Generatie van null-mutanten om de rol van bacteriële glycosyltransferasen in bacteriële motiliteit op te helderen

Summary

Hier beschrijven we de constructie van nulmutanten van Aeromonas in specifieke glycosyltransferasen of regio’s die glycosyltransferasen bevatten, de beweeglijkheidstests en flagellenzuivering die worden uitgevoerd om de betrokkenheid en functie van hun gecodeerde enzymen in de biosynthese van een glycaan vast te stellen, evenals de rol van deze glycaan in bacteriële pathogenese.

Abstract

De studie van glycosylatie in prokaryoten is een snel groeiend gebied. Bacteriën herbergen verschillende geglycosyleerde structuren op hun oppervlak waarvan de glycanen een stamspecifieke barcode vormen. De geassocieerde glycanen vertonen een hogere diversiteit in suikersamenstelling en -structuur dan die van eukaryoten en zijn belangrijk in bacteriële-gastheerherkenningsprocessen en interactie met de omgeving. Bij pathogene bacteriën zijn glycoproteïnen betrokken geweest bij verschillende stadia van het infectieuze proces en glycaanmodificaties kunnen interfereren met specifieke functies van glycoproteïnen. Ondanks de vooruitgang die is geboekt in het begrip van glycaansamenstelling, structuur en biosyntheseroutes, blijft het begrip van de rol van glycoproteïnen in pathogeniciteit of interactie met de omgeving echter zeer beperkt. Bovendien worden in sommige bacteriën de enzymen die nodig zijn voor eiwitglycosylatie gedeeld met andere polysaccharide biosynthetische routes, zoals lipopolysaccharide en capsule biosynthetische routes. Het functionele belang van glycosylatie is in verschillende bacteriën opgehelderd door mutatie van specifieke genen waarvan wordt gedacht dat ze betrokken zijn bij het glycosyleringsproces en de studie van de impact ervan op de expressie van het doelglycoproteïne en de modificerende glycaan. Mesofiele Aeromonas hebben een enkelvoudig en O-geglycosyleerd polair flagellum. Flagellaire glycanen vertonen diversiteit in koolhydraatsamenstelling en ketenlengte tussen Aeromonas-stammen. Alle tot nu toe geanalyseerde stammen tonen echter een pseudamininezuurderivaat als de koppelende suiker die serine- of threonineresiduen wijzigt. Het pseudamininezuurderivaat is vereist voor polaire flagella-assemblage en het verlies ervan heeft een impact op adhesie, biofilmvorming en kolonisatie. Het protocol dat in dit artikel wordt beschreven, beschrijft hoe de constructie van nulmutanten kan worden gebruikt om de betrokkenheid van genen of genoomgebieden die vermeende glycosyltransferasen bevatten in de biosynthese van een flagellaire glycaan te begrijpen. Dit omvat het potentieel om de functie van de betrokken glycosyltransferasen en de rol van de glycaan te begrijpen. Dit zal worden bereikt door de glycaan-deficiënte mutant te vergelijken met de wild-type stam.

Introduction

Eiwitglycosylatie is beschreven in zowel Gram-positieve als Gram-negatieve bacteriën en bestaat uit de covalente hechting van een glycaan aan een aminozuurzijketen ^1,2. Bij prokaryoten vindt dit proces meestal plaats via twee belangrijke enzymatische mechanismen: O- en N-glycosylatie ³. Bij O-glycosylatie is de glycaan bevestigd aan de hydroxylgroep van een serine (Ser) of threonine (Thr) residu. Bij N-glycosylatie is de glycaan bevestigd aan de zijketenamidestikstof van een asparagine (Asn) residu binnen de tripeptidesequenties Asn-X-Ser/Thr, waarbij X elk aminozuur kan zijn behalve proline.

Glycanen kunnen lineaire of vertakte structuren aannemen en zijn samengesteld uit monosachariden of polysacchariden die covalent verbonden zijn door glycosidische bindingen. In prokaryoten vertonen glycanen meestal diversiteit in suikersamenstelling en -structuur in vergelijking met eukaryote glycanen⁴. Verder zijn twee verschillende bacteriële glycosylatieroutes beschreven die verschillen in de manier waarop de glycaan wordt samengesteld en overgebracht naar het acceptoreiwit: sequentiële en en bloc glycosylatie ^5,6. Voor sequentiële glycosylatie wordt het complexe glycaan direct op het eiwit opgebouwd door opeenvolgende toevoeging van monosacchariden. Bij en bloc glycosylatie wordt een voorgeassembleerd glycaan door een gespecialiseerd oligosaccharyltransferase (OTase) overgebracht naar het eiwit van een lipide-gebonden oligosacharide. Van beide routes is aangetoond dat ze betrokken zijn bij N- en O-glycosylatieprocessen⁷.

Eiwitglycosylatie speelt een rol bij het moduleren van de fysisch-chemische en biologische eigenschappen van eiwitten. De aanwezigheid van een glycaan kan beïnvloeden hoe het eiwit interageert met zijn ligand, wat de biologische activiteit van het eiwit beïnvloedt, maar kan ook de eiwitstabiliteit, oplosbaarheid, gevoeligheid voor proteolyse, immunogeniciteit en microbe-gastheerinteracties beïnvloeden ^8,9. Verschillende glycosylatieparameters, zoals het aantal glycanen, de samenstelling, positie en het hechtingsmechanisme van glycanen, kunnen echter ook de eiwitfunctie en -structuur beïnvloeden.

Glycosyltransferasen (GT’s) zijn de belangrijkste enzymen in de biosynthese van complexe glycanen en glycoconjugaten. Deze enzymen katalyseren de glycosidische bindingsvorming tussen een suikergroep van een geactiveerd donormolecuul en een specifieke substraatacceptor. GT’s kunnen zowel nucleotiden als niet-nucleotiden gebruiken als donormoleculen en zich richten op verschillende substraatacceptoren, zoals eiwitten, sacchariden, nucleïnezuren en lipiden¹⁰. Daarom is het begrijpen van GT’s op moleculair niveau belangrijk om hun werkingsmechanismen en specificiteit te identificeren, en maakt het ook mogelijk om te begrijpen hoe de suikersamenstelling van glycanen die relevante moleculen wijzigen, gerelateerd is aan pathogeniciteit. De Carbohydrate Active enzyme database (CAZy)¹¹ classificeert GT’s op basis van hun sequentie homologie, wat een voorspellend hulpmiddel biedt omdat in de meeste GT-families de structurele vouw en werkingsmechanismen invariant zijn. Vier redenen maken het echter moeilijk om substraatspecificiteit van veel GT’s te voorspellen: 1) er is geen duidelijk sequentiemotief dat de substraatspecificiteit bepaalt bepaald in prokaryoten¹², 2) veel GT’s en OTases vertonen substraatpromiscuïteit ^13,14, 3) functionele GT’s zijn moeilijk te produceren in hoge opbrengst in recombinante vorm en 4) de identificatie van zowel donor- als acceptorsubstraten is complex. Desondanks hebben recente mutagenesestudies het mogelijk gemaakt om aanzienlijke vooruitgang te boeken in het begrip van katalytische mechanismen en het aftrekken van binding van GT’s.

Bij bacteriën lijkt O-glycosylatie vaker voor te komen dan N-glycosylatie. De O-glycosylatieplaatsen vertonen geen consensussequentie en veel van de O-geglycosyleerde eiwitten zijn uitgescheiden of celoppervlakeiwitten, zoals flagellinen, pili of autotransporters¹. Flagelline glycosylatie toont variabiliteit in het aantal acceptorplaatsen, glycaansamenstelling en structuur. Burkholderia spp flagellins hebben bijvoorbeeld slechts één acceptantensite, terwijl flagellins in Campylobacter jejuni maar liefst 19 acceptorsites hebben^15,16. Bovendien is de glycaan voor sommige bacteriën een enkele monosacharide, terwijl andere bacteriën heterogene glycanen bezitten die zijn aangetast door verschillende monosachariden om oligosachariden te vormen. Deze heterogeniciteit komt zelfs voor bij stammen van dezelfde soort. Helicobacter flagellinen worden alleen gewijzigd door pseudamininezuur (PseAc)¹⁷, en Campylobacter flagellinen kunnen worden gewijzigd door PseAc, de acetamidinovorm van het pseudamininezuur (PSEAm) of legionaminezuur (LegAm), en glycanen afgeleid van deze suikers met acetyl, N-acetylglucosamine of propionische substituties^18,19. In Aeromonas worden flagelliërs gemodificeerd door glycanen waarvan de samenstelling varieert van een enkel PseAc-zuurderivaat tot een heteropolysaccharide²⁰, en de aanhechting van glycanen aan de flagellinemonomeren verloopt altijd via een PseAc-derivaat.

Over het algemeen is glycosylatie van flagellinen essentieel voor de assemblage van flagellaire filamenten, motiliteit, virulentie en gastheerspecificiteit. Echter, terwijl flagellins van C. jejuni¹⁶, H. pylori^{17 en} Aeromonas sp. ²¹ kan niet tot filament worden samengevoegd tenzij de eiwitmonomeren zijn geglycosyleerd, Pseudomonas spp. en Burkholderia spp. ¹⁵ vereisen geen glycosylatie voor flagella-assemblage. Bovendien beïnvloeden bij sommige C. jejuni-stammen veranderingen in de suikersamenstelling van de flagella glycan de interactie tussen bacteriën en gastheer en kunnen ze een rol spelen bij het ontwijken van bepaalde immuunresponsen¹⁶. Autoagglutinatie is een ander fenotypisch kenmerk dat wordt beïnvloed door wijzigingen in de samenstelling van glycanen geassocieerd met flagellinen. Een lagere autoagglutinatie leidt tot een vermindering van het vermogen om microkolonies en biofilm te vormen²². Bij sommige bacteriën was het vermogen van flagella om een pro-inflammatoire reactie te veroorzaken gekoppeld aan flagelline glycosylatie. Dus, in P. aeruginosa, geglycosyleerde flagelline induceert een hogere pro-inflammatoire respons dan unglycosylated²³.

Aeromonas zijn Gram-negatieve bacteriën die alomtegenwoordig zijn in de omgeving, waardoor ze zich op het grensvlak van alle One Health-componenten ^{kunnen bevinden 24}. Mesofiele Aeromonas hebben een enkel polair flagellum, dat constitutief wordt geproduceerd. Meer dan de helft van de klinische isolaten drukt ook laterale flagelline uit, inducerend in media of platen met een hoge viscositeit. Verschillende studies hebben beide flagellatypen in verband gebracht met de vroege stadia van bacteriële pathogenese²⁵. Terwijl polaire flagelylen die tot nu toe zijn gemeld O-geglycosyleerd zijn op 5-8 Ser- of Thr-residuen van de centrale immunogene domeinen, zijn laterale flagellines niet O-geglycosyleerd in alle stammen. Hoewel polaire flagella glycanen van verschillende stammen diversiteit vertonen in hun koolhydraatsamenstelling en ketenlengte²⁰, is aangetoond dat de koppelende suiker een pseudamininezuurderivaat is.

Het doel van dit manuscript is om een methode te beschrijven om nulmutanten te verkrijgen in specifieke GT’s of chromosomale regio’s die GT’s bevatten om hun betrokkenheid bij de biosynthese van relevante polysacchariden en bacteriële pathogeniciteit te analyseren, evenals de rol van de glycaan zelf. Als voorbeeld identificeren en verwijderen we een chromosomaal gebied dat GT’s van Aeromonas bevat om zijn betrokkenheid bij polaire flagellineglycosylatie vast te stellen en de rol van de flagelline glycaan te analyseren. We laten zien hoe je een specifieke GT kunt verwijderen om zijn functie in de biosynthese van deze glycaan en de rol van gemodificeerde glycaan vast te stellen. Hoewel Aeromonas als voorbeeld wordt gebruikt, kan het principe worden gebruikt om flagellaglycosylatie-eilanden van andere Gram-negatieve bacteriën te identificeren en te bestuderen en de functie van GT’s te analyseren die betrokken zijn bij de biosynthese van andere glycanen zoals de O-antigeen lipopolysaccharide.

Protocol

De schematische weergave van de procedure is weergegeven in figuur 1. 1. Bioinformatische identificatie van flagella glycosylatie eiland (GFI’s) in Aeromonas Om de pseac biosynthetische clusters in de Aeromonas genomen te identificeren, gebruikt u de tblastn tool uit de NCBI database26. Haal eerst orthologe eiwitten naar PSEC en PSEI van A. piscicola AH-3 (identificatiecodes zij…

Representative Results

Deze methodologie biedt een effectief systeem om nulmutanten te genereren in genen of chromosomale regio’s van Aeromonas die flagellaglycosylering en de rol van flagellafilament kunnen beïnvloeden (figuur 1). Het protocol begint met de bioinformatische identificatie van vermeende FFI’s en de genen die coderen voor GT’s die in deze regio aanwezig zijn. In Aeromonas is de chromosomale locatie van GFI’s gebaseerd op de detectie van drie soorten gen…

Discussion

De cruciale vroege stap van deze methode is de identificatie van regio’s die betrokken zijn bij de glycosylatie van flagella en vermeende GT’s, omdat deze enzymen een hoge homologie vertonen en betrokken zijn bij veel processen. Bioinformatische analyse van Aeromonas-genomen in openbare databases toont aan dat dit gebied grenst aan het polaire flagellagebied 2, dat de flagellinegenen in veel stammen bevat en genen bevat die betrokken zijn bij de biosynthese van pseudamininezuur²⁷. Dit hee…

Materials

ABI PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit	Applied Biosystems	4337455	Used for sequencing
AccuPrime Taq DNA Polymerase, high fidelity	Invitrogen	12346-086	Used for amplification of AB, CD and AD fragments
Agarose	Conda-Pronadise	8008	Used for DNA electrophoresis
Alkaline phosphatase, calf intestinal (CIAP)	Promega	M1821	Used to remove phosphate at the 5’ end
Bacto agar	Becton Dickinson	214010	Use for motility analysis
BamHI	Promega	R6021	Used for endonuclease restriction
BglII	Promega	R6081	Used for endonuclease restriction
BioDoc-It Imagin System	UVP		Bio-imaging station used for DNA visualization
Biotaq polymerase	Bioline	BIO-21040	Used for colony screening
Cesium chloride	Applichem	A1126,0100	Used for flagella purification
Chloramphenicol	Applichem	A1806,0025	Used for triparental mating
Cytiva illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit	Cytivia	28-9034-71	Used for purification of PCR amplicons and DNA fragments.
EDTA	Applichem	131026.1211	Used for DNA electrophoresis
Electroporation cuvettes 2 mm gap	VWR	732-1133	Used for transformation
Ethidium bromide	Applichem	A1152,0025	Use for DNA visualization
HyperLadder 1 Kb marker	Bioline	BIO-33053	DNA marker
Invitrogen Easy-DNA gDNA Purification Kit	Invitrogen	10750204	Used for bacterial chromosomal DNA purification
Luria-Bertani (LB) Miller agar	Condalab	996	Used for Escherichia coli culture
Luria-Bertani (LB) Miller broth	Condalab	1551	Used for Escherichia coli culture
Nanodrop ND-1000	NanoDrop Techonologies Inc		Spectrophotometer used for DNA quantification
Rifampicin	Applichem	A2220,0005	Used for triparental mating
SOC Medium	Invitrogen	15544034	Used for electroporation recovery
Spectinomycin	Applichem	A3834,0005	Used for triparental mating
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor	Beckman	331362	Used for flagella purification
T4 DNA ligase	Invitrogen	15224017	Used for ligation reaction
Trypticasein soy agar	Condalab	1068	Used for Aeromonas grown
Trypticasein soy broth	Condalab	1224	Used for Aeromonas grown
Tryptone	Condalab	1612	Use for motility analysis
Tris	Applichem	A2264,0500	Used for DNA electrophoresis and flagella purification
Triton X-100	Applichem	A4975,0100	Used for bacterial lysis
Ultra Clear tubes (14 mm x 89 mm)	Beckman	344059	Used for flagella purification
Veriti 96 well Thermal Cycler	Applied Biosystems		Used for PCR reactions
Zyppy Plasmid Miniprep II Kit	Zymmo research	D4020	Used for isolation of plasmid DNA