Hier beschrijven we de constructie van nulmutanten van Aeromonas in specifieke glycosyltransferasen of regio’s die glycosyltransferasen bevatten, de beweeglijkheidstests en flagellenzuivering die worden uitgevoerd om de betrokkenheid en functie van hun gecodeerde enzymen in de biosynthese van een glycaan vast te stellen, evenals de rol van deze glycaan in bacteriële pathogenese.
De studie van glycosylatie in prokaryoten is een snel groeiend gebied. Bacteriën herbergen verschillende geglycosyleerde structuren op hun oppervlak waarvan de glycanen een stamspecifieke barcode vormen. De geassocieerde glycanen vertonen een hogere diversiteit in suikersamenstelling en -structuur dan die van eukaryoten en zijn belangrijk in bacteriële-gastheerherkenningsprocessen en interactie met de omgeving. Bij pathogene bacteriën zijn glycoproteïnen betrokken geweest bij verschillende stadia van het infectieuze proces en glycaanmodificaties kunnen interfereren met specifieke functies van glycoproteïnen. Ondanks de vooruitgang die is geboekt in het begrip van glycaansamenstelling, structuur en biosyntheseroutes, blijft het begrip van de rol van glycoproteïnen in pathogeniciteit of interactie met de omgeving echter zeer beperkt. Bovendien worden in sommige bacteriën de enzymen die nodig zijn voor eiwitglycosylatie gedeeld met andere polysaccharide biosynthetische routes, zoals lipopolysaccharide en capsule biosynthetische routes. Het functionele belang van glycosylatie is in verschillende bacteriën opgehelderd door mutatie van specifieke genen waarvan wordt gedacht dat ze betrokken zijn bij het glycosyleringsproces en de studie van de impact ervan op de expressie van het doelglycoproteïne en de modificerende glycaan. Mesofiele Aeromonas hebben een enkelvoudig en O-geglycosyleerd polair flagellum. Flagellaire glycanen vertonen diversiteit in koolhydraatsamenstelling en ketenlengte tussen Aeromonas-stammen. Alle tot nu toe geanalyseerde stammen tonen echter een pseudamininezuurderivaat als de koppelende suiker die serine- of threonineresiduen wijzigt. Het pseudamininezuurderivaat is vereist voor polaire flagella-assemblage en het verlies ervan heeft een impact op adhesie, biofilmvorming en kolonisatie. Het protocol dat in dit artikel wordt beschreven, beschrijft hoe de constructie van nulmutanten kan worden gebruikt om de betrokkenheid van genen of genoomgebieden die vermeende glycosyltransferasen bevatten in de biosynthese van een flagellaire glycaan te begrijpen. Dit omvat het potentieel om de functie van de betrokken glycosyltransferasen en de rol van de glycaan te begrijpen. Dit zal worden bereikt door de glycaan-deficiënte mutant te vergelijken met de wild-type stam.
Eiwitglycosylatie is beschreven in zowel Gram-positieve als Gram-negatieve bacteriën en bestaat uit de covalente hechting van een glycaan aan een aminozuurzijketen 1,2. Bij prokaryoten vindt dit proces meestal plaats via twee belangrijke enzymatische mechanismen: O- en N-glycosylatie 3. Bij O-glycosylatie is de glycaan bevestigd aan de hydroxylgroep van een serine (Ser) of threonine (Thr) residu. Bij N-glycosylatie is de glycaan bevestigd aan de zijketenamidestikstof van een asparagine (Asn) residu binnen de tripeptidesequenties Asn-X-Ser/Thr, waarbij X elk aminozuur kan zijn behalve proline.
Glycanen kunnen lineaire of vertakte structuren aannemen en zijn samengesteld uit monosachariden of polysacchariden die covalent verbonden zijn door glycosidische bindingen. In prokaryoten vertonen glycanen meestal diversiteit in suikersamenstelling en -structuur in vergelijking met eukaryote glycanen4. Verder zijn twee verschillende bacteriële glycosylatieroutes beschreven die verschillen in de manier waarop de glycaan wordt samengesteld en overgebracht naar het acceptoreiwit: sequentiële en en bloc glycosylatie 5,6. Voor sequentiële glycosylatie wordt het complexe glycaan direct op het eiwit opgebouwd door opeenvolgende toevoeging van monosacchariden. Bij en bloc glycosylatie wordt een voorgeassembleerd glycaan door een gespecialiseerd oligosaccharyltransferase (OTase) overgebracht naar het eiwit van een lipide-gebonden oligosacharide. Van beide routes is aangetoond dat ze betrokken zijn bij N- en O-glycosylatieprocessen7.
Eiwitglycosylatie speelt een rol bij het moduleren van de fysisch-chemische en biologische eigenschappen van eiwitten. De aanwezigheid van een glycaan kan beïnvloeden hoe het eiwit interageert met zijn ligand, wat de biologische activiteit van het eiwit beïnvloedt, maar kan ook de eiwitstabiliteit, oplosbaarheid, gevoeligheid voor proteolyse, immunogeniciteit en microbe-gastheerinteracties beïnvloeden 8,9. Verschillende glycosylatieparameters, zoals het aantal glycanen, de samenstelling, positie en het hechtingsmechanisme van glycanen, kunnen echter ook de eiwitfunctie en -structuur beïnvloeden.
Glycosyltransferasen (GT’s) zijn de belangrijkste enzymen in de biosynthese van complexe glycanen en glycoconjugaten. Deze enzymen katalyseren de glycosidische bindingsvorming tussen een suikergroep van een geactiveerd donormolecuul en een specifieke substraatacceptor. GT’s kunnen zowel nucleotiden als niet-nucleotiden gebruiken als donormoleculen en zich richten op verschillende substraatacceptoren, zoals eiwitten, sacchariden, nucleïnezuren en lipiden10. Daarom is het begrijpen van GT’s op moleculair niveau belangrijk om hun werkingsmechanismen en specificiteit te identificeren, en maakt het ook mogelijk om te begrijpen hoe de suikersamenstelling van glycanen die relevante moleculen wijzigen, gerelateerd is aan pathogeniciteit. De Carbohydrate Active enzyme database (CAZy)11 classificeert GT’s op basis van hun sequentie homologie, wat een voorspellend hulpmiddel biedt omdat in de meeste GT-families de structurele vouw en werkingsmechanismen invariant zijn. Vier redenen maken het echter moeilijk om substraatspecificiteit van veel GT’s te voorspellen: 1) er is geen duidelijk sequentiemotief dat de substraatspecificiteit bepaalt bepaald in prokaryoten12, 2) veel GT’s en OTases vertonen substraatpromiscuïteit 13,14, 3) functionele GT’s zijn moeilijk te produceren in hoge opbrengst in recombinante vorm en 4) de identificatie van zowel donor- als acceptorsubstraten is complex. Desondanks hebben recente mutagenesestudies het mogelijk gemaakt om aanzienlijke vooruitgang te boeken in het begrip van katalytische mechanismen en het aftrekken van binding van GT’s.
Bij bacteriën lijkt O-glycosylatie vaker voor te komen dan N-glycosylatie. De O-glycosylatieplaatsen vertonen geen consensussequentie en veel van de O-geglycosyleerde eiwitten zijn uitgescheiden of celoppervlakeiwitten, zoals flagellinen, pili of autotransporters1. Flagelline glycosylatie toont variabiliteit in het aantal acceptorplaatsen, glycaansamenstelling en structuur. Burkholderia spp flagellins hebben bijvoorbeeld slechts één acceptantensite, terwijl flagellins in Campylobacter jejuni maar liefst 19 acceptorsites hebben15,16. Bovendien is de glycaan voor sommige bacteriën een enkele monosacharide, terwijl andere bacteriën heterogene glycanen bezitten die zijn aangetast door verschillende monosachariden om oligosachariden te vormen. Deze heterogeniciteit komt zelfs voor bij stammen van dezelfde soort. Helicobacter flagellinen worden alleen gewijzigd door pseudamininezuur (PseAc)17, en Campylobacter flagellinen kunnen worden gewijzigd door PseAc, de acetamidinovorm van het pseudamininezuur (PSEAm) of legionaminezuur (LegAm), en glycanen afgeleid van deze suikers met acetyl, N-acetylglucosamine of propionische substituties18,19. In Aeromonas worden flagelliërs gemodificeerd door glycanen waarvan de samenstelling varieert van een enkel PseAc-zuurderivaat tot een heteropolysaccharide20, en de aanhechting van glycanen aan de flagellinemonomeren verloopt altijd via een PseAc-derivaat.
Over het algemeen is glycosylatie van flagellinen essentieel voor de assemblage van flagellaire filamenten, motiliteit, virulentie en gastheerspecificiteit. Echter, terwijl flagellins van C. jejuni16, H. pylori17 en Aeromonas sp. 21 kan niet tot filament worden samengevoegd tenzij de eiwitmonomeren zijn geglycosyleerd, Pseudomonas spp. en Burkholderia spp. 15 vereisen geen glycosylatie voor flagella-assemblage. Bovendien beïnvloeden bij sommige C. jejuni-stammen veranderingen in de suikersamenstelling van de flagella glycan de interactie tussen bacteriën en gastheer en kunnen ze een rol spelen bij het ontwijken van bepaalde immuunresponsen16. Autoagglutinatie is een ander fenotypisch kenmerk dat wordt beïnvloed door wijzigingen in de samenstelling van glycanen geassocieerd met flagellinen. Een lagere autoagglutinatie leidt tot een vermindering van het vermogen om microkolonies en biofilm te vormen22. Bij sommige bacteriën was het vermogen van flagella om een pro-inflammatoire reactie te veroorzaken gekoppeld aan flagelline glycosylatie. Dus, in P. aeruginosa, geglycosyleerde flagelline induceert een hogere pro-inflammatoire respons dan unglycosylated23.
Aeromonas zijn Gram-negatieve bacteriën die alomtegenwoordig zijn in de omgeving, waardoor ze zich op het grensvlak van alle One Health-componenten kunnen bevinden 24. Mesofiele Aeromonas hebben een enkel polair flagellum, dat constitutief wordt geproduceerd. Meer dan de helft van de klinische isolaten drukt ook laterale flagelline uit, inducerend in media of platen met een hoge viscositeit. Verschillende studies hebben beide flagellatypen in verband gebracht met de vroege stadia van bacteriële pathogenese25. Terwijl polaire flagelylen die tot nu toe zijn gemeld O-geglycosyleerd zijn op 5-8 Ser- of Thr-residuen van de centrale immunogene domeinen, zijn laterale flagellines niet O-geglycosyleerd in alle stammen. Hoewel polaire flagella glycanen van verschillende stammen diversiteit vertonen in hun koolhydraatsamenstelling en ketenlengte20, is aangetoond dat de koppelende suiker een pseudamininezuurderivaat is.
Het doel van dit manuscript is om een methode te beschrijven om nulmutanten te verkrijgen in specifieke GT’s of chromosomale regio’s die GT’s bevatten om hun betrokkenheid bij de biosynthese van relevante polysacchariden en bacteriële pathogeniciteit te analyseren, evenals de rol van de glycaan zelf. Als voorbeeld identificeren en verwijderen we een chromosomaal gebied dat GT’s van Aeromonas bevat om zijn betrokkenheid bij polaire flagellineglycosylatie vast te stellen en de rol van de flagelline glycaan te analyseren. We laten zien hoe je een specifieke GT kunt verwijderen om zijn functie in de biosynthese van deze glycaan en de rol van gemodificeerde glycaan vast te stellen. Hoewel Aeromonas als voorbeeld wordt gebruikt, kan het principe worden gebruikt om flagellaglycosylatie-eilanden van andere Gram-negatieve bacteriën te identificeren en te bestuderen en de functie van GT’s te analyseren die betrokken zijn bij de biosynthese van andere glycanen zoals de O-antigeen lipopolysaccharide.
De cruciale vroege stap van deze methode is de identificatie van regio’s die betrokken zijn bij de glycosylatie van flagella en vermeende GT’s, omdat deze enzymen een hoge homologie vertonen en betrokken zijn bij veel processen. Bioinformatische analyse van Aeromonas-genomen in openbare databases toont aan dat dit gebied grenst aan het polaire flagellagebied 2, dat de flagellinegenen in veel stammen bevat en genen bevat die betrokken zijn bij de biosynthese van pseudamininezuur27. Dit hee…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door de National Research Council Canada, voor het Plan Nacional de I + D (Ministerio de Economía y Competitividad, Spanje) en voor de Generalitat de Catalunya (Centre de Referència en Biotecnologia).
ABI PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit | Applied Biosystems | 4337455 | Used for sequencing |
AccuPrime Taq DNA Polymerase, high fidelity | Invitrogen | 12346-086 | Used for amplification of AB, CD and AD fragments |
Agarose | Conda-Pronadise | 8008 | Used for DNA electrophoresis |
Alkaline phosphatase, calf intestinal (CIAP) | Promega | M1821 | Used to remove phosphate at the 5’ end |
Bacto agar | Becton Dickinson | 214010 | Use for motility analysis |
BamHI | Promega | R6021 | Used for endonuclease restriction |
BglII | Promega | R6081 | Used for endonuclease restriction |
BioDoc-It Imagin System | UVP | Bio-imaging station used for DNA visualization | |
Biotaq polymerase | Bioline | BIO-21040 | Used for colony screening |
Cesium chloride | Applichem | A1126,0100 | Used for flagella purification |
Chloramphenicol | Applichem | A1806,0025 | Used for triparental mating |
Cytiva illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit | Cytivia | 28-9034-71 | Used for purification of PCR amplicons and DNA fragments. |
EDTA | Applichem | 131026.1211 | Used for DNA electrophoresis |
Electroporation cuvettes 2 mm gap | VWR | 732-1133 | Used for transformation |
Ethidium bromide | Applichem | A1152,0025 | Use for DNA visualization |
HyperLadder 1 Kb marker | Bioline | BIO-33053 | DNA marker |
Invitrogen Easy-DNA gDNA Purification Kit | Invitrogen | 10750204 | Used for bacterial chromosomal DNA purification |
Luria-Bertani (LB) Miller agar | Condalab | 996 | Used for Escherichia coli culture |
Luria-Bertani (LB) Miller broth | Condalab | 1551 | Used for Escherichia coli culture |
Nanodrop ND-1000 | NanoDrop Techonologies Inc | Spectrophotometer used for DNA quantification | |
Rifampicin | Applichem | A2220,0005 | Used for triparental mating |
SOC Medium | Invitrogen | 15544034 | Used for electroporation recovery |
Spectinomycin | Applichem | A3834,0005 | Used for triparental mating |
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman | 331362 | Used for flagella purification |
T4 DNA ligase | Invitrogen | 15224017 | Used for ligation reaction |
Trypticasein soy agar | Condalab | 1068 | Used for Aeromonas grown |
Trypticasein soy broth | Condalab | 1224 | Used for Aeromonas grown |
Tryptone | Condalab | 1612 | Use for motility analysis |
Tris | Applichem | A2264,0500 | Used for DNA electrophoresis and flagella purification |
Triton X-100 | Applichem | A4975,0100 | Used for bacterial lysis |
Ultra Clear tubes (14 mm x 89 mm) | Beckman | 344059 | Used for flagella purification |
Veriti 96 well Thermal Cycler | Applied Biosystems | Used for PCR reactions | |
Zyppy Plasmid Miniprep II Kit | Zymmo research | D4020 | Used for isolation of plasmid DNA |