JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genetics

Анализы ACT1-CUP1 определяют субстрат-специфическую чувствительность сплайсеосомальных мутантов в почковых дрожжах

Published: June 30, 2022
doi:
10.3791/63232
1College of Arts and Sciences,Northwest University

Summary

Анализ ACT1-CUP1, анализ роста меди, обеспечивает быстрое считывание сплайсинга РНК-предшественника (пре-мРНК) и влияние мутантных факторов сплайсинга на сплайсеосомную функцию. Это исследование предоставляет протокол и подчеркивает возможность настройки для решения интересующего вопроса сплайсинга.

Abstract

Мутации, введенные в сплайсеосому или ее субстрат, значительно способствовали нашему пониманию тонкостей сплайсеосомальной функции. Независимо от того, связаны ли они с заболеванием или функционально выбраны, многие из этих мутаций были изучены с использованием анализов роста в модельном организме Saccharomyces cerevisiae (дрожжи). Специфический для сращивания анализ роста меди, или ACT1-CUP1, обеспечивает всесторонний анализ мутации на фенотипическом уровне. В анализе ACT1-CUP1 используются репортеры, которые обеспечивают допуск меди при правильном сращивании. Таким образом, в присутствии меди изменения жизнеспособности дрожжей коррелируют с изменениями в производстве мРНК посредством сплайсинга. В типичном эксперименте дрожжевой сплайсеосоме бросают вызов с различными неконсенсусными репортерами сплайсинга и мутацией фактора сплайсинга, представляющей интерес, для обнаружения любого синергетического или антитетического воздействия на сплайсинг. Здесь приведено полное описание подготовки медной пластины, обшивки дрожжевых клеток, а также оценка данных. Описана подборка дополнительных экспериментов, подчеркивающих универсальность репортеров ACT1-CUP1. Анализ ACT1-CUP1 является удобным инструментом в наборе инструментов для сращивания благодаря прямому считыванию мутационного эффекта (эффектов) и сравнительным возможностям от продолжающегося использования в полевых условиях.

Introduction

Сплайсеосома представляет собой большую биологическую машину, которая катализирует удаление интронов, некодирующих областей в РНК-предшественника-мессенджера (пре-мРНК)1,2. Характеристика эффекта мутанта одной точки в 1 из почти 100 белков и 5 некодирующих РНК часто неоднозначна при изучении белка или РНК в изоляции. Изменение функции мутированного компонента лучше всего может быть оценено in vivo в контексте полной, функционирующей сплайсеосомы.

Анализ роста меди, описанный здесь, является быстрым показателем эффективности сращивания в Saccharomyces cerevisiae или почковых дрожжах. Разработанный К.Ф. Лессером и К. Гатри и опубликованный в 1993 году, этот анализ сочетает в себе простоту работы с простым модельным организмом и простое считывание жизнеспособности клеток3. Жизнеспособность коррелирует с тем, насколько хорошо сплайсеосомы в этих клетках могут распознавать и сращивать репортерную расшифровку.

Этот анализ роста меди чаще называют анализом ACT1-CUP1. Название ACT1-CUP1 происходит от двух генов, слитых для создания репортера эффективности сплайсинга. ACT1 – это ген актина дрожжей, который высоко экспрессируется и имеет эффективно сращенный интрон 4,5. Cup1p – это медный хелатор, который изолирует медь в клетке для предотвращения помех регулярным клеточным функциям 6,7,8. Репортер ACT1-CUP1 содержит эти гены в такой последовательности, что CUP1 находится в правильном кадре считывания только в том случае, если происходит сращивание интрона ACT1 до мРНК (рисунок 1). Полученный в результате синтез белка содержит первые 21 аминокислоту актина и полноразмерный белок Cup1p, который повышает жизнеспособность дрожжей в богатой медью среде3. Таким образом, увеличение количества сращивания репортера приводит к более высокой концентрации Cup1p и более высокому сопротивлению меди (рисунок 1). По сравнению с другими генами-репортерами, CUP1 влияет на жизнеспособность клеток даже на низких уровнях, имеет широкий диапазон чувствительности и может быть использован для непосредственного выбора для сплайсинга мутаций 3,6,7. Кроме того, CUP1 не является необходимым для роста стандартных дрожжей, и, таким образом, клеточный гомеостаз не влияет во время установки для этого анализа. В дополнение к анализам делеции или температурного роста, ACT1-CUP1 предоставляет информацию о влиянии на сращивание в оптимальных условиях роста дрожжей.

Сплайсеосома распознает свой субстрат через три интронные последовательности, а именно 5′ сращивание (5′ SS), ответвление (BS) и 3′ место сращивания (3′ SS). На этих сайтах были созданы многочисленные репортеры ACT1-CUP1, содержащие неконсенсусные последовательности. Выбор наиболее распространенных репортеров ACT1-CUP1 показан на рисунке 1 и в таблице 1. Поскольку сплайсеосома взаимодействует с каждым местом сращивания уникально в разных точках цикла сплайсинга, надежность сплайсеосомы может быть проверена на разных этапах, на основе которых используется неконсенсусный репортер. Неконсенсусные репортеры названы в честь мутировавшей позиции внутри интрона и базы, на которую она была мутирована. Например, A3c является репортером с мутацией в 5′ SS, в частности позицией 3 от консенсусного аденозина к цитозину. Этот репортер будет сильно взаимодействовать со сплайсеосомными мутациями, которые влияют на выбор и использование 5′ SS. В своем первоначальном исследовании Лессер и Гатри определили, какие мутации 5′ SS ингибируют сплайсинг3. Позже в том же году неконсенсусные репортеры на всех трех сайтах сращивания были опубликованы Берджессом и Гатри в супрессорном скрининге мутаций в ATPase Prp16p9. Сравнивая консенсус с неконсенсусными репортерами, анализ ACT1-CUP1 был важным ключом к пониманию надежности и селективности дрожжевой сплайсеосомы и к выводу о функции сплайсеос других эукариот.

Поскольку неконсенсусные репортеры ACT1-CUP1 сенсибилизируют сплайсеосому к дальнейшему возмущению, влияние мутации одного фактора сплайсинга может быть охарактеризовано через репортеров, на которых она положительно или отрицательно влияет. Это было применено к сращиванию исследовательских вопросов различными способами. Во-первых, анализ ACT1-CUP1 может и использовался в качестве генетического скрининга мутаций в факторах сплайсинга. Например, Prp8p, самый большой сплайсинговый белок, служит платформой, на которой ядро РНК сплайсеосомы катализирует реакцию сплайсинга. Это было выведено, в частности, из того, как мутанты Prp8p улучшили или уменьшили сплайсинг различных репортеров ACT1-CUP1 10,11,12,13,14,15,16,17. Другие белковые компоненты сплайсеосомы также были исследованы с использованием ACT1-CUP1, включая Hsh155p, Cwc2p, Cef1p и Ecm2p 18,19,20,21,22,23,24,25. Энергетические пороги для Prp16p и четырех других АТФаз, участвующих в сплайсеосомальном переходе, также были изучены с помощью этого анализа 9,26,27,28,29,30. Малые ядерные РНК (snRNAs) также были широко изучены с использованием ACT1-CUP1 для идентификации последовательностей пре-мРНК, которые они координируют, и изменений во вторичной структуре, которые snRNAs претерпевают во время сплайсинга 3,31,32,33,34,35,36,37.

Анализ ACT1-CUP1 требует штамма дрожжей, где все копии гена CUP1 были выбиты. Поскольку CUP1 может иметь высокий номер копии 6,38, подготовка полного нокаутирующего штамма может потребовать нескольких раундов или обширного скрининга. В результате штаммы дрожжей cup1Δ часто распределялись между лабораториями, как и репортеры.

Если мутации в факторе сплайсинга оцениваются из плазмидной копии, ген дикого типа для этого фактора должен быть выбит. Кроме того, дрожжевой фон должен позволять выбирать по меньшей мере две плазмиды, одна из которых содержит репортер ACT1-CUP1, исторически на плазмиде для отбора лейкодина питательных веществ, а другая содержит мутацию или возмущение в сплайсинговом механизме, который будет изучен (рисунок 2). Обычно в одном анализе несколько штаммов дрожжей, каждый из которых несет возмущение сплайсинга запроса (QSP) и другого репортера, проверяют влияние запроса на сплайсинг.

Независимые переменные в анализе ACT1-CUP1 позволяют исследователю оценить тяжесть QSP. Этими независимыми переменными являются концентрация меди и выбор нескольких неконсенсусных сращивающих репортеров. Во-первых, поскольку штаммы дрожжей выращиваются на пластинах, содержащих диапазон концентраций меди (рисунок 2), настройка анализа включает выбор градиента используемых концентраций. Исследования могут использовать градиент концентрации меди курса, чтобы получить начальное считывание жизнеспособности, а затем повторить анализ с более тонким градиентом, чтобы определить тонкие различия в жизнеспособности. Второй переменной является широкий диапазон репортеров ACT1-CUP1, которые можно протестировать (рисунок 1 и таблица 1). Если QSP влияет на жизнеспособность дрожжей по-разному в присутствии неконсенсусного репортера по сравнению с диким типом, можно сделать вывод, что QSP влияет на шаг в сплайсинге или область сплайсеосомы, важную во время распознавания или обработки этой области интрона.

Набор инструментов для дрожжей обширен, и анализ ACT1-CUP1 является неотъемлемой частью исследований сращивания. Анализ ACT1-CUP1 часто выполняется вместе с более глубоким генетическим, структурным и / или биохимическим анализом воздействия QSP. Поскольку эти более подробные исследования, как правило, имеют более длительную процедуру и / или более высокую цену, частым подходом является скрининг интересных мутантов с ACT1-CUP1 в первую очередь.

Здесь представлен протокол анализа ACT1-CUP1, включая подготовку медной пластины. Этот анализ дает исследователям первоначальный ответ на влияние QSP на сплайсинг и на какие интронные области больше всего влияет возмущение.

Protocol

1. Конструкция штамма дрожжей Генерировать или получать штамм S. cerevisiae , фон которого включает leu2 и cup1Δ. Чтобы создать этот фон, используйте хорошо зарекомендовавший себя дрожжевой метод, в котором используется ацетат лития и одноцепочечная ДНК39…

Representative Results

Анализы роста, такие как ACT1-CUP1, требуют визуальной, сравнительной оценки нескольких колоний. Здесь каждый штамм выращивали до насыщения в течение ночи, разбавляли до OD600 0,5 и покрывали на 20 пластинах, содержащих диапазон концентраций меди от 0 мМ до 1,1 мМ CuSO4 (рисунок…

Discussion

ACT1-CUP1 является анализом роста, и необходимо позаботиться о том, чтобы наблюдаемые различия в росте можно было отнести только к дефектам сращивания. Все штаммы должны обрабатываться аналогичным образом перед нанесением покрытия, в том числе иметь одинаковую длину и тип роста и условий х…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Спасибо Аарону Хоскинсу и членам лаборатории Хоскинса в Университете Висконсин-Мэдисон за использование штаммов дрожжей и оборудования в генерации фигур 3-5. Спасибо Харприту Кауру и Синъян Фу за их проницательные комментарии к рукописи. Спасибо поддерживающим студентам, сотрудникам и преподавателям Северо-Западного университета во время написания, редактирования и съемок этой статьи. Спасибо Изабель Марасиган за помощь в съемках этого метода.

Materials

1.5 mL sterile microcentrifuge tubes Fisher Scientific 05-408-129 Or comparable item from a different manufacturer.
2 mL sterile microcentrifuge tubes Fisher Scientific 05-408-138 Or comparable item from a different manufacturer.
50 mL sterile centrifuge tubes Fisher Scientific 07-201-332 Or comparable item from a different manufacturer.
96-well round bottom microplate Fisher Scientific 07-200-760 Or comparable item from a different manufacturer.
190 proof ethanol Fisher Scientific 22-032-600 Or comparable item from a different manufacturer.
500 mL Filter System (0.22 µm) CellTreat Scientific Products 229707 Or comparable item from a different manufacturer.
Agar Fisher Scientific BP1423-500 Any molecular grade agar will work.
Autoclave Tuttnauer 3870EA Or comparable item from a different manufacturer.
Bunsen burner Humboldt PN6200.1 Or comparable item from a different manufacturer.
Cell Density Meter VWR 490005-906 Or other spectral device that can measure absorbance at 595 nm.
Copper sulfate Pentahydrate Fisher Scientific LC134051 Or comparable item from a different manufacturer.
Digital imaging system Cytiva 29399481 ImageQuant 4000 (used for Figure 3),  Amersham ImageQuant 800, or comparable item from a different manufacturer.
Dropout mix (-Leu) USBiological Life Sciences D9525 Use the appropriate drop out mix for your experiment. It is possible you will be using a yeast nutrient marker for your query perturbation also. In that case, the drop out mix should be for that marker and Leu
D-Glucose Fisher Scientific AAA1682836 Or comparable item from a different manufacturer.
Gel band quantifying software Cytiva 29-0006-05 ImageQuant TL v8.1 (used for figure 5A) or comparable item from a different manufacturer.
Hand held camera Nikon D3500 Or comparable item from a different manufacturer.
Near infra-red gel imaging device Cytiva 29238583 Amersham Typhoon NIR (used for Figure 5a) or comparable item from a different manufacturer.
Laboratory grade clamp Fisher Scientific 05-769-7Q Or comparable item from a different manufacturer.
Laboratory grade stand and clamp Fisher Scientific 12-000-101 Or comparable item from a different manufacturer.
Magnetic stir bars Fisher Scientific 14-513-51 Or comparable item from a different manufacturer.
Pin replicator VP Scientific VP 407AH
Semi-micro disposable cuvettes VWR 97000-590 Or comparable item from a different manufacturer.
Shaker JEIO Tech IST-3075 Or comparable item from a different manufacturer.
Spectrophotometer Biowave 80-3000-45 Or any spectophotometer that can measure the absorbance at 600 nm.
Square plates VWR 102091-156 Circular plates may also be used though are more challenging if using a pin replicator.
Stir plate Fisher Scientific 11-520-16S Or comparable item from a different manufacturer.
Yeast nitrogen base USBiological Life Sciences Y2025 Or comparable item from a different manufacturer.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wahl, M. C., Will, C. L., Luhrmann, R. The spliceosome: Design principles of a dynamic RNP machine. Cell. 136 (4), 701-718 (2009).
  2. Wilkinson, M. E., Charenton, C., Nagai, K. RNA splicing by the spliceosome. Annual Review of Biochemistry. 89, 359-388 (2020).
  3. Lesser, C. F., Guthrie, C. Mutational analysis of pre-mRNA splicing in Saccharomyces cerevisiae using a sensitive new reporter gene, CUP1. Genetics. 133 (4), 851-863 (1993).
  4. Ng, R., Abelson, J. Isolation and sequence of the gene for actin in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (7), 3912-3916 (1980).
  5. Gallwitz, D., Sures, I. Structure of a split yeast gene: Complete nucleotide sequence of the actin gene in I. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (5), 2546-2550 (1980).
  6. Fogel, S., Welch, J. W., Cathala, G., Karin, M. Gene amplification in yeast: CUP1 copy number regulates copper resistance. Current Genetics. 7 (5), 347-355 (1983).
  7. Hamer, D. H., Thiele, D. J., Lemontt, J. E. Function and autoregulation of yeast copperthionein. Science. 228 (4700), 685-690 (1985).
  8. Winge, D. R., Nielson, K. B., Gray, W. R., Hamer, D. H. Yeast metallothionein. Sequence and metal-binding properties. Journal of Biological Chemistry. 260 (27), 14464-14470 (1985).
  9. Burgess, S. M., Guthrie, C. A mechanism to enhance mRNA splicing fidelity: The RNA-dependent ATPase Prp16 governs usage of a discard pathway for aberrant lariat intermediates. Cell. 73 (7), 1377-1391 (1993).
  10. Collins, C. A., Guthrie, C. Allele-specific genetic interactions between Prp8 and RNA active site residues suggest a function for Prp8 at the catalytic core of the spliceosome. Genes & Development. 13 (15), 1970-1982 (1999).
  11. Siatecka, M., Reyes, J. L., Konarska, M. M. Functional interactions of Prp8 with both splice sites at the spliceosomal catalytic center. Genes & Development. 13 (15), 1983-1993 (1999).
  12. Umen, J. G., Guthrie, C. Mutagenesis of the yeast gene PRP8 reveals domains governing the specificity and fidelity of 3′ splice site selection. Genetics. 143 (2), 723-739 (1996).
  13. Grainger, R. J., Beggs, J. D. Prp8 protein: At the heart of the spliceosome. RNA. 11 (5), 533-557 (2005).
  14. Query, C. C., Konarska, M. M. Suppression of multiple substrate mutations by spliceosomal prp8 alleles suggests functional correlations with ribosomal ambiguity mutants. Molecular Cell. 14 (3), 343-354 (2004).
  15. Konarska, M. M., Vilardell, J., Query, C. C. Repositioning of the reaction intermediate within the catalytic center of the spliceosome. Molecular Cell. 21 (4), 543-553 (2006).
  16. Liu, L., Query, C. C., Konarska, M. M. Opposing classes of prp8 alleles modulate the transition between the catalytic steps of pre-mRNA splicing. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (6), 519-526 (2007).
  17. MacRae, A. J., et al. Prp8 positioning of U5 snRNA is linked to 5′ splice site recognition. RNA. 24 (6), 769-777 (2018).
  18. Query, C. C., Konarska, M. M. CEF1/CDC5 alleles modulate transitions between catalytic conformations of the spliceosome. RNA. 18 (5), 1001-1013 (2012).
  19. Tang, Q., et al. SF3B1/Hsh155 HEAT motif mutations affect interaction with the spliceosomal ATPase Prp5, resulting in altered branch site selectivity in pre-mRNA splicing. Genes & Development. 30 (24), 2710-2723 (2016).
  20. Carrocci, T. J., Zoerner, D. M., Paulson, J. C., Hoskins, A. A. SF3b1 mutations associated with myelodysplastic syndromes alter the fidelity of branchsite selection in yeast. Nucleic Acids Research. 45 (8), 4837-4852 (2017).
  21. Kaur, H., Groubert, B., Paulson, J. C., McMillan, S., Hoskins, A. A. Impact of cancer-associated mutations in Hsh155/SF3b1 HEAT repeats 9-12 on pre-mRNA splicing in Saccharomyces cerevisiae. PLoS One. 15 (4), 0229315 (2020).
  22. vander Feltz, C., et al. Saccharomyces cerevisiae Ecm2 modulates the catalytic steps of pre-mRNA splicing. RNA. 27 (5), 591-603 (2021).
  23. Carrocci, T. J., Paulson, J. C., Hoskins, A. A. Functional analysis of Hsh155/SF3b1 interactions with the U2 snRNA/branch site duplex. RNA. 24 (8), 1028-1040 (2018).
  24. Hogg, R., de Almeida, R. A., Ruckshanthi, J. P., O’Keefe, R. T. Remodeling of U2-U6 snRNA helix I during pre-mRNA splicing by Prp16 and the NineTeen Complex protein Cwc2. Nucleic Acids Research. 42 (12), 8008-8023 (2014).
  25. Hansen, S. R., Nikolai, B. J., Spreacker, P. J., Carrocci, T. J., Hoskins, A. A. Chemical inhibition of pre-mRNA splicing in living Saccharomyces cerevisiae. Cell Chemical Biology. 26 (3), 443-448 (2019).
  26. Xu, Y. Z., Query, C. C. Competition between the ATPase Prp5 and branch region-U2 snRNA pairing modulates the fidelity of spliceosome assembly. Molecular Cell. 28 (5), 838-849 (2007).
  27. Staley, J. P., Guthrie, C. An RNA switch at the 5′ splice site requires ATP and the DEAD box protein Prp28p. Molecular Cell. 3 (1), 55-64 (1999).
  28. Bousquet-Antonelli, C., Presutti, C., Tollervey, D. Identification of a regulated pathway for nuclear pre-mRNA turnover. Cell. 102 (6), 765-775 (2000).
  29. Villa, T., Guthrie, C. The Isy1p component of the NineTeen complex interacts with the ATPase Prp16p to regulate the fidelity of pre-mRNA splicing. Genes & Development. 19 (16), 1894-1904 (2005).
  30. Mayas, R. M., Maita, H., Staley, J. P. Exon ligation is proofread by the DExD/H-box ATPase Prp22p. Nature Structure and Molecular Biology. 13 (6), 482-490 (2006).
  31. Lesser, C. F., Guthrie, C. Mutations in U6 snRNA that alter splice site specificity: Implications for the active site. Science. 262 (5142), 1982-1988 (1993).
  32. McPheeters, D. S. Interactions of the yeast U6 RNA with the pre-mRNA branch site. RNA. 2 (11), 1110-1123 (1996).
  33. Perriman, R. J., Ares, M. Rearrangement of competing U2 RNA helices within the spliceosome promotes multiple steps in splicing. Genes & Development. 21 (7), 811-820 (2007).
  34. Mefford, M. A., Staley, J. P. Evidence that U2/U6 helix I promotes both catalytic steps of pre-mRNA splicing and rearranges in between these steps. RNA. 15 (7), 1386-1397 (2009).
  35. Hilliker, A. K., Mefford, M. A., Staley, J. P. U2 toggles iteratively between the stem IIa and stem IIc conformations to promote pre-mRNA splicing. Genes & Development. 21 (7), 821-834 (2007).
  36. Wu, G., et al. Pseudouridines in U2 snRNA stimulate the ATPase activity of Prp5 during spliceosome assembly. EMBO Journal. 35 (6), 654-667 (2016).
  37. Crotti, L. B., Bacikova, D., Horowitz, D. S. The Prp18 protein stabilizes the interaction of both exons with the U5 snRNA during the second step of pre-mRNA splicing. Genes & Development. 21 (10), 1204-1216 (2007).
  38. Fogel, S., Welch, J. W. Tandem gene amplification mediates copper resistance in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (17), 5342-5346 (1982).
  39. Gardner, J. M., Jaspersen, S. L. Manipulating the yeast genome: Deletion, mutation, and tagging by PCR. Methods Molecular Biology. 1205, 45-78 (2014).
  40. JoVE. Yeast Transformation and Cloning. In Biology I: yeast, Drosophila and C. Elegant. JoVE Science Education Database. , (2021).
  41. Gietz, R. D., Woods, R. A. Yeast transformation by the LiAc/SS Carrier DNA/PEG method. Methods Molecular Biology. 313, 107-120 (2006).
  42. Gietz, R. D., Woods, R. A. Genetic transformation of yeast. Biotechniques. 30 (4), 816 (2001).
  43. Mayerle, M., et al. Structural toggle in the RNaseH domain of Prp8 helps balance splicing fidelity and catalytic efficiency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), 4739-4744 (2017).
  44. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  45. Beier, D. H., et al. Dynamics of the DEAD-box ATPase Prp5 RecA-like domains provide a conformational switch during spliceosome assembly. Nucleic Acids Research. 47 (20), 10842-10851 (2019).
  46. vander Feltz, C., DeHaven, A. C., Hoskins, A. A. Stress-induced pseudouridylation alters the structural equilibrium of yeast U2 snRNA Stem II. Journal of Molecular Biology. 430 (4), 524-536 (2018).
  47. Rodgers, M. L., Didychuk, A. L., Butcher, S. E., Brow, D. A., Hoskins, A. A. A multi-step model for facilitated unwinding of the yeast U4/U6 RNA duplex. Nucleic Acids Research. 44 (22), 10912-10928 (2016).
  48. Stutz, F., Rosbash, M. A functional interaction between Rev and yeast pre-mRNA is related to splicing complex formation. EMBO Journal. 13 (17), 4096-4104 (1994).
  49. Libri, D., Lescure, A., Rosbash, M. Splicing enhancement in the yeast rp51b intron. RNA. 6 (3), 352-368 (2000).
  50. Libri, D., Stutz, F., McCarthy, T., Rosbash, M. RNA structural patterns and splicing: Molecular basis for an RNA-based enhancer. RNA. 1 (4), 425-436 (1995).
  51. Howe, K. J., Kane, C. M., Ares, M. Perturbation of transcription elongation influences the fidelity of internal exon inclusion in Saccharomyces cerevisiae. RNA. 9 (8), 993-1006 (2003).
  52. Cuenca-Bono, B., et al. SUS1 introns are required for efficient mRNA nuclear export in yeast. Nucleic Acids Research. 39 (19), 8599-8611 (2011).
  53. Scherrer, F. W., Spingola, M. A subset of Mer1p-dependent introns requires Bud13p for splicing activation and nuclear retention. RNA. 12 (7), 1361-1372 (2006).
  54. Hálová, M., et al. Nineteen complex-related factor Prp45 is required for the early stages of cotranscriptional spliceosome assembly. RNA. 23 (10), 1512-1524 (2017).
  55. Umen, J. G., Guthrie, C. A novel role for a U5 snRNP protein in 3′ splice site selection. Genes & Development. 9 (7), 855-868 (1995).
  56. Crotti, L. B., Horowitz, D. S. Exon sequences at the splice junctions affect splicing fidelity and alternative splicing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (45), 18954-18959 (2009).
  57. Perriman, R., Ares, M. Invariant U2 snRNA nucleotides form a stem loop to recognize the intron early in splicing. Molecular Cell. 38 (3), 416-427 (2010).

Tags

ACT1-CUP1 AssayPre-messenger RNA SplicingSplicing Factor MutationGrowth PhenotypeLeucine Dropout Growth MediaCopper SulfateOptical DensitySpectrophotometerDilutionBunsen BurnerReplicator
check_url/63232?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
van der Feltz, C. ACT1-CUP1 Assays Determine the Substrate-Specific Sensitivities of Spliceosomal Mutants in Budding Yeast. J. Vis. Exp. (184), e63232, doi:10.3791/63232 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image