Summary
Het protocol presenteert een reeks best practice-protocollen voor het verzamelen van botpoeder van acht aanbevolen anatomische bemonsteringslocaties (specifieke locaties op een bepaald skeletelement) over vijf verschillende skeletelementen van middeleeuwse individuen (radiokoolstof gedateerd op een periode van ca. 1040-1400 CE, gekalibreerd 2-sigmabereik).
Abstract
De hier gepresenteerde methoden proberen de kansen op het herstel van menselijk DNA uit oude archeologische overblijfselen te maximaliseren en tegelijkertijd het materiaal van inputmonsters te beperken. Dit werd gedaan door zich te richten op anatomische bemonsteringslocaties waarvan eerder was vastgesteld dat ze de hoogste hoeveelheden oud DNA (aDNA) opleverden in een vergelijkende analyse van DNA-herstel over het skelet. Eerder onderzoek heeft gesuggereerd dat deze protocollen de kansen op het succesvolle herstel van oud menselijk en pathogeen DNA uit archeologische overblijfselen maximaliseren. DNA-opbrengsten werden eerder beoordeeld door Parker et al. 2020 in een breed onderzoek naar aDNA-conservering over meerdere skeletelementen van 11 individuen die zijn teruggevonden op het middeleeuwse (radiokoolstof gedateerd op een periode van circa (ca.) 1040-1400 CE, gekalibreerd 2-sigmabereik) kerkhof op Krakauer Berg, een verlaten middeleeuwse nederzetting in de buurt van Peißen Duitsland. Deze acht bemonsteringsplekken, die vijf skeletelementen omvatten (pars petrosa, permanente kiezen, thoracale wervel, distale falanx en talus) leverden met succes hoogwaardig oud menselijk DNA op, waar de opbrengsten aanzienlijk groter waren dan het algemene gemiddelde over alle elementen en individuen. De opbrengsten waren voldoende voor gebruik in de meest voorkomende downstream populatiegenetische analyses. Onze resultaten ondersteunen het voorkeursgebruik van deze anatomische bemonsteringslocaties voor de meeste studies met de analyses van oud menselijk DNA uit archeologische overblijfselen. Implementatie van deze methoden zal helpen om de vernietiging van kostbare archeologische exemplaren te minimaliseren.
Introduction
De bemonstering van oude menselijke resten met het oog op DNA-herstel en -analyse is inherent destructief 1,2,3,4. De monsters zelf zijn kostbare exemplaren en morfologische conservering moet waar mogelijk worden bewaard. Als zodanig is het absoluut noodzakelijk dat bemonsteringspraktijken worden geoptimaliseerd om zowel onnodige vernietiging van onvervangbaar materiaal te voorkomen als de kans op succes te maximaliseren. De huidige beste praktijktechnieken zijn gebaseerd op een klein cohort van studies die beperkt zijn tot forensische onderzoeken 5,6, studies van oude specimens waarbij de ontwikkeling van optimale bemonstering niet het directe doel van de studie is7, of specifieke studies waarbij gebruik wordt gemaakt van niet-menselijke resten8 of gericht op een zeer kleine selectie van anatomische bemonsteringslocaties (hier gebruikt om een specifiek gebied van een skeletelement aan te duiden waaruit botpoeder, voor gebruik in downstream DNA-analyses, werd gegenereerd)9,10. De hier gepresenteerde bemonsteringsprotocollen werden geoptimaliseerd in de eerste grootschalige systematische studie van DNA-behoud over meerdere skeletelementen van meerdere individuen11. Alle monsters waren afkomstig van skeletelementen die waren teruggevonden van 11 personen die waren opgegraven op het kerkhof van de verlaten middeleeuwse nederzetting Krakauer Berg in de buurt van Peißen, Saksen-Anhalt, Duitsland (zie tabel 1 voor gedetailleerde demografische gegevens van de steekproef) en als zodanig mogelijk moeten worden gewijzigd voor gebruik met monsters buiten dit geografische / temporele bereik.
| Individueel | Geslacht | Geschatte leeftijd bij overlijden | 14 C data (CE, Cal 2-sigma) |
| Kra001 | Mannelijk | 25-35 | 1058-1219 |
| KRA002 | Vrouwelijk | 20-22 | 1227-1283 |
| Kra003 | Mannelijk | 25 | 1059-1223 |
| Kra004 | Mannelijk | 15 | 1284-1392 |
| KRA005 | Mannelijk | 10-12 | 1170-1258 |
| Kra006 | Vrouwelijk | 30-40 | 1218-1266 |
| KRA007 | Vrouwelijk | 25-30 | 1167-1251 |
| Kra008 | Mannelijk | 20 | 1301-1402 |
| KRA009 | Mannelijk | Onbekend | 1158-1254 |
| Kra010 | Mannelijk | 25 | 1276-1383 |
| Kra011 | Vrouwelijk | 30-45 | 1040-1159 |
Tabel 1: Genetisch bepaald geslacht, archeologisch bepaalde geschatte leeftijd bij overlijden en radiokoolstofdatering (14C Cal 2-sigma) voor alle 11 bemonsterde personen. Deze tabel is aangepast van Parker, C. et al. 202011.
Deze protocollen maken een relatief eenvoudige en efficiënte generatie van botpoeder mogelijk uit acht anatomische bemonsteringslocaties over vijf skeletelementen (inclusief de pars petrosa) met beperkte laboratorium-geïnduceerde DNA-besmetting. Van deze vijf skeletelementen zijn zeven anatomische bemonsteringslocaties op vier skeletelementen geïdentificeerd als levensvatbare alternatieven voor de destructieve bemonstering van de petrouspiramide 11,12. Deze omvatten het cementum, dentine en pulpkamer van permanente kiezen; corticale bot verzameld uit de superieure wervelinkeping en uit het lichaam van thoracale wervels; corticale bot afkomstig van het inferieure oppervlak van de apicale pluk en schacht van de distale vingerkootjes; en het dichte corticale bot langs het buitenste deel van de tali. Hoewel er verschillende veel toegepaste methoden zijn voor de bemonstering van de pars petrosa 4,12,13,14, dentine en de tandpulpkamer 1,2,15, gepubliceerde methoden die de succesvolle generatie van botpoeder uit het cementum beschrijven16 , wervellichaam, inferieure wervelinkeping en talus kunnen moeilijk te verkrijgen zijn. Als zodanig demonstreren we hier geoptimaliseerde bemonsteringsprotocollen voor de petrouspiramide (stap 3.1); cementum (stap 3.2.1), dentine (stap 3.2.2) en tandpulp (stap 3.2.3) van volwassen kiezen; corticale bot van het wervellichaam (stap 3.3.1) en superieure wervelboog (stap 3.3.2); de distale falanx (stap 3.4); en de talus (stap 3.5) om het effectieve gebruik van deze skeletelementen voor zowel aDNA als forensisch onderzoek breder toegankelijk te maken.
Protocol
Al het onderzoek dat hierin wordt gepresenteerd, is uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van het Max Planck Institute for the Science of Human History, Jena, Duitsland voor het werken met oude menselijke resten. Voordat u stappen van dit protocol uitvoert, moet u zich houden aan alle lokale / provinciale / federale ethische vereisten met betrekking tot zowel het verkrijgen van toestemming voor de wetenschappelijke studie als het gebruik van menselijke resten voor destructieve bemonstering in uw omgeving. Alle procedures/chemische opslag moeten worden uitgevoerd volgens individuele institutionele veiligheidsrichtlijnen.
1. Overwegingen vóór monsterverwerking
- Behandel monsters met zorg omdat oude overblijfselen een onverklaarbare en eindige bron zijn (monsters moeten bijvoorbeeld zo minimaal mogelijk verspillend zijn en alle overblijfselen indien mogelijk worden teruggestuurd naar hun respectieve en wettige leveranciers).
- Voer alle stappen uit in een cleanroom-omgeving, bij voorkeur in een speciale oude DNA-faciliteit 17,18,19. Gebruik persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM's) bestaande uit steriele microporeuze overalls met capuchon, steriele handschoenen (twee paar), chirurgisch masker, beschermende brillen en steriele laarzen of antislipschoenen met steriele hoezen (zie Materiaaltabel). Wissel regelmatig van handschoenen, vooral tussen monsters.
- Reinig en desinfecteer alle apparatuur en oppervlakken grondig met bleekmiddel/DNA-ontsmettingsoplossing/ethanol en UV-bestraling (golflengte: 254 nm) waar mogelijk (bijv. boren, boren, vizieren/klemmen, enz.). Ten slotte wordt het ten zeerste aanbevolen om regelmatig ergonomische pauzes te nemen (indien mogelijk elke 2-3 uur) om overmatige uitputting als gevolg van de cleanroom-omgeving te voorkomen.
OPMERKING: Alle skeletresten moeten op de juiste manier worden gedocumenteerd (bijv. gefotografeerd, gewogen en indien mogelijk micro-CT gescand, 3D-beeld, enz.) voordat ze worden bemonsterd (protocollen voor geschikte documentatie worden niet behandeld in dit manuscript). Alle bemonsteringsprotocollen kunnen tussen de bemonsterings-iteraties worden gepauzeerd en de monsters kunnen voor onbepaalde tijd worden opgeslagen in een droge, temperatuurgecontroleerde (25 °C), steriele omgeving.
2. Voorbehandeling
- Ontsmet alle anatomische bemonsteringslocaties voorafgaand aan het genereren van botpoeder om het risico op besmetting te minimaliseren18.
OPMERKING: De werkzaamheid van bleekmiddel en/of oppervlakteverwijdering (zie OPMERKING in stap 3.3.2 voor stappen voor oppervlakteverwijdering) voor monsterontsmetting is nog steeds een punt van discussie onder aDNA-onderzoekers 8,19,20,21,22,23,24,25, omdat beide de totale DNA-opbrengsten kunnen beïnvloeden, vooral in sterk afgebroken monsters. Als zodanig worden de volgende stappen als optioneel beschouwd en zijn ze hier opgenomen omdat ze in alle steekproeven werden gebruikt om de representatieve resultaten in dit artikel te genereren. Aanbevolen wordt om het gebruik van deze voorbehandelingsprotocollen van geval tot geval te bepalen op basis van de moleculaire toepassing, leeftijd, zeldzaamheid en mate van morfologische afbraak van elke monsterverzameling.- Voer alle bemonstering uit in een speciale cleanroom onder een met UV-licht uitgeruste polymerasekettingreactie (PCR) kap of bioveiligheidskast met uitgeschakelde luchtstroom. Verdeel steriele aluminiumfolie over het bankje om eventuele verdwaalde botpoeder/fragmenten op te vangen.
- Zorg ervoor dat alle botfragmenten worden teruggewonnen (voor repatriëring) voordat u de folie weggooit. Verander de folie tussen de behandeling van elk skeletelement. Gooi de gebruikte folie weg in een autoclaveerbare biohazard zak/recipiënt.
- Verwijder zoveel mogelijk los vuil/afval van anatomische bemonsteringslocaties door het gebied voorzichtig af te vegen met een pluisvrij droog steriel doekje (zie Materiaaltabel). Gooi de doekjes weg in autoclaveerbare biohazard zakken of recipiënten.
- Ontsmet het gereinigde oppervlak door af te vegen met een steriel doekje bevochtigd met verdund commercieel bleekmiddel (~ 0,01% v / v, verdund met ultrapuur DNase / RNase-vrij water) en laat gedurende 5 minuten incuberen. Gooi de doekjes weg in autoclaveerbare biohazard zakken of recipiënten.
LET OP: Bleekmiddel is een zeer corrosieve en reactieve chemische stof; daarom moeten passende veiligheidsmaatregelen worden getroffen voordat het wordt gebruikt. - Verwijder zoveel mogelijk restbleekmiddel van de anatomische bemonsteringslocatie met een steriel doekje bevochtigd met ultrapuur DNase/RNase-vrij water. Gooi de doekjes weg in autoclaveerbare biohazard zakken of recipiënten.
- Stel alle gereinigde anatomische bemonsteringslocaties gedurende 30 minuten bloot aan UV-straling (golflengte: 254 nm) en laat vervolgens volledig drogen bij kamertemperatuur. Zorg ervoor dat de anatomische bemonsteringslocaties volledig droog zijn voordat u doorgaat met bemonstering of terugkeert naar opslag om niet alleen het genereren van botpoeder gemakkelijker te maken, maar ook om verdere afbraak van het monster (bijv. Schimmel) te voorkomen.
LET OP: Blootstelling aan UV-straling kan schadelijk zijn voor de ogen. - Ga onmiddellijk over op bemonstering of bewaar skeletelementen in een droge, temperatuurgecontroleerde (25 °C) steriele omgeving.
3. Botpoeder generatie
OPMERKING: De volgende protocollen zijn bedoeld voor gebruik bij DNA-extractie volgens het Dabney et al. 2019 protocol26.
- Bemonstering van pars petrosa
OPMERKING: Dit protocol is aangepast aan de procedures beschreven in Pinhasi et al. 20194 en wordt hier gepresenteerd voor gebruiksgemak. Dit protocol vertegenwoordigt niet de huidige, minst destructieve methode voor de bemonstering van pars petrosa. Als zodanig wordt aanbevolen om het protocol te gebruiken dat is beschreven door Sirak et al. 201713 of Orfanou et al. 202014 voor monsters waarbij morfologische conservering van het grootste belang is.- Voer alle bemonstering uit in een speciale cleanroom onder een pcr-kap met UV-licht of bioveiligheidskast (golflengte: 254 nm) met de luchtstroom uitgeschakeld. Verdeel steriele aluminiumfolie over het bankje om eventuele verdwaalde botpoeder/fragmenten op te vangen.
- Zorg ervoor dat alle botfragmenten en zoveel mogelijk poeder worden teruggewonnen (voor repatriëring) voordat u folie weggooit. Vervang de folie tussen elke bemonstering. Gooi de gebruikte folie weg in een autoclaveerbare biohazard zak/recipiënt.
- Bevestig het droge, ontsmette element met een gesteriliseerde klem of vise.
- Snijd de pars petrosa in tweeën langs de superieure sulcus petrosus (zie figuur 1) met behulp van een standaard juwelierszaag uitgerust met een blad van 0,6 mm (zie Materiaaltabel) op gemiddelde snelheid om oververhitting te voorkomen (zie OPMERKING onder stap 3.1.6).
LET OP: De pars petrosa is zeer dicht en kan als zodanig moeilijk te snijden zijn. Zorg ervoor dat het element stevig vastgeklemd blijft om letsel te voorkomen. Gooi eventuele gebroken zaagbladen weg in de juiste naaldhouder. - Verwijder de petrousgedeelten van de klem. Herstel en bewaar los/overtollig materiaal.
- Plaats weegpapier in een steriele weegboot
- Houd het petrousgedeelte boven het weegpapier, gesneden kant kantelings naar de weegschaal. Boor in het dichte corticale bot tussen het gezichtskanaal en het mastoïde antrum (lijkt glanzender dan het omringende materiaal, zie figuur 1) met behulp van een tandboor die is uitgerust met een kleine meterbit (zie Materiaaltabel) en ingesteld op gemiddelde snelheid, gemiddeld koppel om botpoeder te produceren.
OPMERKING: Boren / snijden moet worden gedaan in korte uitbarstingen met lage tot gemiddelde snelheden om oververhitting van het bot en mogelijk vernietigen / beschadigen van DNA te voorkomen. Anekdotisch, wanneer het dichte deel van de petrous begint te oververhitten, kan een geur worden waargenomen die wordt beschreven als kokend spek. Stop onmiddellijk met boren/zagen en laat het bot rusten tot het voldoende is afgekoeld voordat het wordt hervat. - Herhaal het boren totdat ongeveer 50-100 mg poeder in het weegpapier is verzameld, gemeten met behulp van een ingesloten balans die nauwkeurig is tot ten minste 0,01 mg (zie materiaaltabel).
OPMERKING: Waar mogelijk wordt voorgesteld om 100 mg botpoeder te verzamelen om twee replicaat-DNA-extractie van elk 50 mg mogelijk te maken. Dit is echter niet altijd mogelijk op basis van beperking van de anatomische bemonsteringslocaties zelf (bijv. de distale falanx, tandpulpkamer) of de noodzaak van morfologische conservering. Voor andere locaties, zoals het cementum, kan aanzienlijk minder dan 50 mg van het materiaal beschikbaar zijn. Het cementum, de tandpulpkamer en de distale falanx hebben echter allemaal aangetoond dat ze een significant endogene DNA 11,27,28 opleveren, ondanks een lagere initiële input van botpoeder uit het extractieproces. - Breng poeder over van het weegpapier naar een 2 ml gelabelde low-bind, safe-lock buis voor extractie of opslag. Bewaar monsters bij -20 °C, voor onbepaalde tijd.
- Bewaar het resterende bot/overtollige poeder in een droge, temperatuurgecontroleerde (25 °C) steriele omgeving totdat de terugkeer/repatriëring kan worden voltooid.
- Gooi al het afval weg in autoclaveerbare biohazard zakken of recipiënten. Steriliseer/ontsmet alle herbruikbare apparatuur (bijv. klemmen, boren, boren, zagen, enz.) met behulp van bleekmiddel/DNA-ontsmettingsoplossing/ethanol en UV-blootstelling (golflengte: 254 nm), indien van toepassing, tussen elke bemonstering.
Figuur 1: Temporale bot inclusief de pars petrosa. (A) Monstervoorsnijdend monster met de locaties van de petrouspiramide en de sulcus petrosa. (B) Petrous-gedeelte na het snijden met de nadruk op de dichte gebieden die moeten worden geboord. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Bemonstering van permanente kiezen
OPMERKING: Voor de bemonstering van permanente kiezen, vooraf selecteren in situ kiezen met gesmolten wortels en idealiter vrij van cariës, scheuren in het glazuur of overmatige slijtage voor het beste resultaat. Verwijder eventuele tandsteenmonsters en bewaar bij -20 °C voor mogelijke toekomstige analyses van het orale microbioom (procedure die hier niet wordt behandeld).- Bemonstering van het cementum
- Voer alle bemonstering uit in een speciale cleanroom onder een pcr-kap met UV-licht of bioveiligheidskast (golflengte: 254 nm) met de luchtstroom uitgeschakeld. Verdeel steriele aluminiumfolie over het bankje om eventuele verdwaalde botpoeder/fragmenten op te vangen.
- Zorg ervoor dat alle botfragmenten en zoveel mogelijk poeder worden teruggewonnen (voor repatriëring) voordat u folie weggooit. Vervang de folie tussen elke bemonstering. Gooi de gebruikte folie weg in een autoclaveerbare biohazard zak/recipiënt.
- Leg een vel weegpapier in een steriele weegschaal.
- Houd/bevestig de ontsmette kies door het glazuur, wortel naar beneden, boven een weegschaal met behulp van een handklem zoals een verstelbare moersleutel (zie Materiaaltabel).
- Rust een tandartsboor uit met een cirkelvormig snijwiel met diamantrand. Met de boor ingesteld op een gemiddelde snelheid/koppel instelling, raak de rand van het bit lichtjes aan de wortel onder een hoek van ongeveer -20°.
- Schraap naar beneden in de bak om het gele, buitenste materiaal van de wortel (cementum) te verwijderen / te verzamelen. Stop de verzameling wanneer het lichtere (witte) materiaal van het dentine zichtbaar wordt.
OPMERKING: Het is belangrijk om de draairichting van de snijbit ten opzichte van de opvangbak af te stemmen om te voorkomen dat het poeder wordt verneveld en het monster mogelijk verspilt door de lade volledig te missen. Het cementum is bijzonder rijk aan DNA; typische opbrengsten van materiaal zijn echter veel kleiner dan andere anatomische bemonsteringslocaties (~ 7-20 mg)11,27,28. - Registreer de massa poeder verzameld in weegpapier met behulp van een ingesloten balans die nauwkeurig is tot ten minste 0,01 mg (zie materiaaltabel).
- Breng poeder over van het weegpapier naar een 2 ml laag gebonden, veilige vergrendelingsbuis voor extractie. Bewaren bij -20 °C, voor onbepaalde tijd.
- Bemonstering van de pulpkamer
- Nadat het cementum is verzameld (indien gewenst), snijdt u de kies langs de cemento-emailleverbinding met behulp van een juwelierszaag om de kroon te verwijderen (zie figuur 2).
- Plaats een nieuw vel weegpapier in een nieuwe weeglade.
- Bevestig het kroongedeelte in een handklem of vise, over de weegschaal. Houd de gesneden kant naar beneden gekanteld en boor/schraap materiaal als eerste doorgang met een tandboormachine uitgerust met een kleine boor (zie materiaaltabel) langs de randen van de pulpkamer in het kroongedeelte (zie figuur 2).
OPMERKING: Alleen de eerste doorgang van het binnenste van de pulpkamer moet worden verzameld en geëtiketteerd als pulpmateriaal (5-15 mg typische opbrengst), alles dieper in de tand wordt als dentine beschouwd. - Draai de tand met het inferieure gedeelte naar beneden gericht, tik met een hamer op de klem en verzamel het bevrijde poeder op het weegpapier.
- Noteer het gewicht van het verzamelde poeder in het weegpapier met behulp van een bijgevoegde balans die nauwkeurig is tot ten minste 0,01 mg (zie materiaaltabel).
- Breng poeder over van het weegpapier naar een 2 ml low-bind, safe-lock buis voor extractie. Bewaren bij -20 °C, voor onbepaalde tijd.
- Bemonstering van het dentine
- Plaats een nieuw vel weegpapier in een nieuwe weeglade.
- Houd het kroongedeelte boven de weegschaal (volgens stap 3.2.2.3), boor uit en verzamel nog eens 50-100 mg dentine zoals gemeten met behulp van een gesloten balans die nauwkeurig is tot 0,01 mg (zie materiaaltabel) uit de binnenkant van de pulpkamer op dezelfde manier voor verdere dentinebemonstering (zie figuur 2).
- Breng botpoeder over van het weegpapier naar een 2 ml low-bind, safe-lock buis voor extractie. Bewaren bij -20 °C, voor onbepaalde tijd.
- Bewaar de resterende tandstukken/overtollig poeder in een droge, temperatuurgecontroleerde (25 °C) steriele omgeving totdat de terugkeer/repatriëring kan worden voltooid.
- Gooi al het afval weg in autoclaveerbare biohazard zakken of recipiënten. Steriliseer/ontsmet alle herbruikbare apparatuur (bijv. klemmen, boren, boren, zagen, enz.) met behulp van bleekmiddel/DNA-ontsmettingsoplossing/ethanol- en UV-blootstelling (golflengte: 254 nm) indien van toepassing, tussen elke bemonstering.
- Bemonstering van het cementum
Figuur 2: Permanente molaire voorbemonstering. (A) Voorbehandelde kies voorafgaand aan de bemonstering, met kroon, cementum (geelachtige laag van de wortel) en de snijplaats op de cemento-glazuurverbinding. (B) Dezelfde molaire postcementumverzameling, met vermelding van de snijplaats op de cemento-emaille junctie. C) Molaire nasnijding en bemonstering met anatomische bemonsteringslocaties voor de tandpulpkamer en het dentine in de kroon. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Bemonstering van de thoracale wervels
- Bemonstering van het wervellichaam
- Voer alle bemonstering uit in een speciale cleanroom onder een pcr-kap met UV-licht of bioveiligheidskast (golflengte: 254 nm) met de luchtstroom uitgeschakeld. Verdeel steriele aluminiumfolie over het bankje om eventuele verdwaalde botpoeder/fragmenten op te vangen.
- Zorg ervoor dat alle botfragmenten en zoveel mogelijk poeder worden teruggewonnen (voor repatriëring) voordat u folie weggooit. Vervang de folie tussen elke bemonstering. Gooi de gebruikte folie weg in een autoclaveerbare biohazard zak/recipiënt.
- Plaats een klein vel weegpapier in een standaard weeglade.
- Bevestig de wervels met een klem of handvizier, met het wervellichaam naar buiten.
- Houd de wervels boven de weegschaal met het wervellichaam naar beneden gekanteld. Gebruik een tandboormachine die is uitgerust met een kleine boor (zie materiaaltabel) ingesteld op een hoog koppel bij lage snelheid, boor langs de buitenste rand (inferieur en superieur) van het corticale bot rond het cancelleuze binnenste weefsel van het wervellichaam (zie figuur 3).
- Schraap het bit tegen de corticale laag over een standaard wegingsbak totdat 50-100 mg materiaal is verzameld, zoals gemeten met behulp van een ingesloten balans die nauwkeurig is tot 0,01 mg (zie Materiaaltabel).
- Breng botpoeder over van het weegpapier naar een 2 ml laag gebonden, veilige vergrendelingsbuis voor extractie. Bewaren bij -20 °C, voor onbepaalde tijd.
- Bemonstering van de superieure wervelboog
OPMERKING: Deze stap is optioneel. Verwijder en gooi de buitenste laag van het corticale bot van de superieure wervelboog weg met behulp van een tandboormachine uitgerust met een kleine boor (zie Materiaaltabel) door deze langs het oppervlak te schrapen19. Dit wordt niet voorgesteld voor bemonstering uit het wervellichaam, omdat de laag corticale bot over het algemeen erg dun is en waarschijnlijk volledig uitgeput raakt door dit proces (zie OPMERKING in rubriek 2).- Plaats een klein vel weegpapier in een standaard weeglade.
- Bevestig de wervels in een handklem / vise met het wervelproces naar buiten, superieur aspect naar beneden.
- Terwijl u de wervels, het superieure aspect naar beneden, boven een weegbak houdt, boort u omhoog in het midden van de V-vormige inkeping gevormd door de fusie van het spineuze proces met de lamellen (zie figuur 3) met behulp van een tandboor met een kleine meterbit (zie Materiaaltabel) ingesteld op lage snelheid en hoog koppel.
- Stop met boren wanneer er een merkbare daling van de weerstand is. Verander de boorpositie enigszins en herhaal dit totdat 50-100 mg botpoeder is verzameld, zoals gemeten met behulp van een gesloten balans die nauwkeurig is tot 0,01 mg (zie materiaaltabel).
- Breng botpoeder over van het weegpapier naar een buis met lage binding van 2 ml voor extractie. Bewaren bij -20 °C, voor onbepaalde tijd.
- Bewaar het resterende bot/overtollige poeder in een droge, temperatuurgecontroleerde (25 °C) steriele omgeving tot terugkeer/repatriëring.
- Gooi al het afval weg in autoclaveerbare biohazard zakken of recipiënten. Steriliseer/ontsmet alle herbruikbare apparatuur (bijv. klemmen, boren, boren, zagen, enz.) met behulp van bleekmiddel/DNA-ontsmettingsoplossing/ethanol en UV-blootstelling (golflengte: 254 nm), indien van toepassing, tussen elke bemonstering.
- Bemonstering van het wervellichaam
Figuur 3: Wervellichaam en superieure wervelboog corticale bot anatomische bemonsteringslocaties van de thoracale wervel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Bemonstering van de distale falanx
OPMERKING: Deze stap is optioneel. Verwijder en gooi de buitenste laag van het corticale bot van de schacht en / of apicale pluk weg met behulp van een tandboor die is uitgerust met een kleine boorbit door deze langs het oppervlak te schrapen19. Dit is mogelijk niet mogelijk voor monsters met te dun corticale bot of juveniele resten (zie OPMERKING in rubriek 2).- Voer alle bemonstering uit in een speciale cleanroom, onder een pcr-kap met UV-licht of bioveiligheidskast (UV-golflengte: 254 nm) met de luchtstroom uitgeschakeld. Verdeel steriele aluminiumfolie over het bankje om eventuele verdwaalde botpoeder/fragmenten op te vangen.
- Zorg ervoor dat alle botfragmenten en zoveel mogelijk poeder worden teruggewonnen (voor repatriëring) voordat u folie weggooit. Vervang de folie tussen elke bemonstering. Gooi de gebruikte folie weg in een autoclaveerbare biohazard zak/recipiënt.
- Plaats een klein vel weegpapier in een standaard weeglade.
- Bevestig het monster in handklem/vise, superieure kant naar boven.
- Houd het monster boven de weegschaal, verzamel botpoeder van het corticale bot van de inferieure kant van de apicale pluk en schacht door door de buitenste dichte lagen te boren (zie figuur 4) met behulp van een tandboor die is uitgerust met een kleine boor (zie materiaaltabel).
- Stop met boren wanneer er een duidelijke afname van de weerstand is, omdat dit lichter, annulair materiaal betekent. Herhaal dit proces en straal uit van de eerste boring totdat ten minste 50-100 mg botpoeder is verzameld, zoals gemeten met behulp van een gesloten balans die nauwkeurig is tot 0,01 mg (zie materiaaltabel).
- Breng botpoeder over van het weegpapier naar een 2 ml low-bind, safe-lock buis voor extractie. Bewaren bij -20 °C, voor onbepaalde tijd.
- Bewaar het resterende bot/overtollige poeder in een droge, temperatuurgecontroleerde (25 °C) steriele omgeving tot terugkeer/repatriëring.
- Gooi al het afval weg in autoclaveerbare biohazard zakken of recipiënten. Steriliseer/ontsmet alle herbruikbare apparatuur (bijv. klemmen, boren, boren, zagen, enz.) met behulp van bleekmiddel/DNA-ontsmettingsoplossing/ethanol en UV-blootstelling, indien van toepassing, tussen elke bemonstering.
OPMERKING: Voor kleinere monsters (bijv. Juveniele monsters) kan er aanzienlijk minder zijn dan de voorgestelde 50-100 mg corticale bot die beschikbaar is om te bemonsteren. Zelfs in kleine hoeveelheden is echter aangetoond dat deze anatomische bemonsteringslocatie bijzonder rijk is aan DNA11.
Figuur 4: Distale falanx toont de locaties van dicht corticale bot langs de schacht en de inferieure kant van de apicale pluk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Bemonstering van de Talus
- Voer alle bemonstering uit in een speciale cleanroom onder een pcr-kap met UV-licht of bioveiligheidskast (golflengte: 254 nm) met de luchtstroom uitgeschakeld. Verdeel steriele aluminiumfolie over het bankje om eventuele verdwaalde botpoeder/fragmenten op te vangen.
- Zorg ervoor dat alle botfragmenten en zoveel mogelijk poeder worden teruggewonnen (voor repatriëring) voordat u folie weggooit. Vervang de folie tussen elke bemonstering. Gooi de gebruikte folie weg in een autoclaveerbare biohazard zak/recipiënt.
- Plaats een klein vel weegpapier in een standaard weeglade.
- Bevestig het monster in handklem/vizier, koepel naar boven.
- Houd de talus, de koepel naar boven en het mediale oppervlak naar de collector, boven de weegschaal. Schraap corticale bot uit de hals van de talus tot een diepte van ~ 1 mm (zie figuur 5) met behulp van een tandboor met een lage dikte (zie Materiaaltabel) ingesteld op lage snelheid en hoog koppel.
- Verander de boorpositie enigszins en herhaal dit totdat ongeveer 50-100 mg botpoeder is verzameld, zoals gemeten met behulp van een gesloten balans die nauwkeurig is tot 0,01 mg (zie materiaaltabel).
- Breng botpoeder over van het weegpapier naar een buis met lage binding van 2 ml voor extractie. Bewaren bij -20 °C, voor onbepaalde tijd.
- Bewaar het resterende bot/overtollige poeder in een droge, temperatuurgecontroleerde (25 °C) steriele omgeving totdat de terugkeer/repatriëring kan worden voltooid.
- Gooi al het afval weg in autoclaveerbare biohazard zakken of recipiënten. Steriliseer/ontsmet alle herbruikbare apparatuur (bijv. klemmen, boren, boren, zagen, enz.) met behulp van bleekmiddel/DNA-ontsmettingsoplossing/ethanol en UV-blootstelling (golflengte: 254 nm), indien van toepassing, tussen elke bemonstering.
Figuur 5: Bemonsteringsgebied van de talus voor corticale botherstel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
OPMERKING: De talus heeft zeer weinig corticale bot (een dunne buitenste laag). Het materiaal moet niet alleen van het oppervlak worden verzameld, maar ook van de onderliggende dichte laag annulair bot.
Representative Results
In een afzonderlijke studie11 werd DNA geëxtraheerd uit botpoeder gegenereerd uit elke anatomische bemonsteringslocatie bij 11 personen, met behulp van een standaard DNA-extractieprotocol dat is geoptimaliseerd voor korte fragmenten uit verkalkt weefsel2. Enkelstrengsbibliotheken werden vervolgensgeproduceerd 28 en gesequenced op een HiSeq 4000 (75 bp paired-end) tot een diepte van ~ 20.000.000 reads per monster. De resulterende sequentiegegevens werden vervolgens geëvalueerd op endogene menselijke DNA-inhoud met behulp van de EAGER-pijplijn29 (BWA-instellingen: zaadlengte van 32, 0,1 mismatch-straf, mappingkwaliteitsfilter van 37). Alle representatieve resultaten worden gerapporteerd met behulp van dezelfde statistieken als Parker et al. 202011 voor consistentie. Bibliotheken van de poedervormige delen van de pars petrosa leverden gemiddeld een hoger endogene DNA op dan alle andere 23 onderzochte anatomische bemonsteringslocaties (figuur 6A-B). De zeven aanvullende anatomische bemonsteringslocaties die in dit protocol worden gepresenteerd (het cementum, de eerste doorgang van de tandpulpkamer en dentine van permanente kiezen; corticale bot van het wervellichaam en de superieure wervelboog van de thoracale wervel; corticale bot uit het apicale plukje van de distale falanx; en corticale bot uit de nek van de talus) produceerden de op een na hoogste opbrengsten (zonder statistische significantie tussen deze anatomische bemonsteringslocaties; Figuur 6A-B; Aanvullend bestand 1: EndogenousDNAPreCap). Deze alternatieve locaties hebben allemaal consistent geproduceerde DNA-opbrengsten opgeleverd die voldoende zijn voor standaard populatiegenetische analyses zoals mitochondriale analyses en single nucleotide polymorphism (SNP) analyses. Duplicatiepercentages in bibliotheken afkomstig van alle anatomische bemonsteringslocaties waren laag (clusterfactoren < gemiddeld 1,2, berekend als de verhouding tussen alle mapping reads en unieke mapping reads, tabel 2; Supplemental File 1: ClusterFactor), wat aangeeft dat alle gescreende bibliotheken van zeer hoge complexiteit waren. Evenzo waren de gemiddelde schattingen van exogene menselijke DNA-besmetting laag, gemiddeld < 2% (X-chromosoomverontreiniging bij mannen, n = 7, zoals gerapporteerd door de ANGSD30-pijplijn) in alle anatomische bemonsteringslocaties behalve de superieure wervelboog (gemiddelde geschatte besmetting: 2,11%, waarbij één monster als uitschieter werd verwijderd; KRA005: 19,52%, zie tabel 2; Aanvullend bestand 1: Xcontaminatie). De gemiddelde fragmentlengte (na filtering om alle afgelezen waarden < 30 bp te verwijderen) was het laagst in het materiaal verzameld uit de tandpulpkamer en dentine, zonder significante variatie tussen andere anatomische bemonsteringslocaties (respectievelijk 55,14 bp en 60,22 bp, in vergelijking met een gemiddelde mediaan van 62,87, paarsgewijze p-waarden < 0,019, tabel 2; Aanvullend bestand 1: AvgFragLength). Bovendien bevatten de tanden en borstwervels elk meerdere anatomische bemonsteringslocaties waar hoog endogene DNA-herstel werd waargenomen, waardoor ze bijzonder geschikt zijn als alternatieven voor de pars petrosa.
Figuur 6: Menselijk DNA-gehalte voor alle gescreende monsters. Zwarte lijnen vertegenwoordigen het totale gemiddelde, terwijl rode lijnen de mediaan vertegenwoordigen (solide: menselijk DNA-aandeel, onderbroken: in kaart gebrachte menselijke metingen per miljoen gegenereerde metingen). Individuele anatomische bemonsteringslocaties met een gemiddeld menselijk DNA-aandeel dat hoger is dan het totale gemiddelde (8,16%) worden in alle analyses ingekleurd. (A) Het aandeel van reads mapping tot het hg19-referentiegenoom. De blauwe stippellijn vertegenwoordigt het theoretische maximum gezien de mappingparameters van de pijplijn (gegenereerd met Gargammel31 om een willekeurige verdeling van 5.000.000 aflezingen van het hg19-referentiegenoom met gesimuleerde schade te simuleren). Individuele gemiddelden (zwarte X) en medianen (rode cirkel) worden gerapporteerd voor die monsters met een hoger gemiddeld menselijk DNA-aandeel dan het totale gemiddelde. Betrouwbaarheidsintervallen geven boven- en ondergrenzen aan, met uitzondering van statistische uitschieters. (B) Het aantal unieke reads mapping naar het hg19-referentiegenoom per miljoen reads van sequencing-inspanning (75 bp gepaard uiteinde). Betrouwbaarheidsintervallen geven boven- en ondergrenzen aan, met uitzondering van statistische uitschieters. Dit cijfer is overgenomen uit Parker, C. et al. 202011. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 2: Gemiddelde duplicatieniveaus (mapping reads/unique reads), gemiddelde en mediane fragmentlengtes en X-chromosoombesmettingsschattingen voor alle anatomische bemonsteringslocaties. Fout gerapporteerd als de standaardfout van het gemiddelde. Deze tabel is aangepast van Parker, C. et al. 202011.
| Bemonsteringslocatie | Gemiddelde duplicatiefactor (# in kaart gebrachte leeswaarden /# unieke toegewezen leeswaarden) | Gemiddelde fragmentlengte in bp | Gemiddeld geschat aandeel X-chromosoombesmetting |
| Petrous piramide | 1.188 ± 0.006 | 65,40 ± 1,36 | 0,000 ± 0,003 |
| Cementum | 1.197 ± 0.028 | 67,28 ± 1,76 | 0,011 ± 0,003 |
| Dentine | 1.188 ± 0.061 | 60,22 ± 2,37 | 0,002 ± 0,007 |
| Pulp | 1.179 ± 0.024 | 55,14 ± 2,90 | 0,013 ± 0,006 |
| Distale falanx | 1.191 ± 0.049 | 65,95 ± 1,08 | 0,013 ± 0,005 |
| Wervellichaam | 1.194 ± 0.037 | 66,14 ± 1,03 | 0,008 ± 0,003 |
| Superieure wervelboog | 1,19 ± 0,017 | 63,02 ± 1,23 | 0,021 ± 0,009* |
| Talus | 1.198 ± 0.010 | 68,20 ± 1,24 | 0,011 ± 0,003 |
| *Monster KRA005 verwijderd als uitschieter op 0,1952 |
Beschikbaarheid van code
Alle analyseprogramma's en R-modules die in de analyses van dit manuscript worden gebruikt, zijn vrij beschikbaar bij hun respectieve auteurs. Alle aangepaste R-code is op aanvraag beschikbaar.
Beschikbaarheid van gegevens
Alle ruwe gegevens die worden gebruikt bij de berekening van representatieve resultaten zijn vrij beschikbaar in de gegevensopslagplaats van het European Nucleotide Archive ENA (toetredingsnummer PRJ-EB36983) of aanvullende materialen van Parker, C. et al.11.
Aanvullend dossier 1. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
De huidige praktijk in de oude menselijke populatiegenetica is om waar mogelijk bij voorkeur monsters te nemen van de pars petrosa (stap 2.1). De pars petrosa kan echter een moeilijk te verkrijgen monster zijn, omdat het zeer gewaardeerd wordt voor een groot aantal skeletbeoordelingen (bijv. Populatiegeschiedenis32, de schatting van de foetale leeftijd bij overlijden33 en geslachtsbepaling34), en historisch gezien kan bemonstering van de pars petrosa voor DNA-analyse zeer destructief zijn 3,4 (inclusief het hier gepresenteerde protocol, hoewel nieuwe, minimaal invasieve protocollen13,14 nu op grote schaal zijn aangenomen om deze bezorgdheid te verlichten). Dit wordt nog verergerd door het feit dat tot voor kort een grootschalige, systematische studie van menselijk DNA-herstel over het skelet niet was geprobeerd11, waardoor het vinden van een geschikte bemonsteringsstrategie wanneer de petrouspiramide niet beschikbaar is, een uitdaging is.
De hier gepresenteerde protocollen helpen die uitdaging te verlichten door een reeks geoptimaliseerde procedures te bieden voor DNA-bemonstering van archeologische / forensische skeletresten, waaronder de pars petrosa, evenals zeven alternatieve anatomische bemonsteringslocaties over vier extra skeletelementen. De opgenomen kritieke stappen zijn allemaal bedoeld om de kans op DNA-verlies/-schade als gevolg van inefficiënte bemonstering (stappen 2.1.6 en 3.2.1.3) of oververhitting van monsters tijdens het boren/snijden (stap 3.1.6) tot een minimum te beperken. Bovendien is in het hele protocol opgemerkt dat het nodig kan zijn om de voorbehandelingsstappen te wijzigen / weg te laten om de beste prestaties in sterk afgebroken monsters te garanderen. Er moet ook worden opgemerkt dat zelfs onder de geselecteerde elementen die hier worden gepresenteerd, er verschillende mogelijke alternatieve bemonsteringstechnieken blijven (met name voor de pars petrosa 13,14), evenals voldoende ruimte voor verdere optimalisatie van de hier gepresenteerde onderbenutte anatomische bemonsteringslocaties (d.w.z. de talus: stap 2.5 en de wervels: stap 2.3).
Het is ook belangrijk om in gedachten te houden dat deze protocollen zijn ontworpen en getest met behulp van oude juveniel-volwassen overblijfselen van hoge kwaliteit (goed morfologisch behoud) voor de doeleinden van endogene menselijke DNA-analyses. De gepresenteerde resultaten kunnen zich niet uitstrekken tot meer sterk afgebroken materialen, andere conserveringscontexten, babyresten, niet-menselijke overblijfselen of studies van pathogenen of het microbioom, omdat een grotere verkenning van het gebruik van deze protocollen in aanvullende contexten nog steeds nodig is. Bovendien kunnen de alternatieve skeletelementen die hier worden gepresenteerd (de tanden, wervels, distale falanx en tali) een uitdaging zijn om aan één persoon toe te wijzen tussen gemengde overblijfselen, waardoor bemonstering van meerdere elementen nodig is om een enkele oorsprong te garanderen. Ondanks deze beperkingen kan het op grote schaal beschikbaar maken van deze protocollen helpen een deel van de heterogeniteit rond monsterselectie en -verwerking te verlichten door een gegeneraliseerd en kwantitatief geoptimaliseerd kader te bieden voor gebruik in een breed scala aan toekomstige aDNA / forensische studies op menselijke resten.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Acknowledgments
De auteurs willen de laboratoriummedewerkers van het Max Planck Institute for the Science of Human History bedanken voor hun hulp bij de ontwikkeling en implementatie van deze protocollen. Dit werk zou niet mogelijk zijn geweest zonder de inbreng en het harde werk van Dr. Guido Brandt, Dr. Elizabeth Nelson, Antje Wissegot en Franziska Aron. Deze studie werd gefinancierd door de Max Planck Society, de European Research Council (ERC) in het kader van het Horizon 2020 onderzoeks- en innovatieprogramma van de Europese Unie onder subsidieovereenkomsten nr. 771234 - PALEoRIDER (WH, ABR) en Starting Grant No. 805268 CoDisEASe (aan KIB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #16 Dental Drill Bit | NTI | H1-016-HP | example drilling bit |
| 0.6 mm scroll saw blade | Fisher Scientific | 50-949-097 | blade for Jewellers Saw |
| 22mm diamond cutting wheel | Kahla | SKU 806 104 358 514 220 | Dremel cutting attachment |
| Commercial Bleach | Fisher Scientific | NC1818018 | |
| Control Company Ultra-Clean Supreme Aluminum Foil | Fisher Scientific | 15-078-29X | |
| DNA LoBind Tubes (2 mL) | Eppendorf | 22431048 | |
| Dremel 225-01 Flex Shaft Attachment | Dremel | 225-01 | Dremel flexible extension |
| Dremel 4300 Rotary Tool | Dremel | 4300 | Example drill |
| Dremel collet and nut kit | Dremel | 4485 | Adapters for various Dremel tool attachments/bits |
| Eagle 33 Gallon Red Biohazard Waste Bag | Fisher Scientific | 17-988-501 | |
| Eppendorf DNA LoBind 2 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 13-698-792 | |
| Ethanol (Molecular Biology Grade) | Millipore Sigma | 1.08543 | |
| FDA approved level 2 Surgical Mask | Fisher Scientific | 50-206-0397 | PPE |
| Fisherbrand Comfort Nitrile Gloves | Fisher Scientific | 19-041-171X | PPE |
| Fisherbrand Safety Glasses | Fisher Scientific | 19-130-208X | PPE |
| Granger Stationary Vise | Fisher Scientific | NC1336173 | benchtop vise |
| Invitrogen UltraPure DNase/Rnase free distilled water | Fisher Scientific | 10-977-023 | |
| Jewellers Saw | Fisher Scientific | 50-949-231 | |
| Kimwipes | Sigma-Aldritch | Z188956 | |
| Labconco Purifier Logic Biosafety cabinet | Fisher Scientific | 30-368-1101 | |
| LookOut DNA Erase | Millipore Sigma | L9042-1L | |
| Medium weighing boat | Heathrow Scientific | HS120223 | |
| MSC 10pc plier/clamp set | Fisher Scientific | 50-129-5352 | Miscellaneous clamps/vise grips for securely holding samples while drilling/cutting |
| Sartorius Quintix Semi-Micro Balance | Fisher Scientific | 14-560-019 | enclosed balance |
| Tyvek coveralls with hood | Fisher Scientific | 01-361-7X | PPE |
| Weigh paper | Heathrow Scientific | HS120116 |
References
- Adler, C. J., Haak, W., Donlon, D., Cooper, A. Survival and recovery of DNA from ancient teeth and bones. Journal of Archaeological Science. 38 (5), 956-964 (2011).
- Dabney, J., Meyer, M. Extraction of highly degraded DNA from ancient bones and teeth. Ancient DNA: Methods and Protocols. , 25-29 (2019).
- Palsdottir, A. H., Bläuer, A., Rannamäe, E., Boessenkool, S., Hallsson, J. Not a limitless resource: ethics and guidelines for destructive sampling of archaeofaunal remains. Royal Society Open Science. 6 (10), 191059 (2019).
- Pinhasi, R., Fernandes, D. M., Sirak, K., Cheronet, O. Isolating the human cochlea to generate bone powder for ancient DNA analysis. Nature Protocols. 14 (4), 1194-1205 (2019).
- Latham, K. E., Miller, J. J. DNA recovery and analysis from skeletal material in modern forensic contexts. Forensic Sciences Research. 4 (1), 51-59 (2019).
- Mundorff, A. Z., Bartelink, E. J., Mar-Cash, E. DNA preservation in skeletal elements from the World Trade Center disaster: Recommendations for mass fatality management. Journal of Forensic Sciences. 54 (4), 739-745 (2009).
- Gamba, C., et al. Genome flux and stasis in a five millennium transect of European prehistory. Nature Communications. 5 (1), 1-9 (2014).
- Alberti, F., et al. Optimized DNA sampling of ancient bones using Computed Tomography scans. Molecular Ecology Resources. 18 (6), 1196-1208 (2018).
- Hansen, H. B., et al. Comparing ancient DNA preservation in petrous bone and tooth cementum. PLoS ONE. 12 (1), 0170940 (2017).
- Sirak, K., et al. Human auditory ossicles as an alternative optimal source of ancient DNA. Genome Research. 30 (3), 427-436 (2020).
- Parker, C., et al. A systematic investigation of human DNA preservation in medieval skeletons. Scientific Reports. 10 (1), 18225 (2020).
- Pinhasi, R., et al. Optimal ancient DNA yields from the inner ear part of the human petrous bone. PLoS ONE. 10 (6), 0129102 (2015).
- Sirak, K. A., et al. A minimally-invasive method for sampling human petrous bones from the cranial base for ancient DNA analysis. BioTechniques. 62 (6), 283-289 (2017).
- Orfanou, E., Himmel, M., Aron, F., Haak, W. Minimally-invasive sampling of pars petrosa (os temporale) for ancient DNA extraction. protocols.io. , Available from: https://www.protocols.io/view/minimally-invasive-sampling-of-pars-petrosa-os-tem-bqd8ms9w (2020).
- Damgaard, P. B., et al. Improving access to endogenous DNA in ancient bones and teeth. Scientific Reports. 5 (1), 1-12 (2015).
- Harney, É, et al. A minimally destructive protocol for DNA extraction from ancient teeth. Genome Research. 31 (3), 472-483 (2021).
- Cooper, A., Poinar, H. N. Ancient DNA: Do it right or not at all. Science. 289 (5482), 1139 (2000).
- Llamas, B., et al. From the field to the laboratory: Controlling DNA contamination in human ancient DNA research in the high-throughput sequencing era. STAR: Science & Technology of Archaeological Research. 3 (1), 1-14 (2017).
- Llamas, B., et al. From the field to the laboratory: Controlling DNA contamination in human ancient DNA research in the high-throughput sequencing era. STAR: Science & Technology of Archaeological Research. 3 (1), 1-14 (2017).
- Boessenkool, S., et al. Combining bleach and mild predigestion improves ancient DNA recovery from bones. Molecular Ecology Resources. 17 (4), 742-751 (2017).
- García-Garcerà, M., et al. Fragmentation of contaminant and endogenous DNA in ancient samples determined by shotgun sequencing; Prospects for human palaeogenomics. PLoS ONE. 6 (8), 24161 (2011).
- Malmström, H., et al. More on contamination: The use of asymmetric molecular behavior to identify authentic ancient human DNA. Molecular Biology and Evolution. 24 (4), 998-1004 (2007).
- Basler, N., et al. Reduction of the contaminant fraction of DNA obtained from an ancient giant panda bone. BMC Research Notes. 10, 754 (2017).
- Kemp, B. M., Smith, D. G. Use of bleach to eliminate contaminating DNA from the surface of bones and teeth. Forensic Science International. 154 (1), 53-61 (2005).
- Korlević, P., et al. Reducing microbial and human contamination in DNA extractions from ancient bones and teeth. BioTechniques. 59 (2), 87-93 (2015).
- Dabney, J., Meyer, M. Extraction of highly degraded DNA from ancient bones and teeth. Methods in Molecular Biology. 1963, 25-29 (2019).
- Hansen, H. B., et al. Comparing ancient DNA preservation in petrous bone and tooth cementum. PLoS ONE. 12 (1), 0170940 (2017).
- Gansauge, M. -T., et al. Single-stranded DNA library preparation from highly degraded DNA using T4 DNA ligase. Nucleic Acids Research. 45 (10), 79 (2017).
- Peltzer, A., et al. EAGER: efficient ancient genome reconstruction. Genome Biology. 17 (1), 60 (2016).
- Korneliussen, T. S., Albrechtsen, A., Nielsen, R. ANGSD: analysis of next generation sequencing data. BMC Bioinformatics. 15, 356 (2014).
- Renaud, G., Hanghøj, K., Willerslev, E., Orlando, L. Gargammel: A sequence simulator for ancient DNA. Bioinformatics. 33 (4), 577-579 (2017).
- Ponce de León, M. S., et al. Human bony labyrinth is an indicator of population history and dispersal from Africa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (16), 4128-4133 (2018).
- Nagaoka, T., Kawakubo, Y. Using the petrous part of the temporal bone to estimate fetal age at death. Forensic Science International. 248, 188 (2015).
- Norén, A., Lynnerup, N., Czarnetzki, A., Graw, M. Lateral angle: A method for sexing using the petrous bone. American Journal of Physical Anthropology. 128 (2), 318-323 (2005).
