Optimerade benprovtagningsprotokoll för hämtning av forntida DNA från arkeologiska lämningar

Summary

Protokollet presenterar en serie protokoll för bästa praxis för insamling av benpulver från åtta rekommenderade anatomiska provtagningsplatser (specifika platser på ett givet skelettelement) över fem olika skelettelement från medeltida individer (radiokol daterat till en period av ca 1040-1400 CE, kalibrerat 2-sigma-intervall).

Abstract

De metoder som presenteras här syftar till att maximera chanserna för återvinning av mänskligt DNA från forntida arkeologiska lämningar samtidigt som man begränsar ingående provmaterial. Detta gjordes genom att rikta in sig på anatomiska provtagningsplatser som tidigare bestämts för att ge de högsta mängderna av gammalt DNA (aDNA) i en jämförande analys av DNA-återhämtning över skelettet. Tidigare forskning har föreslagit att dessa protokoll maximerar chanserna för framgångsrik återhämtning av forntida mänskligt och patogen-DNA från arkeologiska rester. DNA-utbyten bedömdes tidigare av Parker et al. 2020 i en bred undersökning av aDNA-bevarande över flera skelettelement från 11 individer som återhämtats från den medeltida (radiokol daterad till en period av cirka (ca.) 1040-1400 CE, kalibrerad 2-sigma-intervall) kyrkogård vid Krakauer Berg, en övergiven medeltida bosättning nära Peißen Tyskland. Dessa åtta provtagningsfläckar, som spänner över fem skelettelement (pars petrosa, permanenta molarer, bröstkota, distal falanx och talus) gav framgångsrikt högkvalitativt gammalt mänskligt DNA, där avkastningen var betydligt större än det totala genomsnittet för alla element och individer. Avkastningen var tillräcklig för användning i de vanligaste populationsgenetiska analyserna nedströms. Våra resultat stöder den föredragna användningen av dessa anatomiska provtagningsplatser för de flesta studier som involverar analyser av forntida mänskligt DNA från arkeologiska lämningar. Genomförandet av dessa metoder kommer att bidra till att minimera förstörelsen av värdefulla arkeologiska exemplar.

Introduction

Provtagning av forntida mänskliga kvarlevor för DNA-återvinning och analys är i sig destruktiv 1,2,3,4. Proverna i sig är värdefulla exemplar och morfologiskt bevarande bör bevaras där så är möjligt. Som sådan är det absolut nödvändigt att provtagningsmetoderna optimeras för att både undvika onödig förstörelse av oersättligt material och för att maximera sannolikheten för framgång. Nuvarande tekniker för bästa praxis baseras på en liten kohort av studier som är begränsade till antingen rättsmedicinska undersökningar^5,6, studier av forntida exemplar där utvecklingen av optimal provtagning inte är det direkta syftet med studien⁷, eller dedikerade studier som använder antingen icke-mänskliga kvarlevor⁸ eller riktar sig mot ett mycket litet urval av anatomiska provtagningsplatser (används här för att beteckna ett specifikt område av ett skelettelement från vilket benpulver^, för användning i nedströms DNA-analyser, genererades)^9,10. Provtagningsprotokollen som presenteras här optimerades i den första storskaliga systematiska studien av DNA-bevarande över flera skelettelement från flera individer¹¹. Alla prover härrörde från skelettelement som återhämtats från 11 individer som grävts ut från kyrkkyrkogården i den övergivna medeltida bosättningen Krakauer Berg nära Peißen, Sachsen-Anhalt, Tyskland (se tabell 1 för detaljerad provdemografi) och kan som sådan behöva modifieras för användning med prover utanför detta geografiska/tidsmässiga intervall.

Individ	Sex	Beräknad ålder vid dödsfall	14 C-datum (CE, Cal 2-sigma)
KRA001	Manlig	25-35	1058-1219
KRA002	Kvinnlig	20-22	1227-1283
KRA003	Manlig	25	1059-1223
KRA004	Manlig	15	1284-1392
KRA005	Manlig	10-12	1170-1258
KRA006	Kvinnlig	30-40	1218-1266
KRA007	Kvinnlig	25-30	1167-1251
KRA008	Manlig	20	1301-1402
KRA009	Manlig	Okänd	1158-1254
KRA010	Manlig	25	1276-1383
KRA011	Kvinnlig	30-45	1040-1159

Tabell 1: Genetiskt bestämt kön, arkeologiskt bestämd uppskattad ålder vid dödsfall och radiokoldatering (¹⁴C Cal 2-sigma) för alla de 11 individer som provtagits. Denna tabell har anpassats från Parker, C. et al. 2020¹¹.

Dessa protokoll möjliggör en relativt enkel och effektiv generering av benpulver från åtta anatomiska provtagningsplatser över fem skelettelement (inklusive pars petrosa) med begränsad laboratorieinducerad DNA-kontaminering. Av dessa fem skelettelement har sju anatomiska provtagningsplatser som finns på fyra skelettelement fastställts vara livskraftiga alternativ till den destruktiva provtagningen av petrouspyramiden^11,12. Dessa inkluderar cementum-, dentin- och massakammaren i permanenta molarer; kortikala ben som samlats från det överlägsna ryggradsskåran såväl som från kroppen av bröstkotor; kortikalt ben som härrör från den underlägsna ytan av den apikala tuften och axeln hos de distala falangerna; och det täta kortikala benet längs den yttre delen av tali. Även om det finns flera allmänt tillämpade metoder för provtagning av pars petrosa 4,12,13,14, dentin och tandmassakammaren ^1,2,15, publicerade metoder som beskriver den framgångsrika genereringen av benpulver från cementum ¹⁶ , ryggradskropp, sämre ryggradsskåra och talus kan vara svåra att få. Som sådan demonstrerar vi här optimerade provtagningsprotokoll för petrouspyramiden (steg 3.1); cementum (steg 3.2.1), dentin (steg 3.2.2) och tandmassa (steg 3.2.3) hos vuxna kindtänder, Kortikala ben i ryggkroppen (steg 3.3.1) och överlägsen kotbåge (steg 3.3.2). den distala falangen (steg 3.4); och talus (steg 3.5) för att göra effektiv användning av dessa skelettelement för både aDNA och rättsmedicinsk forskning mer tillgänglig.

Protocol

All forskning som presenteras häri utfördes i enlighet med riktlinjerna från Max Planck Institute for the Science of Human History, Jena, Tyskland för att arbeta med gamla mänskliga kvarlevor. Innan du utför några steg i detta protokoll, se till att följa alla lokala / statliga / federala etiska krav som rör både att få tillstånd för den vetenskapliga studien och användningen av mänskliga rester för destruktiv provtagning i ditt område. Alla procedurer/kemikalielagring bör utföras enligt individuella institutionella säkerhetsriktlinjer. 1. Överväganden före provbehandling Behandla prover med försiktighet eftersom fornlämningar är en oåterkallelig och ändlig resurs (t.ex. bör provtagningen vara så minimalt slösaktig som möjligt och alla kvarlevor returneras till sina respektive och lagliga leverantörer om möjligt). Utför alla steg i renrumsmiljö, helst på en dedikerad gammal DNA-anläggning17,18,19. Använd personlig skyddsutrustning (PPE) bestående av sterila mikroporösa överdragskläder med huva, sterila handskar (två par), kirurgisk mask, skyddsglasögon och sterila stövlar eller halkfria skor med sterila lock (se materialförteckning). Byt handskar ofta, särskilt mellan proverna. Rengör och desinficera all utrustning och alla ytor noggrant med blekmedel/DNA-dekontamineringslösning/etanol och UV-bestrålning (våglängd: 254 nm) där så är möjligt (t.ex. borrkronor, borrmaskiner, skruvar/klämmor osv.). Slutligen rekommenderas det starkt att ta regelbundna ergonomiska pauser (var 2-3: e timme om möjligt) för att undvika överutmattning på grund av renrumsmiljön.OBS: Alla skelettdelar bör dokumenteras på lämpligt sätt (t.ex. fotograferas, vägas och om möjligt mikro-CT-skannas, 3D-avbild, etc.) före provtagning (protokoll för lämplig dokumentation omfattas inte av detta manuskript). Alla provtagningsprotokoll kan pausas mellan provtagnings iterationer och proverna kan lagras på obestämd tid i en torr, temperaturkontrollerad (25 °C), steril miljö. 2. Förbehandling Dekontaminera alla anatomiska provtagningsplatser före benpulvergenerering för att minimera risken för kontaminering18.OBS: Effekten av blekmedel och/eller ytborttagning (se OBS i steg 3.3.2 för ytborttagningssteg) för dekontaminering av prover är fortfarande en fråga om debatt bland aDNA-forskare 8,19,20,21,22,23,24,25 eftersom båda kan påverka det totala DNA-utbytet, särskilt i mycket nedbrutna prover. Som sådan anses följande steg vara valfria och ingår här eftersom de användes i alla prover för att generera de representativa resultaten som presenteras i detta dokument. Det rekommenderas att användningen av dessa förbehandlingsprotokoll bestäms från fall till fall baserat på molekylär tillämpning, ålder, sällsynthet och nivå av morfologisk nedbrytning för varje provuppsättning.Utför all provtagning i ett dedikerat renrum under en UV-ljusutrustad polymeraskedjereaktionshuv (PCR) eller biosäkerhetsskåp med luftflödet avstängt. Sprid steril aluminiumfolie över bänkskivan för att fånga upp eventuellt benpulver/fragment. Se till att alla benfragment återvinns (för hemtransport) innan folien kasseras. Byt folien mellan behandlingen av varje skelettelement. Kassera använd folie i en autoklaverbar påse/behållare för biohazard. Ta bort så mycket lös smuts/detritus som möjligt från anatomiska provtagningsplatser genom att försiktigt torka av området med en luddfri torr steril torkduk (se Materialförteckning). Kassera våtservetterna i autoklaverbara påsar eller behållare för biohazard. Dekontaminera den rengjorda ytan genom att torka av med en steril torkduk fuktad med utspädd kommersiell blekmedel (~ 0,01% v / v, utspädd med ultrarent DNase / RNas-fritt vatten) och låt inkubera i 5 minuter. Kassera våtservetterna i autoklaverbara påsar eller behållare för biohazard.VARNING: Blekmedel är en mycket frätande och reaktiv kemikalie; Därför bör lämpliga säkerhetsåtgärder finnas på plats innan den används. Ta bort så mycket kvarvarande blekmedel som möjligt från den anatomiska provtagningsplatsen med en steril våtservett fuktad med ultrarent DNase / RNas-fritt vatten. Kassera våtservetterna i autoklaverbara påsar eller behållare för biohazard. Utsätt alla rengjorda anatomiska provtagningsplatser för UV-strålning i 30 minuter (våglängd: 254 nm) och låt sedan torka helt vid rumstemperatur. Se till att de anatomiska provtagningsplatserna är helt torra innan du fortsätter med provtagningen eller återgår till lagring för att inte bara underlätta benpulvergenerering utan också för att förhindra ytterligare nedbrytning av provet (t.ex. mögel).VARNING: Exponering för UV-strålning kan vara skadligt för ögonen. Flytta omedelbart till provtagning eller förvaring av skelettdelar i en torr, temperaturkontrollerad (25 °C) steril miljö. 3. Generering av benpulver OBS: Följande protokoll är avsedda att användas vid DNA-extraktion enligt Dabney et al. 2019-protokollet26. Provtagning av pars petrosaOBS: Detta protokoll är anpassat från procedurer som beskrivs i Pinhasi et al. 20194 och presenteras här för enkel användning. Detta protokoll representerar inte den nuvarande, minst destruktiva metoden för provtagning av pars petrosa. Som sådan rekommenderas att använda protokollet som beskrivs av Sirak et al. 201713 eller Orfanou et al. 202014 för prover där morfologiskt bevarande är av största vikt.Utför all provtagning i ett dedikerat renrum under en UV-ljusutrustad PCR-huva eller biosäkerhetsskåp (våglängd: 254 nm) med luftflödet avstängt. Sprid steril aluminiumfolie över bänkskivan för att fånga upp eventuellt benpulver/fragment. Se till att alla benfragment och så mycket pulver som möjligt återvinns (för hemtransport) innan du kasserar folie. Byt folie mellan varje provtagning. Kassera den använda folien i en autoklaverbar påse/behållare för biologisk fara. Säkra det torra, dekontaminerade elementet med en steriliserad klämma eller skruvstäd. Skär pars petrosa på mitten längs den överlägsna sulcus petrosus (se figur 1) med en vanlig juvelerarsåg utrustad med ett 0,6 mm blad (se materialtabell) på medelhastighet för att undvika överhettning (se OBS nedan steg 3.1.6).VARNING: Pars petrosa är mycket tät och kan som sådan vara svår att skära. Var noga med att hålla elementet ordentligt fastspänt för att undvika skador. Kassera eventuella trasiga sågblad i lämplig behållare för vassa föremål. Ta bort petrousdelarna från klämman. Återställ och spara löst / överflödigt material. Placera vägpapper i en steril vägningsbåt Håll petrousdelen över vägningspappret, den skurna sidan lutad mot vägningsbrickan. Borra i det täta kortikala benet mellan ansiktskanalen och mastoid antrum (verkar blankare än det omgivande materialet, se figur 1) med hjälp av tandborr utrustad med en liten mätkrona (se materialtabell) och ställ in på medelhastighet, medelhögt vridmoment för att producera benpulver.OBS: Borrning / skärning bör göras i korta skurar vid låga till medelhöga hastigheter för att undvika överhettning av benet och potentiellt förstöra / skada DNA. Anekdotiskt, när den täta delen av petrousen börjar överhettas, kan en lukt som beskrivs som matlagning bacon observeras. Sluta borra/såga omedelbart och låt benet vila tills det är tillräckligt svalt innan det återupptas. Upprepa borrningen tills cirka 50–100 mg pulver har samlats upp i vägningspapperet, mätt med en sluten balans som är minst 0,01 mg (se materialförteckning).OBS: Om möjligt föreslås att samla 100 mg benpulver för att möjliggöra två replikerade DNA-extraktion av 50 mg vardera. Detta kanske dock inte alltid är möjligt baserat på antingen begränsning av själva de anatomiska provtagningsplatserna (t.ex. den distala falanxen, tandmassakammaren) eller behovet av morfologisk bevarande. För andra platser, såsom cement, kan betydligt mindre än 50 mg av materialet vara tillgängligt. Cementum, tandmassakammare och distal falang har emellertid alla visat sig ge signifikant endogent DNA 11,27,28, trots lägre initial tillförsel av benpulver från extraktionsprocessen. Överför pulver från vägningspapperet till ett 2 ml märkt lågbindande, säkert låsrör för extraktion eller förvaring. Förvara proverna vid -20 °C, på obestämd tid. Förvara kvarvarande ben/överflödigt pulver i en torr, temperaturkontrollerad (25 °C) steril miljö tills retur/hemtransport kan slutföras. Kassera allt avfall i autoklaverbara påsar eller behållare för biologisk fara. Sterilisera/sanera all återanvändbar utrustning (t.ex. klämmor, borrkronor, borrar, sågar etc.) med hjälp av blekmedel/DNA-dekontamineringslösning/etanol och UV-exponering (våglängd: 254 nm), beroende på vad som är tillämpligt, mellan varje provtagning. Figur 1: Temporalt ben inklusive pars petrosa. A) Förstyckning av prover som visar var petrouspyramiden och sulcus petrosa finns. (B) Petrous del efterskärning som markerar de täta områden som ska borras. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Provtagning av permanenta kindtänderOBS: För provtagning av permanenta kindtänder, välj i förväg in situ molar med smälta rötter och helst tomrum för karies, sprickor i emaljen eller överdrivet slitage för bästa resultat. Ta bort eventuell tandanalysprovtagning och förvara vid -20 °C för eventuella framtida analyser av det orala mikrobiomet (proceduren behandlas inte här).Provtagning av cementumUtför all provtagning i ett dedikerat renrum under en UV-ljusutrustad PCR-huva eller biosäkerhetsskåp (våglängd: 254 nm) med luftflödet avstängt. Sprid steril aluminiumfolie över bänkskivan för att fånga upp eventuellt benpulver/fragment. Se till att alla benfragment och så mycket pulver som möjligt återvinns (för hemtransport) innan folie kasseras. Byt folie mellan varje provtagning. Kassera använd folie i en autoklaverbar påse/behållare för biohazard. Lägg ett ark vägpapper i en steril vägningsbricka. Håll / säkra den dekontaminerade molaren genom emaljen, rota ner, över en vägningsbricka med en handhållen klämma som en justerbar skiftnyckel (se materialtabell). Utrusta en tandborr med ett diamantkantat cirkulärt skärhjul. Med borren inställd på en inställning för medelvarvtal/vridmoment ska du lätt vidröra borrkronans kant mot roten i en vinkel på cirka -20°. Skrapa nedåt i brickan för att ta bort/samla upp det gula, yttersta materialet från roten (cementum). Stoppa insamlingen när dentinets ljusare (vita) material blir synligt.OBS: Det är viktigt att matcha skärkronans rotationsriktning i förhållande till uppsamlingsbrickan för att undvika att pulvret aerosoliseras och potentiellt slösar bort provet genom att missa brickan helt. Cementum är särskilt rik på DNA; Typiska utbyten av material är dock mycket mindre än andra anatomiska provtagningsplatser (~ 7-20 mg)11,27,28. Registrera massan av pulver som samlats upp i vägpapper med en sluten balans som är korrekt till minst 0,01 mg (se materialförteckningen). Överför pulver från vägpapperet till ett 2 ml lågbindande, säkert låsrör för extraktion. Förvaras vid -20 °C, på obestämd tid. Provtagning av massakammarenEfter att cementum har samlats in (om så önskas), dela molaren längs cemento-emaljkorsningen med hjälp av en juvelerarsåg för att ta bort kronan (se figur 2). Lägg ett nytt ark vägpapper i en ny vägningsbricka. Fäst kronsektionen i en handhållen klämma eller skruvstäd över vägningsbrickan. Håll den skurna sidan lutad nedåt och borra/skrapa material som första pass med en tandborr utrustad med en liten borrkrona (se materialförteckning) längs massakammarens kanter inom krondelen (se figur 2).OBS: Endast det första passet på massakammarens inre ska samlas upp och märkas som massamaterial (5-15 mg typiskt utbyte), allt djupare in i tanden anses vara dentin. Vrid tanden med den sämre delen nedåt, knacka på klämman med en hammare och samla det frigjorda pulvret på vägpapperet. Registrera vikten på pulvret som samlats upp i vägpapperet med en sluten balans som är minst 0,01 mg (se materialförteckning). Överför pulver från vägpapperet till ett 2 ml lågbindande, säkert låsrör för extraktion. Förvaras vid -20 °C, på obestämd tid. Provtagning av dentinetLägg ett nytt ark vägpapper i en ny vägningsbricka. Håll kronsektionen över vägningsbrickan (enligt steg 3.2.2.3), borra ut och samla upp ytterligare 50–100 mg dentin mätt med en sluten våg som är exakt 0,01 mg (se materialförteckning) från massakammarens inre på samma sätt för ytterligare dentinprovtagning (se figur 2). Överför benpulver från vägpapperet till ett 2 ml lågbindet, säkert låsrör för extraktion. Förvaras vid -20 °C, på obestämd tid. Förvara de återstående tandstyckena/överflödigt pulver i en torr, temperaturkontrollerad (25 °C) steril miljö tills retur/hemtransport kan slutföras. Kassera allt avfall i autoklaverbara påsar eller behållare för biologisk fara. Sterilisera/sanera all återanvändbar utrustning (t.ex. klämmor, borrkronor, borrar, sågar etc.) med hjälp av blekmedel/DNA-dekontamineringslösning/etanol och UV-exponering (våglängd: 254 nm), beroende på vad som är tillämpligt, mellan varje provtagning. Figur 2: Permanent molär förprovtagning . (A) Förbehandlad molär före provtagning, som visar krona, cementum (gulaktigt lager av roten) och skärplatsen vid cemento-emaljkorsningen. (B) Samma molära uppsamling efter cementum, som visar skärplatsen vid cemento-emaljkorsningen. C) Molar efterskärning och provtagning som visar anatomiska provtagningsplatser för tandmassakammaren och dentin i kronan. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Provtagning av bröstkotornaProvtagning av ryggkroppenUtför all provtagning i ett dedikerat renrum under en UV-ljusutrustad PCR-huva eller biosäkerhetsskåp (våglängd: 254 nm) med luftflödet avstängt. Sprid steril aluminiumfolie över bänkskivan för att fånga upp eventuellt benpulver/fragment. Se till att alla benfragment och så mycket pulver som möjligt återvinns (för hemtransport) innan folie kasseras. Byt folie mellan varje provtagning. Kassera använd folie i en autoklaverbar påse/behållare för biohazard. Lägg ett litet ark vägpapper i en vanlig vägningsbricka. Säkra ryggkotorna med en klämma eller handskruv, med ryggradskroppen utåt. Håll kotorna över vägningsbrickan med ryggkroppen lutad nedåt. Använd en tandborr utrustad med en liten borrkrona (se materialförteckning) inställd på lågt högt vridmoment, borra längs den yttersta kanten (underlägsen och överlägsen) på det kortikala benet som omger den cancellösa inre vävnaden i ryggradskroppen (se figur 3). Skrapa borrkronan mot det kortikala skiktet över en standardviktningsbricka tills 50-100 mg material har samlats upp, mätt med en sluten balans som är exakt till 0,01 mg (se Materialförteckning). Överför benpulver från vägpapperet till ett 2 ml lågbindande, säkert låsrör för extraktion. Förvaras vid -20 °C, på obestämd tid. Provtagning av den överlägsna kotbågenOBS: Detta steg är valfritt. Ta bort och kassera det yttersta lagret av det kortikala benet i den överlägsna ryggbågen med hjälp av en tandborr utrustad med en liten borrkrona (se materialtabell) genom att skrapa den längs ytan19. Detta föreslås inte för provtagning från ryggradskroppen, eftersom lagret av kortikalt ben i allmänhet är mycket tunt och sannolikt kommer att tömmas helt av denna process (se anmärkning i avsnitt 2).Lägg ett litet ark vägpapper i en vanlig vägningsbricka. Säkra kotorna i en handklämma/skruvstäd med kotprocessen utåt, överlägsen aspekt nedåt. Medan du håller ryggkotorna, överlägsen aspekt nedåt, över en vägningsbricka, borra uppåt i mitten av det V-formade skåran som bildas genom sammansmältningen av den spinösa processen med lamellerna (se figur 3) med hjälp av en tandborr med en liten mätbit (se materialtabell) inställd på låg hastighet och högt vridmoment. Sluta borra när det finns en märkbar minskning av motståndet. Ändra borrpositionen något och upprepa tills 50-100 mg benpulver har samlats in, mätt med en sluten balans med noggrannhet till 0,01 mg (se materialtabell). Överför benpulver från vägpapperet till ett 2 ml lågbindande rör för extraktion. Förvaras vid -20 °C, på obestämd tid. Förvara kvarvarande ben/överflödigt pulver i en torr, temperaturkontrollerad (25 °C) steril miljö tills retur/hemtransport. Kassera allt avfall i autoklaverbara påsar eller behållare för biologisk fara. Sterilisera/sanera all återanvändbar utrustning (t.ex. klämmor, borrkronor, borrar, sågar etc.) med blekmedel/DNA-dekontamineringslösning/etanol och UV-exponering (våglängd: 254 nm), beroende på vad som är tillämpligt, mellan varje provtagning. Figur 3: Ryggradskropp och överlägsen kotbåge kortikala ben anatomiska provtagningsplatser för bröstkotan. Klicka här för att se en större version av denna figur. Provtagning av den distala falangenOBS: Detta steg är valfritt. Ta bort och kassera det yttersta lagret av skaftets kortikala ben och/eller apikala tofs med hjälp av en tandborr utrustad med en liten borrkrona genom att skrapa den längs ytan19. Detta kanske inte är möjligt för prover med alltför tunt kortikalt ben eller juvenila rester (se anmärkning i avsnitt 2).Utför all provtagning i ett dedikerat renrum, under en UV-ljusutrustad PCR-huva eller biosäkerhetsskåp (UV-våglängd: 254 nm) med luftflödet avstängt. Sprid steril aluminiumfolie över bänkskivan för att fånga upp eventuellt benpulver/fragment. Se till att alla benfragment och så mycket pulver som möjligt återvinns (för hemtransport) innan folie kasseras. Byt folie mellan varje provtagning. Kassera använd folie i en autoklaverbar påse/behållare för biohazard. Lägg ett litet ark vägpapper i en vanlig vägningsbricka. Säkra provet i handhållen klämma / skruvstäd, överlägsen sida uppåt. Håll provet över vägningsbrickan, samla benpulver från det kortikala benet från den underlägsna sidan av den apikala tofsen och axeln genom att borra genom de yttersta täta skikten (se figur 4) med hjälp av en tandborr utrustad med en liten borrkrona (se materialförteckning). Sluta borra när det finns en markant minskning av motståndet, eftersom detta betyder lättare, avbrutet material. Upprepa denna process och stråla utåt från den första borrningen tills minst 50-100 mg benpulver har samlats upp, mätt med en sluten balans med en sluten balans som är exakt 0,01 mg (se materialtabell). Överför benpulver från vägpapperet till ett 2 ml lågbindet, säkert låsrör för extraktion. Förvaras vid -20 °C, på obestämd tid. Förvara det återstående benet/överskottspulvret i en torr, temperaturkontrollerad (25 °C) steril miljö tills retur/hemtransport. Kassera allt avfall i autoklaverbara påsar eller behållare för biologisk fara. Sterilisera/sanera all återanvändbar utrustning (t.ex. klämmor, borrkronor, borrar, sågar etc.) med blekmedel/DNA-dekontamineringslösning/etanol och UV-exponering, beroende på vad som är tillämpligt, mellan varje provtagning.OBS: För mindre prover (t.ex. juvenila prover) kan det finnas betydligt mindre än de föreslagna 50-100 mg kortikala ben som finns tillgängliga för prov. Men även i små mängder har denna anatomiska provtagningsplats visat sig vara särskilt rik på DNA11. Figur 4: Distal falang som visar platserna för tätt kortikalt ben längs axeln och underlägsen sida av den apikala tuften. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Provtagning av TalusUtför all provtagning i ett dedikerat renrum under en UV-ljusutrustad PCR-huva eller biosäkerhetsskåp (våglängd: 254 nm) med luftflödet avstängt. Sprid steril aluminiumfolie över bänkskivan för att fånga upp eventuellt benpulver/fragment. Se till att alla benfragment och så mycket pulver som möjligt återvinns (för hemtransport) innan folie kasseras. Byt folie mellan varje provtagning. Kassera använd folie i en autoklaverbar påse/behållare för biohazard. Lägg ett litet ark vägpapper i en vanlig vägningsbricka. Säkra provet i handhållen klämma/skruvstäd, kupol uppåt. Håll talus, kupolen uppåt och den mediala ytan mot kollektorn, över vägningsbrickan. Skrapa kortikalt ben från talushalsen till ett djup av ~ 1 mm (se figur 5) med en tandborr med en låg mätkrona (se materialtabell) inställd på låg hastighet och högt vridmoment. Ändra borrpositionen något och upprepa tills cirka 50-100 mg benpulver har samlats upp, mätt med en sluten balans med en sluten balans med noggrannhet till 0,01 mg (se materialtabell). Överför benpulver från vägpapperet till ett 2 ml lågbindande rör för extraktion. Förvaras vid -20 °C, på obestämd tid. Förvara det återstående benet/överskottspulvret i en torr, temperaturkontrollerad (25 °C) steril miljö tills retur/hemtransport kan slutföras. Kassera allt avfall i autoklaverbara påsar eller behållare för biologisk fara. Sterilisera/sanera all återanvändbar utrustning (t.ex. klämmor, borrkronor, borrar, sågar etc.) med hjälp av blekmedel/DNA-dekontamineringslösning/etanol och UV-exponering (våglängd: 254 nm), beroende på vad som är tillämpligt, mellan varje provtagning. Figur 5: Provtagningsområde för talus för kortikal benåtervinning. Klicka här för att se en större version av denna siffra. OBS: Talus har väldigt lite kortikalt ben (ett tunt yttre lager). Materialet ska inte bara samlas upp från ytan utan också det underliggande täta lagret av cancellöst ben.

Representative Results

I en separat studie 11 extraherades DNA från benpulver genererat från varje anatomisk provtagningsplats hos11 individer, med hjälp av ett standard-DNA-extraktionsprotokoll optimerat för korta fragment från förkalkad vävnad2. Enkelsträngade bibliotek producerades sedan 28 och sekvenserades på en HiSeq 4000 (75 bp parkopplad ände) till ett djup av ~20 000 000 läsningar per prov. De resulterande sekvensdata utvärderades sedan för endogent humant DNA-innehåll med hjälp av EAGER pipeline29 (BWA-inställningar: Frölängd på 32, 0,1 felaktig matchningsstraff, kartläggningskvalitetsfilter på 37). Alla representativa resultat rapporteras med samma mätvärden som Parker et al. 202011 för konsekvens. Bibliotek från de pulveriserade delarna av pars petrosa gav i genomsnitt högre endogent DNA än någon av de andra 23 undersökta anatomiska provtagningsplatserna (figur 6A-B). De sju ytterligare anatomiska provtagningsplatserna som presenteras i detta protokoll (cementum, första passet av tandmassakammaren och dentin av permanenta molarer; kortikalt ben från ryggradskroppen och överlägsen ryggradsbåge i bröstkotan; kortikalt ben från den distala falanxens apikala tuft; och kortikalt ben från talushalsen) gav de näst högsta utbytena (utan statistisk signifikans mellan dessa anatomiska provtagningsplatser; Figur 6A-B; Kompletterande fil 1: EndogenousDNAPreCap). Dessa alternativa platser producerade alla konsekvent DNA-utbyten som är tillräckliga för standardpopulationsgenetiska analyser såsom mitokondriella analyser och SNP-analyser (single nucleotide polymorphism). Dupliceringsfrekvensen i bibliotek som härrör från alla anatomiska provtagningsplatser var låg (klusterfaktorer < i genomsnitt 1,2, beräknat som förhållandet mellan alla mappningsläsningar och unika mappningsläsningar, tabell 2; Kompletterande fil 1: ClusterFactor), vilket indikerar att alla bibliotek som screenades var mycket komplexa. På samma sätt var genomsnittliga exogena uppskattningar av mänsklig DNA-kontaminering låga, i genomsnitt < 2% (X-kromosomkontaminering hos män, n = 7, som rapporterats av ANGSD30-rörledningen) på alla anatomiska provtagningsplatser utom den överlägsna ryggradsbågen (genomsnittlig uppskattad kontaminering: 2,11%, med ett prov avlägsnat som en outlier; KRA005: 19,52 %, se tabell 2; Kompletterande fil 1: Xcontamination). Den genomsnittliga fragmentlängden (efter filtrering för att avlägsna alla läsningar < 30 bp) var lägst i materialet som samlats in från tandmassakammaren och dentinet, utan någon signifikant variation mellan andra anatomiska provtagningsplatser (55,14 bp respektive 60,22 bp jämfört med en genomsnittlig median på 62,87, parvisa p-värden < 0,019, tabell 2; Kompletterande fil 1: AvgFragLength). Dessutom innehåller tänderna och bröstkotorna var och en flera anatomiska provtagningsplatser där hög endogen DNA-återhämtning observerades, vilket gör dem särskilt lämpliga som alternativ till pars petrosa. Figur 6: Mänskligt DNA-innehåll för alla screenade prover. Svarta linjer representerar det totala medelvärdet, medan röda linjer representerar medianen (heldragen: mänsklig DNA-andel, streckad: mappade mänskliga läsningar per miljon genererade läsningar). Enskilda anatomiska provtagningsplatser med en genomsnittlig mänsklig DNA-andel högre än det totala medelvärdet (8,16%) färgas i alla analyser. (A) Andelen läsningar som mappar till hg19-referensgenomet. Den blå streckade linjen representerar det teoretiska maximumet givet rörledningens kartläggningsparametrar (genereras med Gargammel31 för att simulera en slumpmässig fördelning på 5 000 000 läsningar från hg19-referensgenomet med simulerad skada). Individuella medelvärden (svart X) och medianer (röd cirkel) rapporteras för de prover med en högre genomsnittlig mänsklig DNA-andel än det totala medelvärdet. Konfidensintervall anger övre och nedre gränser exklusive statistiska extremvärden. (B) Antalet unika läsningar som mappas till hg19-referensgenomet per miljon läsningar av sekvenseringsansträngning (75 bp parad ände). Konfidensintervall anger övre och nedre gränser exklusive statistiska extremvärden. Denna siffra har anpassats från Parker, C. et al. 202011. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Tabell 2: Genomsnittliga dupliceringsnivåer (kartläggning av läsningar/unika läsningar), genomsnittliga fragmentlängder och medianfragmentlängder och X-kromosomkontamineringsuppskattningar för alla anatomiska provtagningsplatser. Fel som rapporterats som medelvärdets standardfel. Denna tabell har anpassats från Parker, C. et al. 202011. Provtagningsplats Genomsnittlig dupliceringsfaktor (# mappade läsningar /# unika mappade läsningar) Genomsnittlig fragmentlängd i bp Genomsnittlig uppskattad andel X-kromosomkontaminering Petrous pyramid 1.188 ± 0.006 65.40 ± 1.36 0,000 ± 0,003 Cementum 1.197 ± 0.028 67,28 ± 1,76 0,011 ± 0,003 Dentin 1.188 ± 0.061 60.22 ± 2.37 0,002 ± 0,007 Fruktkött 1.179 ± 0.024 55.14 ± 2.90 0,013 ± 0,006 Distal falang 1.191 ± 0,049 65,95 ± 1,08 0,013 ± 0,005 Ryggradskropp 1.194 ± 0.037 66.14 ± 1.03 0,008 ± 0,003 Överlägsen ryggradsbåge 1.19 ± 0,017 63.02 ± 1.23 0,021 ± 0,009* Talus 1.198 ± 0.010 68.20 ± 1.24 0,011 ± 0,003 *Prov KRA005 borttaget som avvikande värde vid 0,1952 Kod tillgänglighetAlla analysprogram och R-moduler som används i analyserna av detta manuskript är fritt tillgängliga från sina respektive författare. All anpassad R-kod är tillgänglig på begäran. Tillgänglighet för dataAlla rådata som används vid beräkningen av representativa resultat är fritt tillgängliga i ENA:s dataarkiv European Nucleotide Archive (anslutningsnummer PRJ-EB36983) eller kompletterande material från Parker, C. et al.11. Kompletterande fil 1. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Discussion

Nuvarande praxis inom forntida mänsklig populationsgenetik är att företrädesvis ta prov från pars petrosa (steg 2.1) när det är möjligt. Pars petrosa kan dock vara ett svårt prov att få, eftersom det är högt värderat för en myriad av skelettbedömningar (t.ex. befolkningshistoria³², uppskattning av fostrets ålder vid död 33 och könsbestämning³⁴), och historiskt sett kan provtagning av pars petrosa för DNA-analys vara mycket destruktiv ^3,4 (inklusive protokollet som presenteras här^, även om nya, minimalt invasiva protokoll ^13,14 nu har antagits i stor utsträckning för att lindra denna oro). Detta förvärras av det faktum att man fram till helt nyligen inte hade försökt göra en storskalig, systematisk studie av mänsklig DNA-återhämtning över skelettet¹¹, vilket gör det svårt att hitta en lämplig provtagningsstrategi när petrouspyramiden inte är tillgänglig.

Protokollen som presenteras här hjälper till att lindra den utmaningen genom att tillhandahålla en uppsättning optimerade procedurer för DNA-provtagning från arkeologiska/kriminaltekniska skelettrester inklusive pars petrosa samt sju alternativa anatomiska provtagningsplatser över ytterligare fyra skelettelement. De kritiska steg som ingår är alla avsedda att minimera risken för DNA-förlust/-skador på grund av antingen ineffektiv provtagning (steg 2.1.6 och 3.2.1.3) eller överhettning av prover under borrning/skärning (steg 3.1.6). Dessutom har det noterats i hela protokollet att det kan vara nödvändigt att ändra / utelämna förbehandlingsstegen för att säkerställa bästa prestanda i mycket nedbrutna prover. Det bör också noteras att även bland de utvalda elementen som presenteras här finns det fortfarande flera möjliga alternativa provtagningstekniker (särskilt för pars petrosa^13,14), liksom gott om utrymme för ytterligare optimering av de underutnyttjade anatomiska provtagningsplatserna som presenteras här (dvs. talus: steg 2.5 och ryggkotorna: steg 2.3).

Det är också viktigt att komma ihåg att dessa protokoll har utformats och testats med gamla juvenila vuxna rester av hög kvalitet (bra morfologiskt bevarande) för endogena mänskliga DNA-analyser. De resultat som presenteras kanske inte sträcker sig till mer högupplösta material, andra bevarandesammanhang, spädbarnsrester, icke-mänskliga kvarlevor eller studier av patogener eller mikrobiomet, eftersom en större utforskning av användningen av dessa protokoll i ytterligare sammanhang fortfarande behövs. Dessutom kan de alternativa skelettelementen som presenteras här (tänderna, ryggkotorna, distala falanxen och tali) vara utmanande att tilldela en enda individ bland blandade rester, vilket kräver provtagning från flera element för att säkerställa ett enda ursprung. Trots dessa begränsningar kan att göra dessa protokoll allmänt tillgängliga hjälpa till att lindra en del av heterogeniteten kring provval och bearbetning genom att tillhandahålla ett generaliserat och kvantitativt optimerat ramverk för användning i ett brett spektrum av framtida aDNA / kriminaltekniska studier på mänskliga rester.

Materials

#16 Dental Drill Bit	NTI	H1-016-HP	example drilling bit
0.6 mm scroll saw blade	Fisher Scientific	50-949-097	blade for Jewellers Saw
22mm diamond cutting wheel	Kahla	SKU 806 104 358 514 220	Dremel cutting attachment
Commercial Bleach	Fisher Scientific	NC1818018
Control Company Ultra-Clean Supreme Aluminum Foil	Fisher Scientific	15-078-29X
DNA LoBind Tubes (2 mL)	Eppendorf	22431048
Dremel 225-01 Flex Shaft Attachment	Dremel	225-01	Dremel flexible extension
Dremel 4300 Rotary Tool	Dremel	4300	Example drill
Dremel collet and nut kit	Dremel	4485	Adapters for various Dremel tool attachments/bits
Eagle 33 Gallon Red Biohazard Waste Bag	Fisher Scientific	17-988-501
Eppendorf DNA LoBind 2 mL microcentrifuge tube	Fisher Scientific	13-698-792
Ethanol (Molecular Biology Grade)	Millipore Sigma	1.08543
FDA approved level 2 Surgical Mask	Fisher Scientific	50-206-0397	PPE
Fisherbrand Comfort Nitrile Gloves	Fisher Scientific	19-041-171X	PPE
Fisherbrand Safety Glasses	Fisher Scientific	19-130-208X	PPE
Granger Stationary Vise	Fisher Scientific	NC1336173	benchtop vise
Invitrogen UltraPure DNase/Rnase free distilled water	Fisher Scientific	10-977-023
Jewellers Saw	Fisher Scientific	50-949-231
Kimwipes	Sigma-Aldritch	Z188956
Labconco Purifier Logic Biosafety cabinet	Fisher Scientific	30-368-1101
LookOut DNA Erase	Millipore Sigma	L9042-1L
Medium weighing boat	Heathrow Scientific	HS120223
MSC 10pc plier/clamp set	Fisher Scientific	50-129-5352	Miscellaneous clamps/vise grips for securely holding samples while drilling/cutting
Sartorius Quintix Semi-Micro Balance	Fisher Scientific	14-560-019	enclosed balance
Tyvek coveralls with hood	Fisher Scientific	01-361-7X	PPE
Weigh paper	Heathrow Scientific	HS120116