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Genetics

पुरातात्विक अवशेषों से प्राचीन डीएनए की पुनर्प्राप्ति के लिए अनुकूलित हड्डी नमूनाकरण प्रोटोकॉल

Published: November 30, 2021 doi: 10.3791/63250
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1,3, 1,3
1Department of Archaeogenetics, Max Planck Institute for the Science of Human History, 2School of Human Evolution and Social Change, Arizona State University, 3Department of Archaeogenetics, Max Planck Institute for Evolutionary Anthropology

Summary

प्रोटोकॉल मध्ययुगीन व्यक्तियों से पांच अलग-अलग कंकाल तत्वों (1040-1400 सीई की अवधि के लिए रेडियोकार्बन दिनांकित, कैलिब्रेटेड 2-सिग्मा रेंज) में आठ अनुशंसित शारीरिक नमूना स्थानों (किसी दिए गए कंकाल तत्व पर विशिष्ट स्थान) से हड्डी पाउडर के संग्रह के लिए सर्वोत्तम अभ्यास प्रोटोकॉल की एक श्रृंखला प्रस्तुत करता है।

Abstract

यहां प्रस्तुत विधियां इनपुट नमूना सामग्री को सीमित करते हुए प्राचीन पुरातात्विक अवशेषों से मानव डीएनए की वसूली की संभावनाओं को अधिकतम करना चाहती हैं। यह कंकाल में डीएनए वसूली के तुलनात्मक विश्लेषण में प्राचीन डीएनए (एडीएनए) की उच्चतम मात्रा प्राप्त करने के लिए पहले निर्धारित शारीरिक नमूना स्थानों को लक्षित करके किया गया था। पूर्व अनुसंधान ने सुझाव दिया है कि ये प्रोटोकॉल पुरातात्विक अवशेषों से प्राचीन मानव और रोगज़नक़ डीएनए की सफल वसूली की संभावनाओं को अधिकतम करते हैं। डीएनए पैदावार का मूल्यांकन पहले पार्कर एट अल 2020 द्वारा मध्ययुगीन (लगभग 1040-1400 ईस्वी, कैलिब्रेटेड 2-सिग्मा रेंज) कब्रिस्तान से बरामद 11 व्यक्तियों के कई कंकाल तत्वों में एडीएनए संरक्षण के व्यापक सर्वेक्षण में किया गया था। इन आठ नमूना स्पॉट, जो पांच कंकाल तत्वों (पार्स पेट्रोसा, स्थायी दाढ़, वक्ष कशेरुक, डिस्टल फालैंक्स और टैलस) को फैलाते हैं, ने सफलतापूर्वक उच्च गुणवत्ता वाले प्राचीन मानव डीएनए का उत्पादन किया, जहां पैदावार सभी तत्वों और व्यक्तियों में समग्र औसत से काफी अधिक थी। सबसे आम डाउनस्ट्रीम जनसंख्या आनुवंशिक विश्लेषण में उपयोग के लिए पैदावार पर्याप्त थी। हमारे परिणाम पुरातात्विक अवशेषों से प्राचीन मानव डीएनए के विश्लेषण से जुड़े अधिकांश अध्ययनों के लिए इन शारीरिक नमूना स्थानों के अधिमान्य उपयोग का समर्थन करते हैं। इन विधियों के कार्यान्वयन से कीमती पुरातात्विक नमूनों के विनाश को कम करने में मदद मिलेगी।

Introduction

डीएनए पुनर्प्राप्ति और विश्लेषण के प्रयोजनों के लिए प्राचीन मानव अवशेषों का नमूना स्वाभाविक रूप से विनाशकारी है 1,2,3,4. नमूने स्वयं कीमती नमूने हैं और रूपात्मक संरक्षण को जहां भी संभव हो संरक्षित किया जाना चाहिए। इस प्रकार, यह जरूरी है कि नमूना प्रथाओं को अपूरणीय सामग्री के अनावश्यक विनाश से बचने और सफलता की संभावना को अधिकतम करने के लिए अनुकूलित किया जाए। वर्तमान सर्वोत्तम अभ्यास तकनीकें या तो फोरेंसिक सर्वेक्षण 5,6 तक सीमित अध्ययनों के एक छोटे समूह पर आधारित हैं, प्राचीन नमूनों के अध्ययन जहां इष्टतम नमूनाकरण का विकास अध्ययन 7 का प्रत्यक्ष उद्देश्य नहीं है, या गैर-मानवअवशेषों का उपयोग करने वाले समर्पित अध्ययन8 या शारीरिक नमूना स्थानों के बहुत छोटे चयन को लक्षित करते हैं (यहां कंकाल तत्व के एक विशिष्ट क्षेत्र को निरूपित करने के लिए उपयोग किया जाता है जिसमें से हड्डी पाउडर, डाउनस्ट्रीम डीएनए विश्लेषण में उपयोग के लिए, उत्पन्न किया गया था) 9,10। यहां प्रस्तुत नमूना प्रोटोकॉल को कई व्यक्तियों से कई कंकाल तत्वों में डीएनए संरक्षण के पहले बड़े पैमाने पर व्यवस्थित अध्ययन में अनुकूलितकिया गया था। सभी नमूने जर्मनी के सैक्सोनी-अनहाल्ट के पेइसेन के पास क्राकाउर बर्ग की परित्यक्त मध्ययुगीन बस्ती के चर्च कब्रिस्तान से खुदाई किए गए 11 व्यक्तियों से प्राप्त कंकाल तत्वों से उपजे हैं (विस्तृत नमूना जनसांख्यिकी के लिए तालिका 1 देखें) और इस प्रकार, इस भौगोलिक / अस्थायी सीमा के बाहर नमूनों के साथ उपयोग के लिए संशोधन की आवश्यकता हो सकती है।

व्यक्ति लिंग मृत्यु पर अनुमानित आयु 14 सी तिथियां (सीई, कैल 2-सिग्मा)
KRA001 नर 25-35 1058-1219
KRA002 मादा 20-22 1227-1283
KRA003 नर 25 1059-1223
KRA004 नर 15 1284-1392
KRA005 नर 10-12 1170-1258
KRA006 मादा 30-40 1218-1266
KRA007 मादा 25-30 1167-1251
KRA008 नर 20 1301-1402
KRA009 नर अज्ञात 1158-1254
KRA010 नर 25 1276-1383
KRA011 मादा 30-45 1040-1159

तालिका 1: आनुवंशिक रूप से निर्धारित लिंग, पुरातात्विक रूप से मृत्यु पर अनुमानित आयु, और सभी 11 व्यक्तियों के लिए रेडियोकार्बन डेटिंग (14 सी कैल 2-सिग्मा)। इस तालिका को पार्कर, सी. एट अल. 202011 से अनुकूलित किया गया है।

ये प्रोटोकॉल सीमित प्रयोगशाला-प्रेरित डीएनए संदूषण के साथ पांच कंकाल तत्वों (पार्स पेट्रोसा सहित) में आठ शारीरिक नमूना स्थानों से हड्डी पाउडर की अपेक्षाकृत सीधी और कुशल पीढ़ी की अनुमति देते हैं। इन पांच कंकाल तत्वों में से, चार कंकाल तत्वों पर पाए गए सात शारीरिक नमूना स्थानों को पेट्रोस पिरामिड11,12 के विनाशकारी नमूने के व्यवहार्य विकल्प के रूप में निर्धारित किया गया है। इनमें स्थायी दाढ़ के सीमेंटम, डेंटिन और लुगदी कक्ष शामिल हैं; कॉर्टिकल हड्डी बेहतर कशेरुका पायदान के साथ-साथ वक्ष कशेरुक के शरीर से एकत्र होती है; एपिकल टफ्ट की अवर सतह और डिस्टल फालैंग्स की शाफ्ट से उपजी कॉर्टिकल हड्डी; और ताली के बाहरी हिस्से के साथ घनी कॉर्टिकल हड्डी। जबकि पार्स पेट्रोसा 4,12,13,14, डेंटिन और डेंटल पल्पचैंबर 1,2,15 के नमूने के लिए कई व्यापक रूप से लागू तरीके हैं, सीमेंटम16 से हड्डी पाउडर की सफल पीढ़ी का वर्णन करने वाले प्रकाशित तरीके , कशेरुक शरीर, अवर कशेरुका पायदान, और तालस प्राप्त करना मुश्किल हो सकता है। जैसे, यहां हम पेट्रोस पिरामिड (चरण 3.1) के लिए अनुकूलित नमूना प्रोटोकॉल प्रदर्शित करते हैं; वयस्क दाढ़ के सीमेंटम (चरण 3.2.1), डेंटिन (चरण 3.2.2), और दंत लुगदी (चरण 3.2.3); कशेरुक शरीर की कॉर्टिकल हड्डी (चरण 3.3.1) और बेहतर कशेरुक मेहराब (चरण 3.3.2); डिस्टल फालैंक्स (चरण 3.4); और एडीएनए और फोरेंसिक अनुसंधान दोनों के लिए इन कंकाल तत्वों के प्रभावी उपयोग को अधिक व्यापक रूप से सुलभ बनाने के लिए टैलस (चरण 3.5)।

Protocol

यहां प्रस्तुत सभी शोध प्राचीन मानव अवशेषों के साथ काम करने के लिए मैक्स प्लैंक इंस्टीट्यूट फॉर द साइंस ऑफ ह्यूमन हिस्ट्री, जेना, जर्मनी द्वारा निर्धारित दिशानिर्देशों के अनुपालन में किए गए थे। इस प्रोटोकॉल के किसी भी चरण को करने से पहले वैज्ञानिक अध्ययन के लिए अनुमति प्राप्त करने और अपने क्षेत्र में विनाशकारी नमूने के लिए मानव अवशेषों के उपयोग से संबंधित सभी स्थानीय / राज्य / संघीय नैतिक आवश्यकताओं का पालन करना सुनिश्चित करें। रासायनिक भंडारण व्यक्तिगत संस्थागत सुरक्षा दिशानिर्देशों के अनुसार किया जाना चाहिए।

1. नमूना प्रसंस्करण से पहले विचार

  1. प्राचीन अवशेषों के रूप में देखभाल के साथ नमूनों का इलाज करना एक अपरिवर्तनीय और परिमित संसाधन है (उदाहरण के लिए, नमूनाकरण जितना संभव हो उतना कम से कम बेकार होना चाहिए, और यदि संभव हो तो सभी अवशेष अपने संबंधित और वैध प्रदाताओं को वापस कर दिए जाने चाहिए)।
  2. एक स्वच्छ कमरे के वातावरण में सभी चरणों का प्रदर्शन करें, अधिमानतः एक समर्पित प्राचीन डीएनए सुविधा 17,18,19 पर। व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) का उपयोग करें जिसमें हुड के साथ बाँझ माइक्रोपोरस कवरऑल, बाँझ दस्ताने (दो जोड़े), सर्जिकल मास्क, सुरक्षात्मक चश्मा, और बाँझ जूते या बाँझ कवर के साथ गैर-स्लिप जूते शामिल हैं (सामग्री की तालिका देखें)। दस्ताने को अक्सर बदलें, खासकर नमूनों के बीच।
  3. सभी उपकरणों और सतहों को ब्लीच / डीएनए परिशोधन समाधान / इथेनॉल और यूवी विकिरण (तरंग दैर्ध्य: 254 एनएम) के साथ अच्छी तरह से साफ और कीटाणुरहित करें (उदाहरण के लिए, ड्रिल बिट्स, ड्रिल, विस / क्लैंप, आदि)। अंत में, साफ कमरे के वातावरण के कारण अति-थकावट से बचने के लिए नियमित एर्गोनोमिक ब्रेक (यदि संभव हो तो हर 2-3 घंटे) लेने की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है।
    नोट: नमूना लेने से पहले सभी कंकाल अवशेषों को उचित रूप से प्रलेखित किया जाना चाहिए (उदाहरण के लिए, फोटो खिंचवाना, वजन करना, और यदि संभव हो तो माइक्रो-सीटी स्कैन, 3 डी इमेज, आदि) (उपयुक्त प्रलेखन के लिए प्रोटोकॉल इस पांडुलिपि में शामिल नहीं हैं)। सभी नमूना प्रोटोकॉल को नमूना पुनरावृत्तियों के बीच रोका जा सकता है और नमूनों को शुष्क, तापमान नियंत्रित (25 डिग्री सेल्सियस), बाँझ वातावरण में अनिश्चित काल तक संग्रहीत किया जा सकता है।

2. पूर्व-उपचार

  1. संदूषण के जोखिम को कम करने के लिए हड्डी पाउडर उत्पादन से पहले सभी शारीरिक नमूना स्थानों को अलग करें।
    नोट: नमूना परिशोधन के लिए ब्लीच और / या सतह हटाने की प्रभावकारिता (सतह हटाने के चरणों के लिए चरण 3.3.2 में नोट देखें) अभी भी एडीएनए शोधकर्ताओं 8,19,20,21,22,23,24,25 के बीच बहस का विषय है क्योंकि दोनों समग्र डीएनए पैदावार को प्रभावित कर सकते हैं, खासकर अत्यधिक अवक्रमित नमूनों में। जैसे, निम्नलिखित चरणों को वैकल्पिक माना जाता है और यहां शामिल किया जाता है क्योंकि उनका उपयोग इस पेपर में प्रस्तुत प्रतिनिधि परिणामों को उत्पन्न करने के लिए सभी नमूनों में किया गया था। यह अनुशंसा की जाती है कि इन पूर्व-उपचार प्रोटोकॉल का उपयोग आणविक अनुप्रयोग, आयु, दुर्लभता और प्रत्येक नमूना सेट के रूपात्मक गिरावट के स्तर के आधार पर मामला-दर-मामला आधार पर निर्धारित किया जाए।
    1. एयरफ्लो बंद होने के साथ यूवी लाइट से लैस पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) हुड या बायोसेफ्टी कैबिनेट के तहत एक समर्पित साफ कमरे में सभी नमूने करें। किसी भी आवारा हड्डी पाउडर / टुकड़ों को पकड़ने के लिए बेंचटॉप पर बाँझ एल्यूमीनियम पन्नी फैलाएं।
    2. सुनिश्चित करें कि पन्नी के निपटान से पहले हड्डी के सभी टुकड़े बरामद किए गए हैं (प्रत्यावर्तन के लिए)। प्रत्येक कंकाल तत्व के उपचार के बीच पन्नी बदलें। इस्तेमाल की गई पन्नी को एक आटोक्लेवेबल बायोहाजार्ड बैग/रिसेप्टेकल में रखें।
    3. शारीरिक नमूना स्थानों से जितना संभव हो उतना ढीली गंदगी / डिट्रिटस को हटा दें, धीरे से एक लिंट-मुक्त शुष्क बाँझ पोंछे के साथ क्षेत्र को पोंछकर ( सामग्री की तालिका देखें)। आटोक्लेवेबल बायोहाजार्ड बैग या रिसेप्टेकल्स में वाइप्स का निपटान करें।
    4. पतला वाणिज्यिक ब्लीच (~ 0.01% v/v, अल्ट्राप्योर DNase/RNase मुक्त पानी से पतला) के साथ गीले बाँझ पोंछे से पोंछकर साफ की गई सतह को दूषित करें और 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करने की अनुमति दें। आटोक्लेवेबल बायोहाजार्ड बैग या रिसेप्टेकल्स में वाइप्स का निपटान करें।
      चेतावनी: ब्लीच एक अत्यधिक संक्षारक और प्रतिक्रियाशील रसायन है; इसलिए इसके उपयोग से पहले उचित सुरक्षा सावधानियां बरती जानी चाहिए।
    5. अल्ट्राप्योर डीनेस/आरएनएस-मुक्त पानी से नम बाँझ पोंछे के साथ शारीरिक नमूना स्थान से जितना संभव हो उतना अवशिष्ट ब्लीच निकालें। आटोक्लेवेबल बायोहाजार्ड बैग या रिसेप्टेकल्स में वाइप्स का निपटान करें।
    6. 30 मिनट (तरंगदैर्ध्य: 254 एनएम) के लिए यूवी विकिरण के लिए सभी साफ शारीरिक नमूना स्थानों को उजागर करें, और फिर कमरे के तापमान पर पूरी तरह से सूखने की अनुमति दें। सुनिश्चित करें कि नमूनाकरण के साथ आगे बढ़ने या भंडारण पर लौटने से पहले शारीरिक नमूना स्थान पूरी तरह से सूख गए हैं ताकि न केवल हड्डी पाउडर उत्पादन आसान हो सके, बल्कि नमूने के आगे के क्षरण को भी रोका जा सके (जैसे, मोल्ड)।
      सावधानी: यूवी विकिरण के संपर्क में आंखों के लिए हानिकारक हो सकता है।
    7. सूखे, तापमान नियंत्रित (25 डिग्री सेल्सियस) बाँझ वातावरण में कंकाल तत्वों को नमूना लेने या संग्रहीत करने के लिए तुरंत जाएं।

3. हड्डी पाउडर उत्पादन

नोट: निम्नलिखित प्रोटोकॉल डबनी एट अल 2019 प्रोटोकॉल26 के बाद डीएनए निष्कर्षण में उपयोग के लिए अभिप्रेत हैं।

  1. का नमूना pars petrosa
    नोट: यह प्रोटोकॉल पिनासी एट अल 2019 में वर्णित प्रक्रियाओं से अनुकूलित है4 और उपयोग में आसानी के लिए यहां प्रस्तुत किया गया है। यह प्रोटोकॉल नमूने के लिए वर्तमान, कम से कम विनाशकारी विधि का प्रतिनिधित्व नहीं करता है pars petrosa. जैसे, सिरक एट अल 2017 द्वारा वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।13 या ऑर्फानो एट अल।14 नमूनों के लिए जहां रूपात्मक संरक्षण अधिकतम महत्व का है।
    1. एयरफ्लो बंद होने के साथ यूवी लाइट से लैस पीसीआर हुड या बायोसेफ्टी कैबिनेट (तरंग दैर्ध्य: 254 एनएम) के तहत एक समर्पित साफ कमरे में सभी नमूने करें। किसी भी आवारा हड्डी पाउडर / टुकड़ों को पकड़ने के लिए बेंचटॉप पर बाँझ एल्यूमीनियम पन्नी फैलाएं।
    2. सुनिश्चित करें कि पन्नी के निपटान से पहले सभी हड्डी के टुकड़े और जितना संभव हो उतना पाउडर बरामद किया जाए (प्रत्यावर्तन के लिए)। प्रत्येक नमूने के बीच पन्नी बदलें। इस्तेमाल की गई पन्नी को एक ऑटोक्लेवेबल बायोहाजार्ड बैग / रिसेप्टेकल में निपटाएं।
    3. एक निष्फल क्लैंप या विज़ का उपयोग करके सूखे, दूषित तत्व को सुरक्षित करें।
    4. ओवरहीटिंग से बचने के लिए मध्यम गति पर 0.6 मिमी ब्लेड (सामग्री की तालिका देखें) से लैस मानक ज्वैलर्स आरी का उपयोग करके बेहतर सल्कस पेट्रोसस (चित्रा 1 देखें) के साथ पार्स पेट्रोसा को आधे में काट लें (चरण 3.1.6 के नीचे नोट देखें)।
      सावधानी: पार्स पेट्रोसा बहुत घना है, और इस तरह काटना मुश्किल हो सकता है। चोट से बचने के लिए तत्व को सुरक्षित रूप से दबाकर रखने का ध्यान रखें। किसी भी टूटे हुए ब्लेड को उपयुक्त शार्प्स के रिसेप्टेक में निपटाएं।
    5. क्लैंप से पेट्रोस भागों को हटा दें। किसी भी ढीली/अतिरिक्त सामग्री को पुनर्प्राप्त करें और बचाएं।
    6. बाँझ वजन वाली नाव में वजन कागज रखें
    7. वजन कागज के ऊपर पेट्रोस भाग को पकड़ें, वजन ट्रे की ओर झुके हुए किनारे को काटें। चेहरे की नहर और मास्टोइड एंट्रम के बीच घनी कॉर्टिकल हड्डी में ड्रिल करें (आसपास की सामग्री की तुलना में चमकदार प्रतीत होता है, चित्र 1 देखें) एक छोटे गेज बिट ( सामग्री की तालिका देखें) से लैस दंत ड्रिल का उपयोग करें और हड्डी पाउडर का उत्पादन करने के लिए मध्यम गति, मध्यम टोक़ पर सेट करें।
      नोट: ड्रिलिंग / कटिंग को हड्डी को गर्म करने और संभावित रूप से नष्ट / हानिकारक डीएनए से बचने के लिए कम से मध्यम गति से छोटे विस्फोट में किया जाना चाहिए। उपाख्यानात्मक रूप से, जब पेट्रोस का घना हिस्सा खाना पकाने के बेकन के रूप में वर्णित गंध को अधिक गर्म करना शुरू कर देता है, तो देखा जा सकता है। तुरंत ड्रिलिंग / आरा बंद करें और हड्डी को फिर से शुरू करने से पहले पर्याप्त रूप से ठंडा होने तक आराम करने दें।
    8. ड्रिलिंग को तब तक दोहराएं जब तक कि वजन कागज में लगभग 50-100 मिलीग्राम पाउडर एकत्र नहीं किया जाता है, जैसा कि कम से कम 0.01 मिलीग्राम तक सटीक संलग्न संतुलन का उपयोग करके मापा जाता है ( सामग्री की तालिका देखें)।
      नोट: जहां संभव हो 100 मिलीग्राम हड्डी पाउडर इकट्ठा करने का सुझाव दिया जाता है ताकि प्रत्येक 50 मिलीग्राम के दो प्रतिकृति डीएनए निष्कर्षण की अनुमति मिल सके। हालांकि, यह हमेशा शारीरिक नमूना स्थानों की सीमा (जैसे, डिस्टल फालैंक्स, डेंटल पल्प चैंबर) या रूपात्मक संरक्षण की आवश्यकता के आधार पर संभव नहीं हो सकता है। अन्य स्थानों के लिए, जैसे कि सीमेंटम, 50 मिलीग्राम से काफी कम सामग्री उपलब्ध हो सकती है। हालांकि, निष्कर्षण प्रक्रिया से हड्डी पाउडर के कम प्रारंभिक इनपुट के बावजूद, सीमेंटम, दंत लुगदी कक्ष, और डिस्टल फालैंक्स सभी को महत्वपूर्ण अंतर्जात डीएनए 11,27,28 उत्पन्न करने के लिए दिखाया गया है।
    9. निष्कर्षण या भंडारण के लिए वजन कागज से पाउडर को 2 एमएल लेबल वाले कम-बिंद, सुरक्षित-लॉक ट्यूब में स्थानांतरित करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर नमूने स्टोर करें, अनिश्चित काल तक।
    10. शेष हड्डी / अतिरिक्त पाउडर को सूखे, तापमान नियंत्रित (25 डिग्री सेल्सियस) बाँझ वातावरण में स्टोर करें जब तक कि वापसी / प्रत्यावर्तन पूरा नहीं हो जाता।
    11. सभी कचरे को ऑटोक्लेवेबल बायोहाजार्ड बैग या रिसेप्टेकल्स में निपटाएं। प्रत्येक नमूने के बीच ब्लीच/डीएनए परिशोधन समाधान/इथेनॉल और यूवी (तरंगदैर्ध्य: 254 एनएम) एक्सपोजर का उपयोग करके सभी पुन: प्रयोज्य उपकरणों (जैसे, क्लैंप, ड्रिल बिट्स, ड्रिल, आरी, आदि) को निष्फल /

Figure 1
चित्र 1: पार्स पेट्रोसा सहित अस्थायी हड्डी। (ए) पेट्रोस पिरामिड और सल्कस पेट्रोसा के स्थानों को दर्शाते हुए नमूना पूर्व-कटाई। (ख) पेट्रोस भाग कटाई के बाद सघन क्षेत्रों को उजागर करना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. स्थायी दाढ़ का नमूना
    नोट: स्थायी दाढ़ के नमूने के लिए, पूर्व-चयन करें in situ फ्यूज्ड जड़ों वाले दाढ़ और आदर्श रूप से क्षरण, तामचीनी में दरारें, या सर्वोत्तम परिणामों के लिए अत्यधिक घिसने से रहित होते हैं। किसी भी दंत पथरी के नमूने को हटा दें और मौखिक माइक्रोबायोम (प्रक्रिया यहां कवर नहीं की गई है) के संभावित भविष्य के विश्लेषण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    1. सीमेंटम का नमूना
      1. एयरफ्लो बंद होने के साथ यूवी लाइट से लैस पीसीआर हुड या बायोसेफ्टी कैबिनेट (तरंग दैर्ध्य: 254 एनएम) के तहत एक समर्पित साफ कमरे में सभी नमूने करें। किसी भी आवारा हड्डी पाउडर / टुकड़ों को पकड़ने के लिए बेंचटॉप पर बाँझ एल्यूमीनियम पन्नी फैलाएं।
      2. सुनिश्चित करें कि पन्नी के निपटान से पहले सभी हड्डी के टुकड़े और जितना संभव हो उतना पाउडर बरामद किया गया है (प्रत्यावर्तन के लिए)। प्रत्येक नमूने के बीच पन्नी बदलें। इस्तेमाल की गई पन्नी को एक आटोक्लेवेबल बायोहाजार्ड बैग/रिसेप्टेकल में रखें।
      3. वजन कागज की एक शीट को बाँझ वजन ट्रे में रखें।
      4. एक समायोज्य रिंच जैसे हाथ से पकड़े गए क्लैंप का उपयोग करके तौल ट्रे के ऊपर तामचीनी द्वारा परिशोधनित दाढ़ को पकड़ें / सुरक्षित करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
      5. हीरे की धार वाले गोलाकार कटिंग व्हील के साथ एक दंत ड्रिल को लैस करें। ड्रिल को मध्यम गति / टोक़ सेटिंग पर सेट करने के साथ, लगभग -20 ° के कोण पर बिट के किनारे को जड़ तक हल्के से स्पर्श करें।
      6. जड़ (सीमेंटम) से पीले, सबसे बाहरी सामग्री को हटाने / इकट्ठा करने के लिए ट्रे में नीचे की ओर खुरचें। जब डेंटिन की हल्की (सफेद) सामग्री दिखाई देती है तो संग्रह बंद कर दें।
        नोट: पाउडर को एरोसोलाइज्ड होने से बचाने और ट्रे को पूरी तरह से गायब करके नमूने को संभावित रूप से बर्बाद करने से बचने के लिए संग्रह ट्रे के संबंध में कटिंग बिट के रोटेशन की दिशा से मेल खाना महत्वपूर्ण है। सीमेंटम विशेष रूप से डीएनए में समृद्ध है; हालांकि, सामग्री की विशिष्ट पैदावार अन्य शारीरिक नमूना स्थानों (~ 7-20 मिलीग्राम) 11,27,28 की तुलना में बहुत छोटी है।
      7. कम से कम 0.01 मिलीग्राम तक सटीक संलग्न संतुलन का उपयोग करके वजन कागज में एकत्र किए गए पाउडर का रिकॉर्ड द्रव्यमान ( सामग्री की तालिका देखें)।
      8. निष्कर्षण के लिए वजन कागज से पाउडर को 2 एमएल कम-बिंद, सुरक्षित लॉक ट्यूब में स्थानांतरित करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, अनिश्चित काल के लिए।
    2. लुगदी कक्ष का नमूना
      1. सीमेंटम एकत्र होने के बाद (यदि वांछित हो), मुकुट को हटाने के लिए एक जौहरी की आरी का उपयोग करके सीमेंटो-तामचीनी जंक्शन के साथ दाढ़ को खंडित करें ( चित्र 2 देखें)।
      2. एक नई वजन ट्रे में वजन कागज की एक नई शीट रखें।
      3. वजन ट्रे के ऊपर, क्राउन सेक्शन को हैंडहेल्ड क्लैंप या विस में सुरक्षित करें। कट साइड को नीचे की ओर झुकाएं और ड्रिल /स्क्रैप सामग्री को पहले पास के रूप में क्राउन भाग के भीतर लुगदी कक्ष के किनारों के साथ एक छोटे गेज ड्रिलिंग बिट ( सामग्री की तालिका देखें) से लैस दंत ड्रिल के साथ रखें ( चित्र 2 देखें)।
        नोट: लुगदी कक्ष के इंटीरियर के केवल पहले पास को एकत्र किया जाना है और लुगदी सामग्री (5-15 मिलीग्राम विशिष्ट उपज) के रूप में लेबल किया जाना है, दांत में गहराई से कुछ भी डेंटिन माना जाता है।
      4. दांत को निचले हिस्से के साथ घुमाएं, हथौड़े से क्लैंप को टैप करें, और वजन कागज पर मुक्त पाउडर इकट्ठा करें।
      5. कम से कम 0.01 मिलीग्राम के लिए सटीक संलग्न संतुलन का उपयोग करके वजन कागज में एकत्र किए गए पाउडर के वजन को रिकॉर्ड करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
      6. निष्कर्षण के लिए वजन कागज से पाउडर को 2 एमएल कम-बिंद, सुरक्षित-लॉक ट्यूब में स्थानांतरित करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, अनिश्चित काल के लिए।
    3. डेंटिन का नमूना
      1. एक नई वजन ट्रे में वजन कागज की एक नई शीट रखें।
      2. वजन ट्रे (चरण 3.2.2.3 के अनुसार) के ऊपर क्राउन सेक्शन रखें, ड्रिल करें और आगे डेंटिन नमूने के लिए उसी तरह से लुगदी कक्ष के इंटीरियर से 0.01 मिलीग्राम ( सामग्री की तालिका देखें) तक सटीक संलग्न संतुलन का उपयोग करके मापा गया 50-100 मिलीग्राम डेंटिन एकत्र करें ( चित्र 2 देखें)।
      3. निष्कर्षण के लिए वजन कागज से हड्डी पाउडर को 2 एमएल कम-बिंद, सुरक्षित-लॉक ट्यूब में स्थानांतरित करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, अनिश्चित काल के लिए।
      4. शेष दांतों के टुकड़ों / अतिरिक्त पाउडर को सूखे, तापमान नियंत्रित (25 डिग्री सेल्सियस) बाँझ वातावरण में स्टोर करें जब तक कि वापसी / प्रत्यावर्तन पूरा नहीं हो जाता।
      5. सभी कचरे को ऑटोक्लेवेबल बायोहाजार्ड बैग या रिसेप्टेकल्स में निपटाएं। प्रत्येक नमूने के बीच लागू ब्लीच/डीएनए परिशोधन समाधान/इथेनॉल और यूवी (तरंगदैर्ध्य: 254 एनएम) एक्सपोजर का उपयोग करके सभी पुन: प्रयोज्य उपकरणों (जैसे, क्लैंप, ड्रिल बिट्स, ड्रिल, आरी, आदि) को निष्फल /

Figure 2
चित्र 2: स्थायी मोलर पूर्व-नमूनाकरण। (ए) नमूना लेने से पहले पूर्व-उपचारित दाढ़, मुकुट, सीमेंटम (जड़ की पीली परत), और सीमेंटो-तामचीनी जंक्शन पर काटने की जगह को दर्शाता है। (बी) एक ही मोलर पोस्ट-सीमेंटम संग्रह, जो सीमेंटो-तामचीनी जंक्शन पर कट साइट को दर्शाता है। (सी) दाढ़ पोस्ट-कटिंग और नमूनाकरण जो मुकुट के भीतर दंत लुगदी कक्ष और डेंटिन के लिए शारीरिक नमूना स्थानों को दर्शाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. वक्षीय कशेरुकाओं का नमूना
    1. कशेरुक शरीर का नमूना
      1. एयरफ्लो बंद होने के साथ यूवी लाइट से लैस पीसीआर हुड या बायोसेफ्टी कैबिनेट (तरंग दैर्ध्य: 254 एनएम) के तहत एक समर्पित साफ कमरे में सभी नमूने करें। किसी भी आवारा हड्डी पाउडर / टुकड़ों को पकड़ने के लिए बेंचटॉप पर बाँझ एल्यूमीनियम पन्नी फैलाएं।
      2. सुनिश्चित करें कि पन्नी के निपटान से पहले सभी हड्डी के टुकड़े और जितना संभव हो उतना पाउडर बरामद किया गया है (प्रत्यावर्तन के लिए)। प्रत्येक नमूने के बीच पन्नी बदलें। इस्तेमाल की गई पन्नी को एक आटोक्लेवेबल बायोहाजार्ड बैग/रिसेप्टेकल में रखें।
      3. वजन कागज की एक छोटी शीट को एक मानक वजन ट्रे में रखें।
      4. कशेरुका शरीर को बाहर की ओर, क्लैंप या हाथ की छड़ी के साथ सुरक्षित करें।
      5. कशेरुका शरीर को नीचे की ओर झुकाकर वजन वाली ट्रे के ऊपर कशेरुका को पकड़ें। कम गति वाले उच्च टोक़ के लिए सेट किए गए एक छोटे गेज ड्रिलिंग बिट ( सामग्री की तालिका देखें) से लैस एक दंत ड्रिल का उपयोग करते हुए, कशेरुक शरीर के कैनसेलस आंतरिक ऊतक के आसपास कॉर्टिकल हड्डी के सबसे बाहरी रिम (अवर और बेहतर) के साथ ड्रिल करें ( चित्र 3 देखें)।
      6. एक मानक भार ट्रे पर कॉर्टिकल परत के खिलाफ बिट को तब तक खुरचें जब तक कि 50-100 मिलीग्राम सामग्री एकत्र न हो जाए, जैसा कि 0.01 मिलीग्राम तक सटीक संलग्न संतुलन का उपयोग करके मापा जाता है ( सामग्री की तालिका देखें)।
      7. निष्कर्षण के लिए वजन कागज से हड्डी पाउडर को 2 एमएल कम-बिंद, सुरक्षित लॉक ट्यूब में स्थानांतरित करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, अनिश्चित काल के लिए।
    2. बेहतर कशेरुक मेहराब का नमूना
      नोट: यह चरण वैकल्पिक है। सतह19 के साथ स्क्रैप करके एक छोटे गेज ड्रिलिंग बिट (सामग्री की तालिका देखें) से लैस दंत ड्रिल का उपयोग करके बेहतर कशेरुक मेहराब की कॉर्टिकल हड्डी की सबसे बाहरी परत को हटा दें और छोड़ दें। यह कशेरुक शरीर से नमूना लेने के लिए सुझाव नहीं दिया जाता है, क्योंकि कॉर्टिकल हड्डी की परत आम तौर पर बहुत पतली होती है और इस प्रक्रिया से पूरी तरह से समाप्त होने की संभावना होती है (अनुभाग 2 में नोट देखें)।
      1. वजन कागज की एक छोटी शीट को एक मानक वजन ट्रे में रखें।
      2. कशेरुका प्रक्रिया को बाहर की ओर, बेहतर पहलू के साथ एक हाथ क्लैंप /विस में सुरक्षित करें।
      3. कशेरुकाओं को नीचे रखते हुए, एक वजन वाली ट्रे के ऊपर, एक छोटे गेज बिट (सामग्री की तालिका देखें) के साथ एक दंत ड्रिल का उपयोग करके लैमेला के साथ स्पिनस प्रक्रिया के संलयन द्वारा गठित वी आकार की नॉच के केंद्र में ऊपर की ओर ड्रिल करें (चित्र 3 देखें) जो कम गति और उच्च टोक़ पर सेट है।
      4. प्रतिरोध में ध्यान देने योग्य गिरावट होने पर ड्रिलिंग बंद करें। ड्रिलिंग स्थिति को थोड़ा बदलें और 50-100 मिलीग्राम हड्डी पाउडर एकत्र होने तक दोहराएं, जैसा कि 0.01 मिलीग्राम तक सटीक संलग्न संतुलन का उपयोग करके मापा जाता है ( सामग्री की तालिका देखें)।
      5. निष्कर्षण के लिए वजन कागज से हड्डी पाउडर को 2 एमएल कम-बाइंड ट्यूब में स्थानांतरित करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, अनिश्चित काल के लिए।
      6. शेष हड्डी / अतिरिक्त पाउडर को सूखे, तापमान नियंत्रित (25 डिग्री सेल्सियस) बाँझ वातावरण में वापसी / प्रत्यावर्तन तक स्टोर करें।
      7. सभी कचरे को ऑटोक्लेवेबल बायोहाजार्ड बैग या रिसेप्टेकल्स में निपटाएं। प्रत्येक नमूने के बीच ब्लीच/डीएनए परिशोधन समाधान/इथेनॉल और यूवी (तरंगदैर्ध्य: 254 एनएम) एक्सपोजर का उपयोग करके सभी पुन: प्रयोज्य उपकरणों (जैसे, क्लैंप, ड्रिल बिट्स, ड्रिल, आरी, आदि) को निष्फल /

Figure 3
चित्र 3: कशेरुका शरीर और वक्ष कशेरुका के बेहतर कशेरुका आर्क कॉर्टिकल हड्डी शारीरिक नमूना स्थान। कृपया इस आकृति के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. डिस्टल फालेंक्स का नमूना
    नोट: यह चरण वैकल्पिक है। शाफ्ट और/या एपिकल टफ्ट की कॉर्टिकल हड्डी की सबसे बाहरी परत को सतहके साथ स्क्रैप करके एक छोटे गेज ड्रिलिंग बिट से लैस डेंटल ड्रिल का उपयोग करके हटा दें और छोड़ दें। यह अत्यधिक पतली कॉर्टिकल हड्डी या किशोर अवशेषों वाले नमूनों के लिए संभव नहीं हो सकता है (अनुभाग 2 में नोट देखें)।
    1. एयरफ्लो बंद होने के साथ यूवी लाइट से लैस पीसीआर हुड या बायोसेफ्टी कैबिनेट (यूवी तरंग दैर्ध्य: 254 एनएम) के तहत एक समर्पित साफ कमरे में सभी नमूने लें। किसी भी आवारा हड्डी पाउडर / टुकड़ों को पकड़ने के लिए बेंचटॉप पर बाँझ एल्यूमीनियम पन्नी फैलाएं।
    2. सुनिश्चित करें कि पन्नी के निपटान से पहले सभी हड्डी के टुकड़े और जितना संभव हो उतना पाउडर बरामद किया गया है (प्रत्यावर्तन के लिए)। प्रत्येक नमूने के बीच पन्नी बदलें। इस्तेमाल की गई पन्नी को एक आटोक्लेवेबल बायोहाजार्ड बैग/रिसेप्टेकल में रखें।
    3. वजन कागज की एक छोटी शीट को एक मानक वजन ट्रे में रखें।
    4. नमूने को हैंडहेल्ड क्लैंप /विस में सुरक्षित करें, ऊपर की ओर बेहतर पक्ष।
    5. वजन ट्रे के ऊपर नमूने को पकड़ें, एक छोटे गेज ड्रिलिंग बिट से सुसज्जित दंत ड्रिल का उपयोग करके सबसे बाहरी घनी परतों के माध्यम से ड्रिलिंग करके एपिकल टफ्ट और शाफ्ट के अवर पक्ष से कॉर्टिकल हड्डी से हड्डी पाउडर एकत्र करें (चित्र 4 देखें)।
    6. प्रतिरोध में उल्लेखनीय कमी होने पर ड्रिलिंग बंद कर दें, क्योंकि यह हल्का, कैंसेलस सामग्री को दर्शाता है। इस प्रक्रिया को दोहराएं, प्रारंभिक ड्रिलिंग से बाहर की ओर विकिरण करें जब तक कि कम से कम 50-100 मिलीग्राम हड्डी पाउडर एकत्र नहीं हो जाता है, जैसा कि 0.01 मिलीग्राम तक सटीक संलग्न संतुलन का उपयोग करके मापा जाता है ( सामग्री की तालिका देखें)।
    7. निष्कर्षण के लिए वजन कागज से हड्डी पाउडर को 2 एमएल कम-बिंद, सुरक्षित-लॉक ट्यूब में स्थानांतरित करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, अनिश्चित काल के लिए।
    8. शेष हड्डी / अतिरिक्त पाउडर को एक सूखे, तापमान नियंत्रित (25 डिग्री सेल्सियस) बाँझ वातावरण में वापसी / प्रत्यावर्तन तक स्टोर करें।
    9. सभी कचरे को ऑटोक्लेवेबल बायोहाजार्ड बैग या रिसेप्टेकल्स में निपटाएं। प्रत्येक नमूने के बीच ब्लीच/डीएनए परिशोधन समाधान/इथेनॉल और यूवी एक्सपोजर का उपयोग करके सभी पुन: प्रयोज्य उपकरणों (जैसे, क्लैंप, ड्रिल बिट्स, ड्रिल, आरी, आदि) को निष्फल /
      नोट: छोटे नमूनों (जैसे, किशोर नमूने) के लिए नमूने के लिए उपलब्ध 50-100 मिलीग्राम कॉर्टिकल हड्डी से काफी कम हो सकता है। हालांकि, कम मात्रा में भी, इस शारीरिक नमूना स्थान को डीएनए11 में विशेष रूप से समृद्ध दिखाया गया है।

Figure 4
चित्र 4: डिस्टल फालैंक्स शाफ्ट के साथ घनी कॉर्टिकल हड्डी के स्थानों और एपिकल टफ्ट के अवर पक्ष को दर्शाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. तालुस का नमूना
    1. एयरफ्लो बंद होने के साथ यूवी लाइट से लैस पीसीआर हुड या बायोसेफ्टी कैबिनेट (तरंग दैर्ध्य: 254 एनएम) के तहत एक समर्पित साफ कमरे में सभी नमूने करें। किसी भी आवारा हड्डी पाउडर / टुकड़ों को पकड़ने के लिए बेंचटॉप पर बाँझ एल्यूमीनियम पन्नी फैलाएं।
    2. सुनिश्चित करें कि पन्नी के निपटान से पहले सभी हड्डी के टुकड़े और जितना संभव हो उतना पाउडर बरामद किया गया है (प्रत्यावर्तन के लिए)। प्रत्येक नमूने के बीच पन्नी बदलें। इस्तेमाल की गई पन्नी को एक आटोक्लेवेबल बायोहाजार्ड बैग/रिसेप्टेकल में रखें।
    3. वजन कागज की एक छोटी शीट को एक मानक वजन ट्रे में रखें।
    4. नमूने को हैंडहेल्ड क्लैंप/विस, गुंबद में ऊपर की ओर सुरक्षित करें।
    5. वजन ट्रे के ऊपर, टैलस, गुंबद को ऊपर की ओर और कलेक्टर की ओर मध्यवर्ती सतह को पकड़ें। कम गति और उच्च टोक़ पर सेट किए गए कम गेज बिट (सामग्री की तालिका देखें) के साथ दंत ड्रिल का उपयोग करके टैलस की गर्दन से ~ 1 मिमी की गहराई तक कॉर्टिकल हड्डी को स्क्रैप करें (चित्रा 5 देखें)।
    6. ड्रिलिंग स्थिति को थोड़ा बदलें और लगभग 50-100 मिलीग्राम हड्डी पाउडर एकत्र होने तक दोहराएं, जैसा कि 0.01 मिलीग्राम तक सटीक संलग्न संतुलन का उपयोग करके मापा जाता है ( सामग्री की तालिका देखें)।
    7. निष्कर्षण के लिए वजन कागज से हड्डी पाउडर को 2 एमएल कम-बाइंड ट्यूब में स्थानांतरित करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, अनिश्चित काल के लिए।
    8. शेष हड्डी / अतिरिक्त पाउडर को सूखे, तापमान नियंत्रित (25 डिग्री सेल्सियस) बाँझ वातावरण में स्टोर करें जब तक कि वापसी / प्रत्यावर्तन पूरा नहीं हो जाता।
    9. सभी कचरे को ऑटोक्लेवेबल बायोहाजार्ड बैग या रिसेप्टेकल्स में निपटाएं। प्रत्येक नमूने के बीच ब्लीच/डीएनए परिशोधन समाधान/इथेनॉल और यूवी (तरंगदैर्ध्य: 254 एनएम) एक्सपोजर का उपयोग करके सभी पुन: प्रयोज्य उपकरणों (जैसे, क्लैंप, ड्रिल बिट्स, ड्रिल, आरी, आदि) को निष्फल /

Figure 5
चित्रा 5: कॉर्टिकल हड्डी की वसूली के लिए तालस का नमूना क्षेत्र। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

नोट: तालस में बहुत कम कॉर्टिकल हड्डी (एक पतली बाहरी परत) होती है। सामग्री को न केवल सतह से एकत्र किया जाना चाहिए, बल्कि कैनसेलस हड्डी की अंतर्निहित घनी परत भी होनी चाहिए।

Representative Results

एक अलग अध्ययन11 में, कैल्सीफाइड ऊतक2 से छोटे टुकड़ों के लिए अनुकूलित एक मानक डीएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल का उपयोग करके, 11 व्यक्तियों में प्रत्येक शारीरिक नमूना स्थान से उत्पन्न हड्डी पाउडर से डीएनए निकाला गया था। एकल-फंसे पुस्तकालयों को तब28 का उत्पादन किया गया था और प्रति नमूना ~ 20,000,000 रीड की गहराई तक हाइसेक 4000 (75 बीपी युग्मित-अंत) पर अनुक्रमित किया गया था। परिणामी अनुक्रम डेटा का मूल्यांकन तब उत्सुक पाइपलाइन 29 (बीडब्ल्यूए सेटिंग्स:32 की बीज लंबाई, 0.1 बेमेल जुर्माना, 37 के मैपिंग गुणवत्ता फिल्टर) का उपयोग करके अंतर्जात मानव डीएनए सामग्री के लिए किया गया था। स्थिरता के लिए पार्कर एट अल 202011 के समान मैट्रिक्स का उपयोग करके सभी प्रतिनिधि परिणामों की सूचना दी जाती है। पार्स पेट्रोसा के पाउडर भागों से पुस्तकालयों ने सर्वेक्षण किए गए अन्य 23 शारीरिक नमूना स्थानों में से किसी की तुलना में औसतन उच्च अंतर्जात डीएनए का उत्पादन किया (चित्रा 6 ए-बी)। इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत सात अतिरिक्त शारीरिक नमूना स्थानों (सीमेंटम, दंत लुगदी कक्ष का पहला पास, और स्थायी दाढ़ का डेंटिन; कशेरुक शरीर से कॉर्टिकल हड्डी और वक्ष कशेरुक के बेहतर कशेरुक मेहराब; डिस्टल फालैंक्स के एपिकल टफ्ट से कॉर्टिकल हड्डी; और तालस की गर्दन से कॉर्टिकल हड्डी) ने अगली उच्चतम पैदावार का उत्पादन किया (इन शारीरिक नमूना स्थानों के बीच कोई सांख्यिकीय महत्व नहीं है; चित्रा 6 ए-बी; पूरक फ़ाइल 1: अंतर्जात डीएनएप्रीकैप)। ये वैकल्पिक स्थान सभी लगातार उत्पादित डीएनए पैदावार मानक जनसंख्या आनुवंशिकी विश्लेषण जैसे माइटोकॉन्ड्रियल विश्लेषण और एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता (एसएनपी) विश्लेषण के लिए पर्याप्त हैं। सभी शारीरिक नमूना स्थानों से उपजी पुस्तकालयों में दोहराव दर कम थी (क्लस्टर कारक औसतन 1.2 <, जिसकी गणना सभी मैपिंग रीड के अनुपात के रूप में की जाती है। पूरक फ़ाइल 1: क्लस्टरफैक्टर), यह दर्शाता है कि स्क्रीन किए गए सभी पुस्तकालय बहुत अधिक जटिलता के थे। इसी तरह, औसत बहिर्जात मानव डीएनए संदूषण अनुमान कम थे, औसत < 2% (पुरुषों में एक्स क्रोमोसोम संदूषण, एन = 7, जैसा कि एएनजीएसडी30 पाइपलाइन द्वारा रिपोर्ट किया गया है) बेहतर कशेरुक आर्क (औसत अनुमानित संदूषण: 2.11%) को छोड़कर सभी शारीरिक नमूना स्थानों में, एक नमूना को आउटलायर के रूप में हटा दिया गया था; KRA005: 19.52%, तालिका 2 देखें; पूरक फ़ाइल 1: Xcontamination)। औसत टुकड़े की लंबाई (30 बीपी < सभी रीडिंग को हटाने के लिए फ़िल्टर करने के बाद) दंत लुगदी कक्ष और डेंटिन से एकत्र की गई सामग्री में सबसे कम थी, जिसमें अन्य शारीरिक नमूना स्थानों (55.14 बीपी और 60.22 बीपी) के बीच कोई महत्वपूर्ण भिन्नता नहीं थी, 62.87 के औसत औसत की तुलना में क्रमशः, जोड़ी-वार पी-मान < 0.019, तालिका 2; पूरक फ़ाइल 1: औसतफ्रैग लंबाई)। इसके अतिरिक्त, दांतों और वक्ष कशेरुकाओं में से प्रत्येक में कई शारीरिक नमूना स्थान होते हैं जहां उच्च अंतर्जात डीएनए वसूली देखी गई थी, जिससे उन्हें पार्स पेट्रोसा के विकल्प के रूप में विशेष रूप से उपयुक्त बनाया गया था।

Figure 6
चित्रा 6: सभी जांच किए गए नमूनों के लिए मानव डीएनए सामग्री। काली रेखाएं समग्र माध्य का प्रतिनिधित्व करती हैं, जबकि लाल रेखाएं माध्य का प्रतिनिधित्व करती हैं (ठोस: मानव डीएनए अनुपात, डैश्ड: मैप किए गए मानव रीड प्रति मिलियन रीड उत्पन्न)। समग्र औसत (8.16%) से अधिक औसत मानव डीएनए अनुपात वाले व्यक्तिगत शारीरिक नमूना स्थानों को सभी विश्लेषणों में रंगीन किया जाता है। (ए) एचजी 19 संदर्भ जीनोम में रीड मैपिंग का अनुपात। नीली डैश्ड लाइन पाइपलाइन के मैपिंग मापदंडों को देखते हुए सैद्धांतिक अधिकतम का प्रतिनिधित्व करती है (नकली क्षति के साथ एचजी 19 संदर्भ जीनोम से 5,000,000 रीड के यादृच्छिक वितरण को अनुकरण करने के लिए गार्गमेल31 का उपयोग करके उत्पन्न)। व्यक्तिगत साधन (ब्लैक एक्स) और मीडियन (लाल सर्कल) उन नमूनों के लिए रिपोर्ट किए जाते हैं जिनमें समग्र औसत की तुलना में उच्च औसत मानव डीएनए अनुपात होता है। आत्मविश्वास अंतराल सांख्यिकीय आउटलायर्स को छोड़कर ऊपरी और निचली सीमाओं को इंगित करता है। (बी) अनुक्रमण प्रयास (75 बीपी युग्मित अंत) के प्रति मिलियन रीड रीड एचजी 19 संदर्भ जीनोम के लिए अद्वितीय रीड मैपिंग की संख्या। आत्मविश्वास अंतराल सांख्यिकीय आउटलायर्स को छोड़कर ऊपरी और निचली सीमाओं को इंगित करता है। इस आंकड़े को पार्कर, सी एट अल 202011 से अनुकूलित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 2: औसत दोहराव स्तर (मैपिंग रीड / अद्वितीय पढ़ता है), औसत और औसत टुकड़ा लंबाई, और सभी शारीरिक नमूना स्थानों के लिए एक्स क्रोमोसोम संदूषण अनुमान। माध्य की मानक त्रुटि के रूप में रिपोर्ट की गई त्रुटि. इस तालिका को पार्कर, सी. एट अल. 202011 से अनुकूलित किया गया है।

नमूना स्थान औसत दोहराव कारक (# मैप किया गया पढ़ता है / # अद्वितीय मैप किया गया पढ़ता है) बीपी में औसत टुकड़े की लंबाई एक्स क्रोमोसोम संदूषण का औसत अनुमानित अनुपात
पेट्रोस पिरामिड 1.188 ± 0.006 65.40 ± 1.36 0.000 ± 0.003
सीमेंटम 1.197 ± 0.028 67.28 ± 1.76 0.011 ± 0.003
Dentin 1.188 ± 0.061 60.22 ± 2.37 0.002 ± 0.007
गूदा 1.179 ± 0.024 55.14 ± 2.90 0.013 ± 0.006
डिस्टल फालेंक्स 1.191 ± 0.049 65.95 ± 1.08 0.013 ± 0.005
कशेरुका शरीर 1.194 ± 0.037 66.14 ± 1.03 0.008 ± 0.003
सुपीरियर वर्टेब्रल आर्क 1.19 ± 0.017 63.02 ± 1.23 0.021 ± 0.009*
शैल-मलबा 1.198 ± 0.010 68.20 ± 1.24 0.011 ± 0.003
* नमूना KRA005 0.1952 पर एक आउटलायर के रूप में हटा दिया गया

कोड उपलब्धता
इस पांडुलिपि के विश्लेषण में उपयोग किए जाने वाले सभी विश्लेषण कार्यक्रम और आर मॉड्यूल अपने संबंधित लेखकों से स्वतंत्र रूप से उपलब्ध हैं। सभी कस्टम आर कोड अनुरोध द्वारा उपलब्ध है।

डेटा की उपलब्धता
प्रतिनिधि परिणामों की गणना में उपयोग किए जाने वाले सभी कच्चे डेटा स्वतंत्र रूप से यूरोपीय न्यूक्लियोटाइड आर्काइव ईएनए डेटा रिपॉजिटरी (परिग्रहण संख्या पीआरजे-ईबी 36983) या पार्कर, सी।

पूरक फ़ाइल 1. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

प्राचीन मानव जनसंख्या आनुवंशिकी में वर्तमान अभ्यास अधिमानतः पार्स पेट्रोसा (चरण 2.1) से नमूना लेना है जब भी संभव हो। हालांकि, पार्स पेट्रोसा प्राप्त करना एक कठिन नमूना हो सकता है, क्योंकि यह कंकाल के आकलन के असंख्य के लिए अत्यधिक मूल्यवान है (उदाहरण के लिए, जनसंख्या इतिहास32, मृत्यु पर भ्रूण की आयु का अनुमान33, और लिंग निर्धारण34), और, ऐतिहासिक रूप से, डीएनए विश्लेषण के लिए पार्स पेट्रोसा का नमूना अत्यधिक विनाशकारी 3,4 हो सकता है (यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल सहित, हालांकि नए, न्यूनतम इनवेसिव प्रोटोकॉल 13,14 अब इस चिंता को कम करने के लिए व्यापक रूप से अपनाए गए हैं)। यह इस तथ्य से जटिल है कि, हाल ही में, कंकाल में मानव डीएनए वसूली का एक बड़े पैमाने पर, व्यवस्थितअध्ययन का प्रयास नहीं किया गया था, जिससे पेट्रोस पिरामिड अनुपलब्ध होने पर एक उपयुक्त नमूना रणनीति खोजने का प्रयास नहीं किया गया था।

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल पुरातात्विक / फोरेंसिक कंकाल अवशेषों से डीएनए नमूनाकरण के लिए अनुकूलित प्रक्रियाओं का एक सेट प्रदान करके उस चुनौती को कम करने में मदद करते हैं, जिसमें पार्स पेट्रोसा के साथ-साथ चार अतिरिक्त कंकाल तत्वों में सात वैकल्पिक शारीरिक नमूना स्थान शामिल हैं। शामिल किए गए सभी महत्वपूर्ण कदमों का उद्देश्य अक्षम नमूनाकरण (चरण 2.1.6 और 3.2.1.3) या ड्रिलिंग / कटिंग (चरण 3.1.6) के दौरान नमूनों के अधिक गर्म होने के कारण डीएनए हानि / क्षति की संभावना को कम करना है। इसके अतिरिक्त, पूरे प्रोटोकॉल में यह नोट किया गया है कि अत्यधिक अवक्रमित नमूनों में सर्वोत्तम प्रदर्शन सुनिश्चित करने के लिए पूर्व-उपचार चरणों को संशोधित / छोड़ना आवश्यक हो सकता है। यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि यहां प्रस्तुत चयनित तत्वों में भी, कई संभावित वैकल्पिक नमूना तकनीकें हैं (विशेष रूप से पार्स पेट्रोसा13,14 के लिए), साथ ही यहां प्रस्तुत अशोषित शारीरिक नमूना स्थानों के आगे अनुकूलन के लिए पर्याप्त जगह है (यानी, तालस: चरण 2.5 और कशेरुक: चरण 2.3)।

यह भी ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि इन प्रोटोकॉल को अंतर्जात मानव डीएनए विश्लेषण के प्रयोजनों के लिए उच्च गुणवत्ता (अच्छे रूपात्मक संरक्षण) के प्राचीन किशोर-वयस्क अवशेषों का उपयोग करके डिजाइन और परीक्षण किया गया है। प्रस्तुत परिणाम अधिक अत्यधिक अवक्रमित सामग्रियों, अन्य संरक्षण संदर्भों, शिशु अवशेषों, गैर-मानव अवशेषों, या रोगजनकों या माइक्रोबायोम के अध्ययन तक विस्तारित नहीं हो सकते हैं, क्योंकि अतिरिक्त संदर्भों में इन प्रोटोकॉल के उपयोग में अधिक अन्वेषण अभी भी आवश्यक है। इसके अतिरिक्त, यहां प्रस्तुत वैकल्पिक कंकाल तत्व (दांत, कशेरुक, डिस्टल फालैंक्स, और ताली) मिश्रित अवशेषों के बीच एक ही व्यक्ति को असाइन करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है, जिससे एकल उत्पत्ति सुनिश्चित करने के लिए कई तत्वों से नमूना लेने की आवश्यकता होती है। इन सीमाओं के बावजूद, इन प्रोटोकॉल को व्यापक रूप से उपलब्ध कराने से मानव अवशेषों पर भविष्य के एडीएनए / फोरेंसिक अध्ययनों की एक विस्तृत श्रृंखला में उपयोग के लिए एक सामान्यीकृत और मात्रात्मक रूप से अनुकूलित ढांचा प्रदान करके नमूना चयन और प्रसंस्करण के आसपास की कुछ विषमता को कम करने में मदद मिल सकती है।

Disclosures

लेखकों के पास रिपोर्ट करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

लेखक इन प्रोटोकॉल के विकास और कार्यान्वयन में उनकी मदद के लिए मैक्स प्लैंक इंस्टीट्यूट फॉर द साइंस ऑफ ह्यूमन हिस्ट्री के प्रयोगशाला कर्मचारियों को धन्यवाद देना चाहते हैं। यह काम डॉ गुइडो ब्रांट, डॉ एलिजाबेथ नेल्सन, एंटजे विस्सेगोट और फ्रांजिस्का एरोन के इनपुट और कड़ी मेहनत के बिना संभव नहीं था। इस अध्ययन को मैक्स प्लैंक सोसाइटी, यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ईआरसी) द्वारा यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम के तहत अनुदान समझौतों के तहत वित्त पोषित किया गया था- 771234 पालेओरिडर (डब्ल्यूएच, एबीआर) और स्टार्टिंग ग्रांट नंबर 805268 कोडिसेस (केआईबी को)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#16 Dental Drill Bit NTI H1-016-HP example drilling bit
0.6 mm scroll saw blade Fisher Scientific 50-949-097 blade for Jewellers Saw
22mm diamond cutting wheel Kahla SKU 806 104 358 514 220 Dremel cutting attachment
Commercial Bleach Fisher Scientific NC1818018
Control Company Ultra-Clean Supreme Aluminum Foil Fisher Scientific 15-078-29X
DNA LoBind Tubes (2 mL) Eppendorf 22431048
Dremel 225-01 Flex Shaft Attachment Dremel 225-01 Dremel flexible extension
Dremel 4300 Rotary Tool Dremel 4300 Example drill
Dremel collet and nut kit Dremel 4485 Adapters for various Dremel tool attachments/bits
Eagle 33 Gallon Red Biohazard Waste Bag Fisher Scientific 17-988-501
Eppendorf DNA LoBind 2 mL microcentrifuge tube Fisher Scientific 13-698-792
Ethanol (Molecular Biology Grade) Millipore Sigma 1.08543
FDA approved level 2 Surgical Mask Fisher Scientific 50-206-0397 PPE
Fisherbrand Comfort Nitrile Gloves Fisher Scientific 19-041-171X PPE
Fisherbrand Safety Glasses Fisher Scientific 19-130-208X PPE
Granger Stationary Vise Fisher Scientific NC1336173 benchtop vise
Invitrogen UltraPure DNase/Rnase free distilled water Fisher Scientific 10-977-023
Jewellers Saw Fisher Scientific 50-949-231
Kimwipes Sigma-Aldritch Z188956
Labconco Purifier Logic Biosafety cabinet Fisher Scientific 30-368-1101
LookOut DNA Erase Millipore Sigma L9042-1L
Medium weighing boat Heathrow Scientific HS120223
MSC 10pc plier/clamp set Fisher Scientific 50-129-5352 Miscellaneous clamps/vise grips for securely holding samples while drilling/cutting
Sartorius Quintix Semi-Micro Balance Fisher Scientific 14-560-019 enclosed balance
Tyvek coveralls with hood Fisher Scientific 01-361-7X PPE
Weigh paper Heathrow Scientific HS120116

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References

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जेनेटिक्स अंक 177 आर्कियोजेनेटिक्स एडीएनए हड्डी का नमूना फोरेंसिक डीएनए नमूनाकरण बायोएंथ्रोपोलॉजी
पुरातात्विक अवशेषों से प्राचीन डीएनए की पुनर्प्राप्ति के लिए अनुकूलित हड्डी नमूनाकरण प्रोटोकॉल
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Parker, C. E., Bos, K. I., Haak, W., Krause, J. Optimized Bone Sampling Protocols for the Retrieval of Ancient DNA from Archaeological Remains. J. Vis. Exp. (177), e63250, doi:10.3791/63250 (2021).

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