Summary
高速视频显微镜分析是一种相对容易执行、快速、经济高效,而且在有经验的人手中,它是原发性睫状体运动障碍一线诊断的相当可靠的工具,每个参与诊断和治疗严重肺部疾病的中心都应该提供这种工具。
Abstract
原发性睫状体运动障碍(PCD)是一种先天性疾病,主要遗传于常染色体隐性遗传性状。该疾病导致纤毛运动紊乱,导致黏膜纤毛清除率(MCC)的严重损害。如果未确诊或诊断得太晚,该病症会导致支气管扩张症的发展,并在以后的生活中对肺部造成严重损害。大多数诊断PCD的方法都很耗时,需要大量的经济资源来建立它们。高速视频显微镜分析 (HSVMA) 是 体外可视化和分析纤毛跳动的活呼吸道细胞的唯一诊断工具。它快速,经济高效,并且在经验丰富的手中,作为PCD的诊断工具非常可靠。此外,由于不存在形态学变化,透射电子显微镜(TEM)等经典诊断措施不适用于某些突变。
本文介绍了收集呼吸道上皮细胞的过程,标本的进一步制备以及HSVMA的过程。我们还描述了如何在诊所不具备执行HSVMA的设备的情况下,通过将刷毛细胞保存在滋养介质中以储存并运输到调查地点,从而成功地保持不受伤害和跳动。还显示了来自动力蛋白臂重链11基因(DNAH11)突变的患者的病理性跳动模式的视频,该基因不能被诊断为TEM;由于上气道感染导致的 HSVMA 不确定的结果,以及刷牙与红细胞叠加不成功。通过本文,我们希望鼓励每个处理肺病患者和罕见肺部疾病的单位进行HSVMA,作为其PCD日常常规诊断的一部分,或将标本送到专门从事HSVMA的中心。
Introduction
原发性纤毛运动障碍(PCD)是一种罕见的遗传性遗传性疾病,可引起跳动纤毛运动的紊乱。如果未确诊,由于MCC的严重损害,它会导致晚年严重的肺损伤。过去,其患病率估计在1:4,000至50,000之间。由于诊断方法的稳步改善和对该病症的认识不断提高,关于PCD患病率的最新情况表明,它可能更为常见,可能在1:4,000至20,000的范围内,而不是1,2。然而,PCD患者仍然被低估或诊断得太晚1,3。因此,应怀疑患有先天性坐姿与异型或围产期鼻漏、新生儿呼吸窘迫、鼻塞和喂养困难的婴儿。在晚年,慢性中耳炎、复发性肺炎、鼻-鼻窦炎和由 MCC 受损引起的慢性典型湿性咳嗽是 PCD 的标志性症状,与支气管扩张症和肺功能受损相结合,持续到成年期2.
怀疑患有PCD的患者可以通过使用不同的诊断工具进行诊断。过去,TEM被认为是一线诊断的黄金标准。然而,高达30%的PCD病例没有显示异常的超微结构1,3,4,5,6,需要不同的诊断方法。因此,越来越多的中心和欧洲呼吸学会 (ERS) 指南建议将鼻一氧化氮 (nNO) 和 HSVMA 联合作为一线诊断方法 1,7,9,10。HSVMA 和 nNO 也是识别 PCD11 患者的最具成本效益的选择。然而,即使基因检测包含在诊断中,也必须记住,目前没有独立的检测或组合检测可以100%确定性排除PCD8,9,10。
在现有的诊断选项中,HSVMA 是唯一一种专注于活的纤毛包被呼吸道细胞并评估纤毛搏动模式 (CBP) 和纤毛搏动频率 (CBF) 的检查。与TEM相反,HSVMA的结果通常通常在测试当天快速获得,而TEM的结果可能在标本采集后数月到达。HSVMA可以适用于所有年龄组,而nNO要求高度合规;5岁以下尝试使用它通常不成功10.在有经验的人手中,HSVMA具有出色的敏感性和特异性,可分别诊断PCD 100%和96%,12。
本文描述了执行HSVMA的分步程序,包括从鼻子的下鼻甲中收获纤毛包被的呼吸道细胞,将收获的细胞保存在细胞滋养培养基中以运输到研究部位,以及微观视频分析以确定CBF和CBP的过程。此外,还显示了一些来自患者的视频剪辑,将正常的CBP和CBF与异常纤毛功能(视频3, 视频4, 视频5, 视频6, 视频7和 视频8)进行比较。
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Protocol
道德声明:
这项研究得到了当地伦理委员会(69/2017)的批准,并按照赫尔辛基宣言进行。
1. 呼吸道上皮细胞的收集和运输
- 刷牙
- 刷牙前,给患者口服阿莫西林-克拉维酸两周疗程,以根除干扰纤毛功能的生物膜。确保在手术前2天终止抗生素。
- 为了减少刷洗上皮细胞条上的粘液物质覆盖,请患者彻底擤鼻涕。请父母帮助他们的孩子擤鼻涕。
- 如需刷牙,请使用 0.6 mm 大小的齿间刷(请参见 材料表)。用一只手固定患者的头部,另一只手刷两个鼻孔的下鼻甲,以收集足够的上皮细胞条。
注意:将齿间刷深埋在下鼻甲下方时,通常会遇到轻微的阻力。鼻刷通过快速转动和拾取约2秒进行。否则,长时间和剧烈的刷牙可能会导致严重的上皮损伤和连续的鼻衄。 - 如果计划进行支气管镜检查,除怀疑多氯二苯并对苯二恶英外,在支气管镜检查期间通过刷牙或支气管上皮或活检收集样本13.
- 将收获的细胞条放入含有滋养细胞的Dulbecco改良鹰培养基(DMEM)的1.5 mL微量离心管中。
注意:上皮细胞条通常通过对着管壁辗转和转动刷子更容易掉落。 - 合上微量离心管的盖子,并将离心管靠在光源上。摇动试管以发现收获的细胞条和砾岩。
- 标本的运输
- 将微量离心管放在密闭的聚苯乙烯盒中,并确保管的盖子正确关闭,管子固定在盒内。
- 添加冷敷;但是,避免冻结标本。
注意:在调查前保存试样的最佳温度约为4-8°C(39.2-46.4°F)。 - 确保在接下来的24小时内分析保存的样品。
注意:在这些实验中,刷牙和HSVMA之间的平均时间为3小时。
2. 高速视频显微镜分析
- 样品的视频显微镜检查
- 接收含有样品的微量离心管后,将其加热至37°C(98.6°F)以模拟最佳的 体内样环境。
- 如果显微镜配备了加热装置,请将试管放在引擎盖下并在那里加热。或者,使用培养箱预热样品。
- 启动PC上视频单元的相机和软件。
- 使用移液器,取少量样品,将两滴放入比色皿或玻璃底培养皿中(参见 材料表)。用盖子盖住比色皿或盘子,并将其放在显微镜下。
- 为了评估样品,请使用配备冷光源的差分干涉显微镜和能够以高速(至少200帧/秒)记录的摄像机。使用放大倍率为100倍的油浸透镜,并将一滴浸油滴在光学元件的表面上。
注意:建议使用从下方接近透镜的显微镜。 - 用显微镜镜片接近培养皿的底部,寻找没有红细胞且粘液含量低的细胞簇。找到具有代表性的兴趣区域(ROI)后,将重点放在具有最大纤毛运动的特定一组跳动纤毛上,并录制视频序列。记录从侧面和从上方跳动纤毛的细胞。之后,搜索另一个具有代表性的细胞簇并重复记录。
注意:必须在1,000倍放大镜下研究纤毛包被的细胞,并且应使用以200 / s或更高帧速率(在本方案中为256 / s)设置的数字高速视频(DHSV)相机记录跳动纤毛。由于从录制的视频剪辑中获取的数据需要在硬盘驱动器上占用大量空间,因此建议使用外部SSD硬盘驱动器。
- 视频序列分析
- 要确定 CBF 和 CBP,请逐帧播放视频剪辑。
- 要确定 CBF,请将帧速率设置为 15 帧/秒的慢动作,并计算 10 个连续节拍。
- 记录在 10 次节拍的单个周期内经过的帧数,并将结果插入到等式 (1) 中。通过计算所有记录的纤毛搏动周期的平均值来确定频率,并将结果与年龄的参考值进行比较(见 表1)14。
(1)
其中 X 是在 10 次节拍的周期内经过的帧数。 - 为了评估CBP,观察跳动纤毛的运动是否在全范围内(见 图1)并同步。让两个独立的操作员评估CBP以防止选择偏差。
- 报告 HSVMA 分析结果与 PCD 兼容、不太可能或不确定。
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Representative Results
视频 1 和 视频 2 显示了 CBF 和 CBP 处于正常范围的正常控制(参见 图 1)。 视频3, 视频4, 视频5和 视频6 代表了两例PCD患者在 DNAH11 基因中纯合突变(c.2341G>A; p. Glu781Lys)3。之所以选择这些具有代表性的视频,是因为 DNAH11 基因突变的表型值得注意,因为由于缺乏形态学变化,它们无法通过TEM诊断3,4,5。
视频 3 显示了与 PCD 兼容的纤毛节拍的典型僵硬、最小移动模式。视频1和视频2中所示的正常全频模式不存在(见图1)。视频4显示了同一患者的序列(视频3),但从上面录制。视频 5 和视频 6 显示,在携带 DNAH11 基因突变的患者中,跳动纤毛的动力亢进、无效表型也与 PCD 相容。CBF如此之高,以至于无法确定。视频6来自同一位患者(视频5),但从上面录制。CBP 异常,不显示健康纤毛的全范围运动(参见图 1、视频 1 和视频 2)。
视频7 和 视频8 显示,一名患有复发性上气道感染的患者的病理性CBF和CBP横向(视频7)和上部(视频8);然而,PCD无法确定。在10 Hz时,CBF略低于正常年龄范围(见 表1),与对照视频序列的正常CBP(视频1, 视频2和 图1)相比,CBP异常,显示旋转睫状体运动。该病例尚无定论,必须考虑进一步的诊断措施,包括 nNO、TEM 和基因检测,尽管患者的临床表现提示 PCD。
如果严格进行刷牙程序,鼻子的上皮可能会受伤,并且可能发生鼻衄。如果标本中血细胞过多,则无法进行HSVMA分析,因为纤毛上皮细胞覆盖着红细胞涂层,如 视频9所示。
图1:正常睫状体卒中。 健康个体的睫状体卒中,显示正常正向和恢复卒中的整个范围。有效笔触(深蓝色)以鞭打的方式从左向右移动。恢复行程(浅蓝色)将纤毛从右向左移回起始位置。 请点击此处查看此图的大图。
视频 1:无 PCD 的患者纤毛运动正常,侧向观察。 缩写:PCD = 原发性睫状体运动障碍。请点击此处下载此视频。
视频2:没有PCD的患者从上方进行正常的纤毛运动。 缩写:PCD = 原发性睫状体运动障碍。请点击此处下载此视频。
视频 3:一名 DNAH11 基因突变的 PCD 患者的侧向视频序列 (c.2341G > A p. Glu781Lys)3,显示僵硬、几乎不对称的纤毛。缩写:PCD =原发性睫状体运动障碍;DNAH11 =动力蛋白手臂重链11基因。请点击此处下载此视频。
视频4:从上面录制的同一PCD患者的视频序列(视频3)。 缩写:PCD = 原发性睫状体运动障碍。请点击此处下载此视频。
视频5:PCD患者的横向视频序列显示一种完全不同的,运动过度但效率低下的纤毛跳动模式。患者是同一家庭的成员,并且与视频3和视频4中的患者具有相同的突变。缩写:PCD = 原发性睫状体运动障碍。请点击此处下载此视频。
视频6:来自同一PCD患者的视频序列(视频5),从上面录制。 缩写:PCD = 原发性睫状体运动障碍。请点击此处下载此视频。
视频 7:一名患有复发性上气道感染的 PCD 患者出现异常、不协调和纤毛运动缓慢的视频序列。 缩写:PCD = 原发性睫状体运动障碍。请点击此处下载此视频。
视频8:来自同一PCD患者的视频序列(视频7)。 缩写:PCD = 原发性睫状体运动障碍。 请点击此处下载此视频。
视频9:标本的视频序列,由于不小心刷牙而无法分析,导致鼻衄和红细胞叠加。 请点击此处下载此视频。
纤毛搏动频率 (Hz)* | ||||
年龄(岁) | 意味 着 | 标清 | 第5、95百分位 | 运动障碍性边缘跳动 (%) † |
0-6 | 12.9 | 2.3 | 10.0, 18.1 | 10.4 (0.0, 36.8) |
7-12 | 12.9 | 1.4 | 10.9, 15.0 | 9.1 (0.0, 40.3) |
13-18 | 12.6 | 1.7 | 10.9, 15.3 | 24.8 (0.0, 56.9) |
≥19 | 11.5 | 2.8 | 7.7, 15.5 | 5.8 (0.0, 24.3) |
*平均纤毛搏动频率、标准偏差 (SD) 以及第 5和第 95 百 分位数 | ||||
†表示(第 5 个,第 95 个百分位)显示睫状运动障碍区域的边缘百分比 |
表 1:正常拍频。正常,与年龄相关的睫状动脉搏动频率。该表是从Chilvers等人14修改而来的。*平均纤毛搏动频率、SD 以及第 5 和第 95 百 分位数。†表示(第 5 个,第 95 个百分位)显示睫状运动障碍区域的边缘百分比。缩写:SD = 标准偏差。
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Discussion
在这里,根据一线诊断来描述和使用HSVMA的PCD的诊断过程。尽管HSVMA相对容易建立,成本效益11,并且在有经验的手中是一种可靠的方法12,但HSVMA并不是一种没有陷阱的诊断措施。异常CBF和CBP可能是由于继发感染,导致支气管 - 呼吸道上皮炎症15,并且出于同样的原因,吸烟个体可能有异常的心跳频率16,17。此外,在确定PCD的诊断之前,应排除囊性纤维化。在判断患者样本与PCD相容之前,应使用两个独立收集的样本确认异常结果,需要新的刷牙和CBF和CBP的重新分析。这可能具有挑战性,特别是对于孩子。因此,一些研究人员建议培养从第一次刷牙中获得的上皮细胞,以避免重复刷牙9,15。
虽然支气管镜检查不是诊断PCD的首选,但如果是出于PCD以外的原因进行的,则可以通过刷支气管上皮或活检来在麻醉下获得样本13。继发感染可能改变纤毛运动和搏动频率。为了减少这些不良影响,建议使用广谱口服抗生素(如阿莫西林加克拉维酸或头孢菌素)进行为期两周的疗程,以针对常见的呼吸道病原体。尽管在PCD18的治疗中具有实质性的益处,但为此目的可能应避免使用大环内酯类药物,因为它们可能由于对击败纤毛19的促动力作用而改变CBF。此外,尽管文献中缺乏证据,抗生素应在刷牙和分析前至少48小时停用,以避免对CBF产生任何影响。在通过刷牙或活检获得的样品在含有抗生素的液体中培养的实验中,未观察到抗生素对CBF或CBP的实质性影响20,21,22。
虽然HSVMA被认为是欧洲最准确和可重复的技术,但由于选择偏差和上述问题,它承担了操作员错误的风险15。因此,几个小组最近开发了软件解决方案,以从数字图像中自动分析以克服这个问题23,24,25。由于这种自动化仍在开发中,作者使用两个独立的专家操作员手动分析CBF和CBP,从而获得了出色可靠的结果。
本文的代表性结果显示了 DNAH11 基因突变患者的视频片段。该基因的突变显示出正常的超微结构,因此具有这种突变的患者不能通过TEM诊断。透射电镜显示的纤毛超微结构正常,在所有PCD病例中可见高达30%6。此外,nNO可能是正常的,这种突变的动力过激表型(视频5 和 视频6),使得HSVMA与基因检测一起,是唯一可靠的诊断工具3,8。此外,儿科患者是PCD诊断的主要目标。在许多情况下,可以在新生儿26期观察到提示PCD的症状,这使得HSVMA成为一种快速的一线诊断措施,优于其他替代药物。
在北美的一项研究中,nNO已被检查并建议作为PCD27的一线诊断筛查试验。尽管据报道特异性和敏感性接近HSVMA(0.98 / 0.79),但必须注意的是,最年轻的患者年龄为5.1岁,平均年龄甚至高得多。还必须提到的是,一些研究人员报告了与PCD15相关的正常nNO值。因此,虽然在学龄前受试者中进行nNO的技术设备的改进仍在进行中,但HSVMA仍然是PCD唯一可靠的一线诊断,并且正常结果排除PCD,在所有年龄组中几乎100%确定性。
然而,要成为使用HSVMA诊断PCD的专家,需要高通量的正常和病理样品,这需要适当的培训和专业设备。这应该是强制性的,对于处理罕见肺部疾病的诊断和治疗的诊所来说,这将是有益的。无论出于何种原因,如果样品的处理构成障碍,则可以使用具有使用HSVMA的PCD诊断专业人员的中心。在这种情况下,治疗医生可以进行刷牙,并将样品送到诊断中心。一般来说,刷牙后应尽快对样品进行分析。然而,根据我们的经验,如果样品处理得当(参见方案步骤1.2),上皮细胞在刷牙20,22后保持重要并准备分析至少24小时。大多数自行执行HSVMA的中心通常在采样15的4小时内进行分析。在任何情况下,在最终分析之前,应将样品加热到体温,以模拟最佳的体内条件。
如本文前面所述,使用HSVMA的PCD诊断过程中存在陷阱,特别是对于不确定的病例,例如代表性结果部分(视频7 和 视频8)中描述的病例。对于PCD的最终诊断,可用的指南表明,有时需要一系列不同的诊断措施9,10,15,最重要的是,没有单一的测试或测试组合可以100%确定地诊断PCD。然而,应鼓励参与 PCD 诊断和治疗的每个单位使用 HSVMA 作为一线诊断的工具。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们要特别感谢儿科护士Johanna Juvankoski女士在刷牙方面的出色帮助。我们还要特别感谢Heymut Omran教授(UKM明斯特大学诊所)允许使用其网站上的正常睫状运动示意图。最后,我们要感谢PGCE的Alan Brown BA(Hons)先生校对手稿。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Amoxiciline-clavulanic acid | Orion Oyj | 40 mg/kg divided in 2 doses/day, for adults 875/125 mg 1 tablet x2/day | |
Camera Software | Hamamatsu | HCI Image | |
Cold pack | any | for preservation and transport | |
Differential interference microscope | Carl Zeiss | Inverted, cell observer microscope | |
Digitial High Speed Video Camera | Hamamatsu | Orca Flash 4.0, digital camera type C11440 | |
Dulbecco´s Modified Eagle Medium | Thermo Fisher | 10565018 | basal cell culture medium |
Eppendorf tube | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL tube |
Glass-bottom microwell dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | cuvette for microscopy |
Heating Unit | Carl Zeiss/PeCon | 810-450001 | Carl Zeiss incubation elements with PeCon TempModule S1 temperature control |
Interdental brush 0.6 mm | Doft | 872267 | Interdental brush on a long wire with a reusable handle and cap in zipbag |
Objective | Carl Zeiss | 100x/1.46, α Plan-Apochromat DIC objective | |
Small polystyrene box with lid | any | for transport |
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