هنا ، نقدم محاكاة miRNA الخارجية المركبة صناعيا إلى الكلى عن طريق حقن الوريد الخلفي لناقل غير فيروسي وجسيمات نانوية بولي إيثيلينيمين في العديد من نماذج الفئران لأمراض الكلى. أدى ذلك إلى إفراط كبير في التعبير عن miRNA المستهدف في الكلى ، مما أدى إلى تثبيط تطور مرض الكلى في العديد من نماذج الفئران.
الحمض النووي الريبي الصغير (miRNAs) ، الحمض النووي الريبي الصغير غير المشفر (21-25 قاعدة) التي لا تترجم إلى بروتينات ، تمنع الكثير من الحمض النووي الريبي المرسال المستهدف (mRNAs) عن طريق زعزعة استقرار وتثبيط ترجمتها في أمراض الكلى المختلفة. لذلك ، فإن تناوب تعبير miRNA عن طريق محاكاة miRNA الخارجية المركبة صناعيا هو خيار علاجي مفيد محتمل لتثبيط تطور العديد من أمراض الكلى. ومع ذلك ، نظرا لأن الحمض النووي الريبي في المصل يتحلل على الفور من محاكاة miRNA الخارجية التي يتم تناولها بشكل منهجي في الجسم الحي ، فإن توصيل miRNA إلى الكلى لا يزال يمثل تحديا. لذلك ، فإن النواقل التي يمكن أن تحمي محاكاة miRNA الخارجية من التدهور بواسطة RNAase وتوصيلها بشكل كبير إلى الكلى ضرورية. استخدمت العديد من الدراسات النواقل الفيروسية لتوصيل محاكيات أو مثبطات miRNA الخارجية إلى الكلى. ومع ذلك ، قد تسبب النواقل الفيروسية استجابة للإنترفيرون و / أو عدم الاستقرار الجيني. لذلك ، فإن تطوير النواقل الفيروسية هو أيضا عقبة أمام الاستخدام السريري لمحاكاة أو مثبطات miRNA الخارجية. للتغلب على هذه المخاوف المتعلقة بالنواقل الفيروسية ، قمنا بتطوير طريقة ناقل غير فيروسي لتوصيل محاكاة miRNA إلى الكلى باستخدام حقن الوريد الذيلي لجسيمات البولي إيثيلين النانوية (PEI-NPs) ، مما أدى إلى إفراط كبير في التعبير عن miRNAs المستهدفة في العديد من نماذج الفئران لأمراض الكلى.
miRNAs ، الحمض النووي الريبي الصغير غير المشفر (21-25 قاعدة) التي لا تترجم إلى بروتينات ، تمنع الكثير من الحمض النووي الريبي المرسال المستهدف (mRNAs) عن طريق زعزعة استقرارها وتثبيط ترجمتها في أمراض الكلى المختلفة 1,2. لذلك ، فإن العلاج الجيني الذي يستخدم مقلدات أو مثبطات miRNA الخارجية المركبة صناعيا هو خيار جديد محتمل لتثبيط تطور العديد من أمراض الكلى3،4،5.
على الرغم من الوعد بمحاكاة أو مثبطات miRNA للعلاج الجيني ، إلا أن توصيله إلى الأعضاء المستهدفة لا يزال يمثل عقبة كبيرة أمام التجارب في الجسم الحي لتطوير إمكاناتها السريرية. نظرا لأن محاكيات أو مثبطات miRNA المركبة صناعيا تخضع للتدهور الفوري بواسطة مصل RNase ، يتم تقصير عمر النصف عند الإدارة الجهازية في الجسم الحي6. بالإضافة إلى ذلك ، فإن كفاءة miRNA تحاكي أو مثبطات عبور غشاء البلازما والسيتوبلازم المنقول بشكل عام أقل بكثير بدون ناقلات مناسبة 7,8. تشير خطوط الأدلة هذه إلى أن تطوير نظام توصيل miRNA يحاكي أو مثبطات الكلى مطلوب ، لتمكين استخدامها في الإعدادات السريرية وجعلها خيارا علاجيا جديدا للمرضى الذين يعانون من أمراض الكلى المختلفة.
تم استخدام النواقل الفيروسية كناقلات لتوصيل محاكيات miRNA الخارجية أو مثبطات إلى الكلى 9,10. على الرغم من أنها قد تم تطويرها من أجل السلامة الأحيائية وفعالية النقل ، إلا أن النواقل الفيروسية قد تسبب استجابة للإنترفيرون و / أو عدم الاستقرار الجيني11,12. للتغلب على هذه المخاوف ، قمنا بتطوير miRNA يحاكي نظام توصيل الكلى باستخدام جسيمات البولي إيثيلين النانوية (PEI-NPs) ، وهو ناقل غير فيروسي ، في العديد من نماذج الفئران لأمراض الكلى13،14،15.
PEI-NPs هي NPs خطية قائمة على البوليمر يمكنها توصيل قليل النيوكليوتيدات بشكل فعال ، بما في ذلك محاكاة miRNA ، إلى الكلى ، وتعتبر مفضلة لإعداد النواقل غير الفيروسية بسبب سلامتها على المدى الطويل وتوافقها الحيوي13،16،17.
توضح هذه الدراسة آثار محاكاة miRNA الخارجية المنهجية للتوصيل باستخدام PEI-NPs عن طريق حقن الوريد الذيل في الفئران النموذجية للتليف الكلوي التي ينتجها انسداد الحالب أحادي الجانب (UUO). بالإضافة إلى ذلك ، نوضح آثار محاكاة miRNA الخارجية المنهجية للتوصيل باستخدام PEI-NPs عبر حقن الوريد الذيل في الفئران النموذجية لمرض الكلى السكري (الفئران db / db: C57BLBS / J Iar – + Leprdb / + Leprdb) والفئران النموذجية لإصابة الكلى الحادة التي تنتجها إصابة نقص التروية الكلوية (IRI).
باستخدام البروتوكول المقدم في هذه المخطوطة ، يمكن ل PEI-NPs توصيل محاكاة miRNA إلى الكلى للحث على الإفراط في التعبير عن miRNAs المستهدفة ، مما يؤدي إلى تأثيرات علاجية في نماذج الفئران في الجسم الحي للعديد من أمراض الكلى ، بما في ذلك التليف الكلوي ومرض الكلى السكري و AKI.
طريقة تحض…
The authors have nothing to disclose.
تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل JSPS KAKENHI (المنحة رقم 21K08233). نشكر Edanz (https://jp.edanz.com/ac) على تحرير مسودات هذه المخطوطة.
4’,6-diamidino-2-phenylindole for staining to nucleus | Thermo Fisher Scientific | D-1306 | |
Buffer RPE | Qiagen | 79216 | Wash buffer 2 |
Buffer RWT | Qiagen | 1067933 | Wash buffer 1 |
Control-miRNA-mimic (artificially synthesized miRNA) | Thermo Fisher Scientific | Not assigned | 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT- 3’ (sense) 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′ (antisense) |
Cy3-labeled double-strand oligonucleotides | Takara Bio Inc. | MIR7900 | |
Fluorescein-labeled Lotus tetragonolobus lectin | Vector Laboratories Inc | FL-1321 | |
In vivo-jetPEI | Polyplus | 101000021 | |
MicroAmp Optical 96-well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Adhesive film for 96-well reaction plate |
miRNA-146a-5p mimic (artificially synthesized miRNA) | Thermo Fisher Scientific | Not assigned | 5’-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGU UT-3′ (sense) 5’-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU -3′ (antisense) |
miRNA-146a-5p primer | Qiagen | MS00001638 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
miRNA-181b-5p mimic (artificially synthesized miRNA) | Gene design | Not assigned | 5’-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGG GUU-3’ |
miRNA-181b-5p primer | Qiagen | MS00006083 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
miRNA-5100-mimic (artificially synthesized miRNA) | Gene design | Not assigned | 5’-UCGAAUCCCAGCGGUGCCUCU -3′ |
miRNA-5100-primer | Qiagen | MS00042952 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Membrane anchored spin column in a 2.0-mL collection tube |
miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
QIA shredder | Qiagen | 79654 | Biopolymer spin columns in a 2.0-mL collection tube |
QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | Phenol/guanidine-based lysis reagent |
QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument |
QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument software |
RNase-free water | Qiagen | 129112 | |
RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
Tissue-Tek OCT (Optimal Cutting Temperature Compound) | Sakura Finetek Japan Co.,Ltd. | Not assigned |