقارنة بحقيقيات النوى وهي مهمة في عمليات التعرف على المضيف البكتيري والتفاعل مع البيئة. في البكتيريا المسببة للأمراض ، شاركت البروتينات السكرية في مراحل مختلفة من العملية المعدية ، ويمكن أن تتداخل تعديلات الجليكان مع وظائف محددة للبروتينات السكرية. ومع ذلك ، على الرغم من التقدم المحرز في فهم تكوين الجليكان والبنية ومسارات التخليق الحيوي ، فإن فهم دور البروتينات السكرية في الإمراض أو التفاعل مع البيئة لا يزال محدودا للغاية. علاوة على ذلك ، في بعض البكتيريا ، يتم مشاركة الإنزيمات اللازمة لغليكوزيل البروتين مع مسارات التخليق الحيوي الأخرى متعددة السكاريد ، مثل عديد السكاريد الدهني ومسارات التخليق الحيوي للكبسولة. تم توضيح الأهمية الوظيفية للغليكوزيل في العديد من البكتيريا من خلال طفرة جينات محددة يعتقد أنها تشارك في عملية الجليكوزيل ودراسة تأثيرها على التعبير عن البروتين السكري المستهدف وتعديل الجليكوسين. تحتوي Aeromonas الميزوفيليك على سوط قطبي واحد و O-glycosylated. يظهر السوط غليكان تنوعا في تكوين الكربوهيدرات وطول السلسلة بين سلالات Aeromonas . ومع ذلك ، فإن جميع السلالات التي تم تحليلها حتى الآن تظهر مشتقا من حمض pseudaminic كسكر مرتبط يعدل بقايا السيرين أو الثريونين. مشتق حمض pseudaminic مطلوب لتجميع السوط القطبي ، وفقدانه له تأثير على الالتصاق ، وتشكيل الأغشية الحيوية ، والاستعمار. يصف البروتوكول المفصل في هذه المقالة كيف يمكن استخدام بناء الطفرات الخالية لفهم تورط الجينات أو مناطق الجينوم التي تحتوي على جليكوزيل ترانسفيراز المفترضة في التخليق الحيوي للجليكان السوط. وهذا يشمل القدرة على فهم وظيفة الجليكوسيل ترانسفيراز المعنية ودور الجلايكان. وسيتم تحقيق ذلك من خلال مقارنة المتحور الناقص في الغليكان بالسلالة البرية.

Introduction

تم وصف غليكوزيل البروتين في كل من البكتيريا إيجابية الجرام وسالبة الجرام ويتكون من الارتباط التساهمي للجليكان بسلسلة جانبية من الأحماض الأمينية ^1,2. في بدائيات النوى ، تحدث هذه العملية عادة عبر آليتين إنزيميتين رئيسيتين: O- و N-glycosylation ³. في O-glycosylation ، يتم ربط الغليكان بمجموعة الهيدروكسيل من بقايا سيرين (Ser) أو ثريونين (Thr). في N-glycosylation ، يتم ربط الجليكان بسلسلة نيتروجين أميد الجانبية لبقايا الأسباراجين (Asn) داخل تسلسلات الببتيد الثلاثي Asn-X-Ser / Thr ، حيث يمكن أن يكون X أي حمض أميني باستثناء البرولين.

يمكن أن يعتمد الجليكان هياكل خطية أو متفرعة ويتكون من السكريات الأحادية أو السكريات المتعددة المرتبطة تساهميا بروابط غليكوزيدية. في بدائيات النوى ، عادة ما يظهر الجليكان تنوعا في تكوين السكر وبنيته مقارنة بالجليكان حقيقيات النواة⁴. علاوة على ذلك ، تم وصف مسارين مختلفين للغليكوزيل البكتيري يختلفان في كيفية تجميع الجليكان ونقله إلى البروتين المستقبل: الغليكوزيل المتسلسل و en bloc ^5,6. بالنسبة للغليكوزيل المتسلسل ، يتم بناء الجليكان المعقد مباشرة على البروتين عن طريق الإضافة المتتالية للسكريات الأحادية. في الغليكوزيل في الكتلة ، يتم نقل جليكان تم تجميعه مسبقا إلى البروتين من أوليغوساكاريد مرتبط بالدهون بواسطة أوليغوساكاريل ترانسفيراز متخصص (OTase). وقد ثبت أن كلا المسارين متورطان في عمليات N- و O-glycosylation ⁷.

غليكوزيل البروتين له دور في تعديل الخصائص الفيزيائية والكيميائية والبيولوجية للبروتينات. يمكن أن يؤثر وجود الجليكان على كيفية تفاعل البروتين مع رباطه ، مما يؤثر على النشاط البيولوجي للبروتين ، ولكن يمكن أن يؤثر أيضا على استقرار البروتين ، والذوبان ، والقابلية للتحلل البروتيني ، والمناعة ، والتفاعلات بين الميكروبات والمضيف ^8,9. ومع ذلك ، فإن العديد من معلمات الجليكوزيل ، مثل عدد الجليكان ، وتكوين الجليكان ، والموضع ، وآلية التعلق ، يمكن أن تؤثر أيضا على وظيفة البروتين وبنيته.

Glycosyltransferases (GTs) هي الإنزيمات الرئيسية في التخليق الحيوي للجليكان المعقدة و glycoconjugates. تحفز هذه الإنزيمات تكوين الرابطة الغليكوسيدية بين مويتي السكر من جزيء متبرع نشط ومتقبل ركيزة معين. يمكن أن تستخدم GTs كلا من النيوكليوتيدات وغير النيوكليوتيدات كجزيئات مانحة وتستهدف مستقبلات الركيزة المختلفة ، مثل البروتينات والسكريات والأحماض النووية والدهون¹⁰. لذلك ، فإن فهم GTs على المستوى الجزيئي مهم لتحديد آليات عملها وخصوصيتها ، كما يمكن من فهم كيفية ارتباط تكوين السكر في الجليكان الذي يعدل الجزيئات ذات الصلة بالإمراض. تصنف قاعدة بيانات إنزيم الكربوهيدرات النشطة (CAZy)¹¹ GTs وفقا لتماثل تسلسلها ، مما يوفر أداة تنبؤية نظرا لأن الطية الهيكلية وآليات العمل ثابتة في معظم عائلات GT. ومع ذلك ، هناك أربعة أسباب تجعل من الصعب التنبؤ بخصوصية الركيزة للعديد من GTs: 1) لم يتم تحديد أي شكل تسلسل واضح يحدد خصوصية الركيزة في بدائيات النوى^{12 ، 2}) تظهر العديد من GTs و OTases اختلاط الركيزة ^13,14 ، 3) يصعب إنتاج GTs الوظيفية في غلة عالية في شكل مؤتلف و 4) تحديد كل من الركائز المانحة والمتقبلة أمر معقد. وعلى الرغم من ذلك، مكنت دراسات الطفرات الحديثة من الحصول على تقدم كبير في فهم الآليات التحفيزية وطرح ربط GTs.

في البكتيريا ، يبدو أن O-glycosylation أكثر انتشارا من N-glycosylation. لا تظهر مواقع O-glycosylation تسلسلا إجماعا ، والعديد من بروتينات O-glycosylated تفرز أو بروتينات سطح الخلية ، مثل السوط أو pili أو autotransporters 1. يظهر السوط غليكوزيل التباين في عدد المواقع المتقبلة ، وتكوين الجليكان ، والهيكل. على سبيل المثال ، لدى أساطيل Burkholderia spp موقع متقبل واحد فقط ، بينما في Campylobacter jejuni ، لدى الأسواط ما يصل إلى 19 موقعا متقبلا^15,16. علاوة على ذلك ، بالنسبة لبعض البكتيريا ، فإن الغليكان عبارة عن سكاريد أحادي واحد ، في حين أن البكتيريا الأخرى تمتلك جليكان غير متجانس مخترق من السكريات الأحادية المختلفة لتشكيل السكريات القليلة. يحدث هذا التباين حتى بين سلالات من نفس النوع. يتم تعديل سوط هيليكوباكتر فقط بواسطة حمض البسيودامينيك (PseAc)¹⁷ ، ويمكن تعديل سوط العطيفة بواسطة PseAc ، وهو شكل الأسيتاميدينو من حمض pseudaminic (PseAm) أو حمض legionaminic (LegAm) ، والجليكان المشتق من هذه السكريات مع الأسيتيل أو N-acetylglucosamine أو بدائل البروبيونيك^18,19. في Aeromonas ، يتم تعديل السوط بواسطة الجليكان الذي يتراوح تكوينه من مشتق حمض PseAc واحد إلى عديد السكاريد غير المتجانس²⁰ ، ويكون ارتباط الجليكان بمونومرات السوط دائما عبر مشتق PseAc.

بشكل عام ، يعد غليكوزيل السوط ضروريا لتجميع خيوط السوط ، والحركة ، والضراوة ، وخصوصية المضيف. ومع ذلك ، في حين أن السوط من C. jejuni¹⁶ ، H. pylori^{17 ،} و Aeromonas sp. ²¹ لا يمكن أن تتجمع في خيوط ما لم تكن مونومرات البروتين هي غليكوزيليتد ، Pseudomonas spp. و Burkholderia spp. ¹⁵ لا تتطلب غليكوزيل لتجميع السوط. علاوة على ذلك ، في بعض سلالات C. jejuni ، تؤثر التغيرات في تكوين السكر في السوط غليكان على التفاعل بين البكتيريا والمضيف وقد تلعب دورا في التهرب من بعض الاستجابات المناعية¹⁶. التراص الذاتي هو سمة مظهرية أخرى تتأثر بالتعديلات في تكوين الجليكان المرتبطة بالسوط. يؤدي انخفاض التراص الذاتي إلى انخفاض القدرة على تكوين المستعمرات الدقيقة والأغشية الحيوية²². في بعض البكتيريا ، تم ربط قدرة السوط على تحفيز استجابة مؤيدة للالتهابات بغليكوزيل السوط. وهكذا ، في P. aeruginosa ، يحفز السوط الغليكوزيلاتي استجابة أعلى مؤيدة للالتهابات من unglycosylated²³.

Aeromonas هي بكتيريا سالبة الجرام منتشرة في كل مكان في البيئة ، مما يسمح لها بأن تكون في واجهة جميع مكونات One Health ²⁴. تحتوي Aeromonas الميزوفيليك على سوط قطبي واحد ، يتم إنتاجه بشكل تأسيسي. أكثر من نصف العزلات السريرية تعبر أيضا عن السوط الجانبي ، الذي يمكن تحريضه في وسائط أو ألواح عالية اللزوجة. وقد ربطت دراسات مختلفة كلا النوعين من الأسواط بالمراحل المبكرة من التسبب في البكتيريا²⁵. في حين أن السوط القطبي المبلغ عنه حتى الآن هو O-glycosylated في 5-8 Ser أو Thr بقايا مجالاته المناعية المركزية ، فإن السوط الجانبي ليس جليكوزيلا O-glycosylated في جميع السلالات. على الرغم من أن جليكان السوط القطبي من سلالات مختلفة يظهر تنوعا في تركيبته الكربوهيدراتية وطول السلسلة²⁰ ، فقد ثبت أن السكر الرابط هو مشتق حمض البسيودامينيك.

الهدف من هذه المخطوطة هو وصف طريقة للحصول على طفرات فارغة في GTs محددة أو مناطق كروموسومية تحتوي على GTs لتحليل مشاركتها في التخليق الحيوي لالسكريات ذات الصلة وفي الإمراض البكتيرية ، وكذلك دور الجليكان نفسه. على سبيل المثال ، نقوم بتحديد وحذف منطقة كروموسومية تحتوي على GTs من Aeromonas لإثبات مشاركتها في غليكوزيل السوط القطبي وتحليل دور جليكان السوط. نوضح كيفية حذف GT معين لتحديد وظيفته في التخليق الحيوي لهذا الجليكان ودور الجليكان المعدل. على الرغم من استخدام Aeromonas كمثال ، يمكن استخدام المبدأ لتحديد ودراسة جزر غليكوزيل السوط من البكتيريا الأخرى سالبة الجرام وتحليل وظيفة GTs المشاركة في التخليق الحيوي للجليكان الأخرى مثل عديد السكاريد الدهني O-antigen.

Protocol

يظهر التمثيل التخطيطي للإجراء في الشكل 1. 1. تحديد المعلوماتية الحيوية لجزيرة السوط غليكوزيل (FGIs) في Aeromonas لتحديد مجموعات التخليق الحيوي PseAc في جينومات Aeromonas ، استخدم أداة tblastn من قاعدة بيانات NCBI26. أولا ، استرجع البروت?…

Representative Results

توفر هذه المنهجية نظاما فعالا لتوليد طفرات فارغة في الجينات أو المناطق الكروموسومية في Aeromonas التي يمكن أن تؤثر على غليكوزيل السوط ودور خيوط السوط (الشكل 1). يبدأ البروتوكول بتحديد المعلوماتية الحيوية ل FGIs المفترضة والجينات التي تقوم بتشفير GTs في هذه الم?…

Discussion

الخطوة المبكرة الحاسمة لهذه الطريقة هي تحديد المناطق المشاركة في غليكوزيل السوط و GTs المفترضة لأن هذه الإنزيمات تظهر تماثلا عاليا وتشارك في العديد من العمليات. يظهر التحليل المعلوماتي الحيوي لجينومات Aeromonas في قواعد البيانات العامة أن هذه المنطقة مجاورة لمنطقة السوط القطبي 2 ، والتي ?…

Materials

ABI PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit	Applied Biosystems	4337455	Used for sequencing
AccuPrime Taq DNA Polymerase, high fidelity	Invitrogen	12346-086	Used for amplification of AB, CD and AD fragments
Agarose	Conda-Pronadise	8008	Used for DNA electrophoresis
Alkaline phosphatase, calf intestinal (CIAP)	Promega	M1821	Used to remove phosphate at the 5’ end
Bacto agar	Becton Dickinson	214010	Use for motility analysis
BamHI	Promega	R6021	Used for endonuclease restriction
BglII	Promega	R6081	Used for endonuclease restriction
BioDoc-It Imagin System	UVP		Bio-imaging station used for DNA visualization
Biotaq polymerase	Bioline	BIO-21040	Used for colony screening
Cesium chloride	Applichem	A1126,0100	Used for flagella purification
Chloramphenicol	Applichem	A1806,0025	Used for triparental mating
Cytiva illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit	Cytivia	28-9034-71	Used for purification of PCR amplicons and DNA fragments.
EDTA	Applichem	131026.1211	Used for DNA electrophoresis
Electroporation cuvettes 2 mm gap	VWR	732-1133	Used for transformation
Ethidium bromide	Applichem	A1152,0025	Use for DNA visualization
HyperLadder 1 Kb marker	Bioline	BIO-33053	DNA marker
Invitrogen Easy-DNA gDNA Purification Kit	Invitrogen	10750204	Used for bacterial chromosomal DNA purification
Luria-Bertani (LB) Miller agar	Condalab	996	Used for Escherichia coli culture
Luria-Bertani (LB) Miller broth	Condalab	1551	Used for Escherichia coli culture
Nanodrop ND-1000	NanoDrop Techonologies Inc		Spectrophotometer used for DNA quantification
Rifampicin	Applichem	A2220,0005	Used for triparental mating
SOC Medium	Invitrogen	15544034	Used for electroporation recovery
Spectinomycin	Applichem	A3834,0005	Used for triparental mating
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor	Beckman	331362	Used for flagella purification
T4 DNA ligase	Invitrogen	15224017	Used for ligation reaction
Trypticasein soy agar	Condalab	1068	Used for Aeromonas grown
Trypticasein soy broth	Condalab	1224	Used for Aeromonas grown
Tryptone	Condalab	1612	Use for motility analysis
Tris	Applichem	A2264,0500	Used for DNA electrophoresis and flagella purification
Triton X-100	Applichem	A4975,0100	Used for bacterial lysis
Ultra Clear tubes (14 mm x 89 mm)	Beckman	344059	Used for flagella purification
Veriti 96 well Thermal Cycler	Applied Biosystems		Used for PCR reactions
Zyppy Plasmid Miniprep II Kit	Zymmo research	D4020	Used for isolation of plasmid DNA