JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Kinesin-7 CENP-E'nin In Vivo İnhibisyon, İmmünofloresan ve Akım Sitometrisi Kullanılarak Spermatositlerde Fonksiyonel Değerlendirilmesi

Published: December 28, 2021
doi:
10.3791/63271
, , , , , , ,
1Department of Cell Biology and Genetics, The School of Basic Medical Sciences,Fujian Medical University, 2Key Laboratory of Stem Cell Engineering and Regenerative Medicine,Fujian Province University, 3Fujian Obstetrics and Gynecology Hospital, 4Medical Research Center, Fujian Maternity and Child Health Hospital,Affiliated Hospital of Fujian Medical University

Summary

Bu makalede, erkek mayotik bölünmesi için değerli bir model olan abdominal cerrahi ve testiküler GSK923295 enjeksiyonu yoluyla CENP-E’nin in vivo inhibisyonu bildirilmiştir. İmmünofloresan, akım sitometrisi ve transmisyon elektron mikroskobu tahlillerini kullanarak, CENP-E inhibisyonunun fare spermatositlerinde kromozom yanlış hizalaması ve genom instabilitesi ile sonuçlandığını gösterdik.

Abstract

Ökaryotlarda, mayoz cinsel üremede genom stabilitesi ve genetik çeşitlilik için gereklidir. Testislerdeki spermatositlerin deneysel analizleri, erkek mayotik bölünmesinde iğ montajı ve kromozom ayrışmasının araştırılması için kritik öneme sahiptir. Fare spermatositi, mekanik mayoz çalışmaları için ideal bir modeldir, ancak spermatositlerin analizi için etkili yöntemler eksiktir. Bu makalede, fare spermatositlerinde kinesin-7 CENP-E’nin in vivo inhibisyonu için pratik ve etkili bir yöntem bildirilmiştir. 3 haftalık farelerde karın ameliyatı yoluyla GSK923295 spesifik bir inhibitörün testiküler enjeksiyonu için ayrıntılı bir prosedür sunulmaktadır. Ayrıca, burada doku toplama ve fiksasyon, hematoksilin-eozin boyama, immünofloresan, akım sitometrisi ve transmisyon elektron mikroskobu için bir dizi protokol tanımlanmıştır. Burada, erkek mayozunu incelemek için güçlü bir teknik olabilecek abdominal cerrahi ve testis enjeksiyonu yoluyla in vivo inhibisyon modeli sunuyoruz. Ayrıca, CENP-E inhibisyonunun, mayoz I sırasında primer spermatositlerde kromozom yanlış hizalaması ve metafaz durması ile sonuçlandığını gösterdik. İn vivo inhibisyon yöntemimiz, mayozun mekanik çalışmalarını kolaylaştıracak, erkek germ hatlarının genetik modifikasyonları için yararlı bir yöntem olarak hizmet edecek ve gelecekteki klinik uygulamalara ışık tutacaktır.

Introduction

Mayoz, ökaryotik organizmalardaki en önemli, oldukça katı, evrimsel korunmuş olaylardan biridir ve gametogenez, cinsel üreme, genom bütünlüğü ve genetik çeşitlilik için gereklidir 1,2,3. Memelilerde, germ hücreleri, tek bir DNA replikasyonu turundan sonra mayoz I ve II olmak üzere iki ardışık hücre bölünmesine uğrar. Mitozdaki kardeş kromatitlerin aksine, kopyalanmış homolog kromozomlar mayoz I 4,5 sırasında eşleşir ve iki yavru hücreye ayrılır. Mayoz II’de, kardeş kromatitler DNA replikasyonu olmadan haploid gametler oluşturmak için ayrılırve ayrılır 6. İş mili montaj kusurları ve kromozom yanlış ayrışması da dahil olmak üzere iki mayotik bölümden herhangi birindeki hatalar, gametlerin kaybına, kısırlığa veya anöploidi sendromlarına neden olabilir 7,8,9.

Biriken çalışmalar, kinesin ailesi motorlarının hem mitotik hem de mayotik hücrelerde kromozom hizalaması ve ayrışması, iğ montajı, sitokinez ve hücre döngüsü ilerlemesinin düzenlenmesinde çok önemli bir rol oynadığını göstermiştir10,11,12. Kinesin-7 CENP-E (Sentomer proteini E), kromozom kongresi, kromozom taşınması ve hizalanması ve mitoz 13,14,15,16,17,18’de iğ montaj kontrol noktasının düzenlenmesi için gerekli olan artı uçlu yönlendirilmiş bir kinetochore motorudur. Mayoz sırasında, spesifik inhibitör tarafından CENP-E inhibisyonu GSK923295 spermatojenik hücrelerde hücre döngüsü durması, kromozom yanlış hizalaması, iğ düzensizliği ve genom instabilitesine yol açar19. CENP-E’nin bölünen spermatositlerin sentromerlerindeki lokalizasyon paternleri ve dinamikleri, CENP-E’nin mayoz I20,21 sırasında sentromerlerin sıralı montajı için kinetochore proteinleri ile etkileşime girdiğini göstermektedir. Oositlerde, kromozom hizalaması ve mayoz I 13,22,23’ün tamamlanması için CENP-E gereklidir. CENP-E’nin antikorları veya morfolino enjeksiyonu, hem fare hem de Drosophila oositlerinde yanlış hizalanmış kromozomlar, anormal kinetochore oryantasyonu ve mayoz I tutuklaması ile sonuçlanır23. CENP-E’nin mitozdaki temel rolleri ile karşılaştırıldığında, CENP-E’nin mayozdaki fonksiyonları ve mekanizmaları büyük ölçüde bilinmemektedir. CENP-E’nin kromozom kongresindeki ayrıntılı mekanizmaları ve erkek mayotik hücrelerde genom stabilitesi hala aydınlatılmamıştır.

Spermatogenez, ardışık spermatogonia proliferasyonu, mayoz ve spermiogenezi içeren karmaşık ve uzun süreli bir fizyoloji sürecidir. Bu nedenle, tüm sürecin memelilerde ve diğer türlerde in vitro olarak çoğaltılması olağanüstü zordur24,25. Pakiten evresinden sonra spermatositlerin diferansiyasyonunu in vitro olarak indüklemek imkansızdır. Erkek mayotik bölünmeleri üzerine yapılan çalışmalar genellikle erken mayotik profaz25,26’nın deneysel analizleri ile sınırlı kalmıştır. Kısa süreli spermatosit kültürü 27,28 ve organ kültürü yöntemleri25 dahil olmak üzere birçok teknolojik çabaya rağmen, erkek mayotik bölünmesini incelemek için çok az etkili yöntem vardır. Ayrıca, esansiyel genlerin genetik olarak silinmesi genellikle gelişimsel arrest ve embriyonik ölümcüllük ile sonuçlanır. Örneğin, CENP-E’den yoksun fare embriyoları implante edilemez ve mayozda CENP-E’nin mekanik çalışmalarında bir engel olan geçmiş implantasyon29’u geliştiremez. Birlikte ele alındığında, erkek mayotik bölünmesini incelemek için pratik ve uygulanabilir bir sistem kurmak, mayoz araştırma alanını büyük ölçüde destekleyebilir.

Küçük hücre geçirgen inhibitörü, hücre bölünmesi ve gelişimsel süreçlerde kinesin motorlarını incelemek için güçlü bir araçtır. GSK923295 allosterik inhibitör, özellikle CENP-E motor alanına bağlanır, ADP’nin (adenosin difosfat) salınımını bloke eder ve son olarak CENP-E ile mikrotübüller arasındaki etkileşimleri stabilize eder30. Bu çalışmada, karın cerrahisi ve testiküler GSK923295 enjeksiyonu yoluyla in vivo inhibisyonlu fare modeli sunulmuştur. CENP-E inhibisyonu, primer spermatositlerin metafaz I’inde kromozomun yanlış hizalanmasına neden olur. Ayrıca, CENP-E inhibisyonu spermatositlerin mayotik arrestine ve spermatogenezin bozulmasına yol açar. Spermatositlerin analizi için bir dizi protokol tanımlanmıştır ve spermatositlerdeki mayotik iğ mikrotübüllerini, homolog kromozomları ve hücre altı organelleri gözlemlemek için uygulanabilir. İn vivo inhibisyon yöntemimiz mayotik bölünme ve spermatogenez çalışmaları için etkili bir yöntemdir.

Protocol

Tüm hayvan deneyleri, Fujian Tıp Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır (Protokol numarası SYXK 2016-0007). Tüm fare deneyleri, Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı ile ilgili kılavuzlara uygun olarak gerçekleştirilmiştir (NIH yayınları sayı 8023, gözden geçirilmiş 1978). 1. GSK923295 aracılı CENP-E inhibisyon fare modellerinin yapımı Cerr…

Representative Results

Karın cerrahisi ve GSK92329519’un testiküler enjeksiyonu yoluyla fare testislerinin in vivo CENP-E inhibisyon modelini başarıyla oluşturduk. Bu yöntemin temel teknik adımları Şekil 1’de gösterilmiştir. 4 gün boyunca testiküler GSK923295 enjeksiyonundan sonra, testisler daha ileri analizler için toplandı. Kontrol grubunda seminifer tübüllerdeki spermatojenik dalga düzenli ve organize idi (Şekil 2A). Bununla birl…

Discussion

Bu çalışmada, karın cerrahisi ve GSK923295 mikroenjeksiyonu kullanılarak fare testislerinin in vivo CENP-E inhibisyon modelini oluşturduk. Bu çalışmada kullanılan abdominal cerrahi ve testis enjeksiyon yöntemi aşağıdaki avantajlara sahiptir. İlk olarak, farelerin yaşı ile sınırlı değildir. Deneyciler testis enjeksiyonunu erken bir aşamada, örneğin 3 haftalık veya daha genç farelerde gerçekleştirebilirler. İkincisi, GSK923295 CENP-E üzerinde spesifik ve mükemmel bir inhibitör etkiy…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Fujian Tıp Üniversitesi Hücre İskelet Laboratuvarı’nın tüm üyelerine yararlı tartışmalar için teşekkür ederiz. Fujian Tıp Üniversitesi Kamu Teknolojisi Hizmet Merkezi’nden Jun-Jin Lin’e akış sitometrisindeki teknik yardımları için teşekkür ederiz. Fujian Tıp Üniversitesi Kamu Teknolojisi Hizmet Merkezi Elektron Mikroskobu Laboratuvarı’nda Ming-Xia Wu ve Lin-Ying Zhou’ya elektron mikroskobundaki teknik yardımları için teşekkür ederiz. Fujian Tıp Üniversitesi Temel Tıp Bilimleri Deneysel Öğretim Merkezi’nden Si-Yi Zheng, Ying Lin, Qi Ke ve Jun Song’a destekleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma aşağıdaki hibelerle desteklenmiştir: Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (hibe numarası 82001608), Fujian Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı, Çin (hibe numarası 2019J05071), Fujian İl Sağlık Teknolojisi Projesi (hibe numarası 2018-1-69), Bilimsel Araştırma Başlangıç Fonu, Fujian Tıp Üniversitesi (hibe numarası 2017XQ1001), Fujian Tıp Üniversitesi üst düzey yetenekler bilimsel araştırma başlangıç fonu projesi (hibe numarası XRCZX2017025) ve Araştırma projesi Çin tıbbı lisansüstü öğrencilerinin çevrimiçi eğitim ve öğretimi (hibe numarası B-YXC20200202-06).

Materials

0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200056
1 ml Syringe Several commercial brands available Sterile.
1.5 mL Centrifuge tube Axygen MCT-150-C
50 mL Centrifuge Tube Corning 430828
6 cm Petri dish Corning 430166
95% Ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10009164
tubulin rabbit polyclonal antibody Beyotime AF0001 For immunofluorescence assays. Use at 1:100.
rabbit anti-Histone H3 (phospho S10) monoclonal antibody Abcam ab267372 For immunofluorescence assays. Use at 1:100.
rabbit anti-TUBA4A polyclonal antibody Sangon Biotech D110022 For immunofluorescence assays. Use at 1:100.
Anti-SYCP3 rabbit monoclonal antibody Abcam ab175191 For immunofluorescence assays. Use at 1:100.
Adhesion microscope slides CITOTEST 188105
Alexa fluor 488-labeled goat anti-rabbit antibody Beyotime A0423 Sencodary antibody. Use at 1:500.
Aluminium potassium sulphate Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10001060
Anhydrous ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 100092690
Anti-fade mounting medium Beyotime P0131 Prevent photobleching of flourescent signals.
BD FACS Canto II BD Biosciences FACS Canto II
Bovine Serum Albumin Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 69003435
Centrifuge Eppendorf 5424BK745380
Chloral hydrate Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 80037516
Citric acid Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd 122670
Collagenase Sangon Biotech A004194-0100
Coverslips CITOTEST 10212020C 20 × 20 mm. Thickness 0.13-0.16 mm.
DAPI Beyotime C1006
Dye vat Several commercial brands available 91347802
Eosin Y, alcohol soluble Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 71014460
Ether Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10009318
Formaldehyde – aqueous solution Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10010018
GSK923295 MedChemExpress HY-10299
Hematoxylin, anhydrous Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 71020784
ICR mouse Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd
Image J software National Institutes of Health https://imagej.nih.gov/ij/ Fluorescent image analysis.
Leica ultramicrotome Leica
Leica EM UC-7 ultramicrotome Leica EM UC7
Modfit MFLT32 Verity Software House For analysis of flow cytometry results.
Nail polish Several commercial brands available
Neutral gum Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10004160
Nikon Ti-S2 microscope Nikon Ti-S2
Picric acid Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd J60807
Rheodyne Sangon Biotech F519160-0001 10 μl rheodyne
Sliced paraffin Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 69019461
Sodium iodate Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 80117214
Surgical instruments Several commercial brands available For abdominal surgery. Sterilize at 121 °C, 20 min.
Transmission electron microscope FEI Tecnai G2
Trisodium citrate dihydrate Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd 173970
Triton X-100 Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 30188928 Dilute in sterile PBS to make a 0.25% working solution.
Tween 20 Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 30189328 Dilute in sterile PBS to make a 0.1% working solution.
Paraformaldehyde Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 80096618
Xylene Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10023418
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lenormand, T., Engelstädter, J., Johnston, S. E., Wijnker, E., Haag, C. R. Evolutionary mysteries in meiosis. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 371 (1706), 20160001 (2016).
  2. Brandeis, M. New-age ideas about age-old sex: separating meiosis from mating could solve a century-old conundrum. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 93 (2), 801-810 (2018).
  3. Lane, S., Kauppi, L. Meiotic spindle assembly checkpoint and aneuploidy in males versus females. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 76 (6), 1135-1150 (2019).
  4. Handel, M. A., Schimenti, J. C. Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility. Nature Reviews Genetics. 11 (2), 124-136 (2010).
  5. Miller, M. P., Amon, A., Ünal, E. Meiosis I: when chromosomes undergo extreme makeover. Current Opinion in Cell Biology. 25 (6), 687-696 (2013).
  6. Duro, E., Marston, A. L. From equator to pole: splitting chromosomes in mitosis and meiosis. Genes & Development. 29 (2), 109-122 (2015).
  7. Eaker, S., Pyle, A., Cobb, J., Handel, M. A. Evidence for meiotic spindle checkpoint from analysis of spermatocytes from Robertsonian-chromosome heterozygous mice. Journal of Cell Science. 114, 2953-2965 (2001).
  8. Faisal, I., Kauppi, L. Reduced MAD2 levels dampen the apoptotic response to non-exchange sex chromosomes and lead to sperm aneuploidy. Development. 144 (11), 1988-1996 (2017).
  9. Bolcun-Filas, E., Handel, M. A. Meiosis: the chromosomal foundation of reproduction. Biology of Reproduction. 99 (1), 112-126 (2018).
  10. Lawrence, C. J., et al. A standardized kinesin nomenclature. The Journal of Cell Biology. 167 (1), 19-22 (2004).
  11. Cross, R. A., McAinsh, A. Prime movers: the mechanochemistry of mitotic kinesins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 257-271 (2014).
  12. Camlin, N. J., McLaughlin, E. A., Holt, J. E. Motoring through: the role of kinesin superfamily proteins in female meiosis. Human Reproduction Update. 23 (4), 409-420 (2017).
  13. Yen, T. J., Li, G., Schaar, B. T., Szilak, I., Cleveland, D. W. CENP-E is a putative kinetochore motor that accumulates just before mitosis. Nature. 359 (6395), 536-539 (1992).
  14. Wood, K. W., Sakowicz, R., Goldstein, L. S., Cleveland, D. W. CENP-E is a plus end-directed kinetochore motor required for metaphase chromosome alignment. Cell. 91 (3), 357-366 (1997).
  15. Abrieu, A., Kahana, J. A., Wood, K. W., Cleveland, D. W. CENP-E as an essential component of the mitotic checkpoint in vitro. Cell. 102 (6), 817-826 (2000).
  16. Mao, Y., Desai, A., Cleveland, D. W. Microtubule capture by CENP-E silences BubR1-dependent mitotic checkpoint signaling. The Journal of Cell Biology. 170 (6), 873-880 (2005).
  17. Gudimchuk, N., et al. Kinetochore kinesin CENP-E is a processive bi-directional tracker of dynamic microtubule tips. Nature Cell Biology. 15 (9), 1079-1088 (2013).
  18. Yu, K. W., Zhong, N., Xiao, Y., She, Z. Y. Mechanisms of kinesin-7 CENP-E in kinetochore-microtubule capture and chromosome alignment during cell division. Biology of the Cell. 111 (6), 143-160 (2019).
  19. She, Z. Y., et al. Kinesin-7 CENP-E regulates chromosome alignment and genome stability of spermatogenic cells. Cell Death Discovery. 6, 25 (2020).
  20. Parra, M. T., et al. Sequential assembly of centromeric proteins in male mouse meiosis. PLoS Genetics. 5 (3), 1000417 (2009).
  21. Parra, M. T., et al. Expression and behaviour of CENP-E at kinetochores during mouse spermatogenesis. Chromosoma. 111 (1), 53-61 (2002).
  22. Duesbery, N. S., et al. CENP-E is an essential kinetochore motor in maturing oocytes and is masked during mos-dependent, cell cycle arrest at metaphase II. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (17), 9165-9170 (1997).
  23. Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
  24. Parks, J. E., Lee, D. R., Huang, S., Kaproth, M. T. Prospects for spermatogenesis in vitro. Theriogenology. 59 (1), 73-86 (2003).
  25. Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471 (7339), 504-507 (2011).
  26. Staub, C. A century of research on mammalian male germ cell meiotic differentiation in vitro. Journal of Andrology. 22 (6), 911-926 (2001).
  27. Handel, M. A., Caldwell, K. A., Wiltshire, T. Culture of pachytene spermatocytes for analysis of meiosis. Developmental Genetics. 16 (2), 128-139 (1995).
  28. La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis. Methods in Molecular Biology. 558, 279-297 (2009).
  29. Putkey, F. R., et al. Unstable kinetochore-microtubule capture and chromosomal instability following deletion of CENP-E. Developmental Cell. 3 (3), 351-365 (2002).
  30. Wood, K. W., et al. Antitumor activity of an allosteric inhibitor of centromere-associated protein-E. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5839-5844 (2010).
  31. Nam, D., Sershon, R. A., Levine, B. R., Della Valle, C. J. The use of closed incision negative-pressure wound therapy in orthopaedic surgery. Journal of the American Academy Orthopaedic Surgeons. 26 (9), 295-302 (2018).
  32. She, Z. Y., et al. Kinesin-5 Eg5 is essential for spindle assembly and chromosome alignment of mouse spermatocytes. Cell Division. 15, 6 (2020).
  33. She, Z. Y., et al. Kinesin-6 family motor KIF20A regulates central spindle assembly and acrosome biogenesis in mouse spermatogenesis. Biochimica et Biophysica Acta-Molecular Cell Research. 1867 (4), 118636 (2020).
  34. Wellard, S. R., Hopkins, J., Jordan, P. W. A seminiferous tubule squash technique for the cytological analysis of spermatogenesis using the mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56453 (2018).
  35. Sato, M., Ishikawa, A., Kimura, M. Direct injection of foreign DNA into mouse testis as a possible in vivo gene transfer system via epididymal spermatozoa. Molecular Reproduction and Development. 61 (1), 49-56 (2002).
  36. Coward, K., et al. Expression of a fluorescent recombinant form of sperm protein phospholipase C zeta in mouse epididymal sperm by in vivo gene transfer into the testis. Fertility and Sterility. 85, 1281-1289 (2006).
  37. Davis, S., et al. Potent inhibition of microRNA in vivo without degradation. Nucleic Acids Research. 37 (1), 70-77 (2009).
  38. Zhao, H. T., et al. LRRK2 antisense oligonucleotides ameliorate α-Synuclein inclusion formation in a Parkinson’s Disease mouse model. Molecular Therapy-Nucleic Acids. 8, 508-519 (2017).
  39. Shahzad, K., et al. CHOP-ASO Ameliorates Glomerular and Tubular Damage on Top of ACE Inhibition in Diabetic Kidney Disease. Journal of the American Society of Nephrology. 3, 2021040431 (2021).
  40. Kang, K., Niu, B., Wu, C., Hua, J., Wu, J. The construction and application of lentiviral overexpression vector of goat miR-204 in testis. Research in Veterinary Science. 130, 52-58 (2020).
  41. Karabasheva, D., Smyth, J. T. Preparation of Drosophila larval and pupal testes for analysis of cell division in live, intact tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60961 (2020).
  42. Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis. Developmental Biology. 169 (2), 557-567 (1995).
  43. Cobb, J., Cargile, B., Handel, M. A. Acquisition of competence to condense metaphase I chromosomes during spermatogenesis. Developmental Biology. 205 (1), 49-64 (1999).
  44. Cobb, J., Reddy, R. K., Park, C., Handel, M. A. Analysis of expression and function of topoisomerase I and II during meiosis in male mice. Molecular Reproduction and Development. 46 (4), 489-498 (1997).
  45. Inselman, A., Handel, M. A. Mitogen-activated protein kinase dynamics during the meiotic G2/MI transition of mouse spermatocytes. Biology of Reproduction. 71 (2), 570-578 (2004).
  46. Muramatsu, T., Shibata, O., Ryoki, S., Ohmori, Y., Okumura, J. Foreign gene expression in the mouse testis by localized in vivo gene transfer. Biochemical and Biophysical Research Communications. 233 (1), 45-49 (1997).
  47. Yamazaki, Y., et al. In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells by deoxyribonucleic acid injection into seminiferous tubules and subsequent electroporation. Biology of Reproduction. 59 (6), 1439-1444 (1998).
  48. Yamazaki, Y., Yagi, T., Ozaki, T., Imoto, K. In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells using green fluorescent protein as a marker. The Journal of Experimental Zoology. 286 (2), 212-218 (2000).
  49. Coward, K., Kubota, H., Parrington, J. In vivo gene transfer into testis and sperm: developments and future application. Archives of Andrology. 53 (4), 187-197 (2007).

Tags

Keywords: MeiosisSpermatogenesisSpermatocytesCENP-EGSK923295ImmunofluorescenceFlow CytometryGene EditingMouse ModelMicrotome
check_url/63271?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Xu, M., Yang, Y., Wei, Y., Zhang, J., Lin, X., Lin, X., Chen, H., She, Z. Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (178), e63271, doi:10.3791/63271 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image