Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Restspecifik udveksling af prolin ved hjælp af prolinanaloger i fluorescerende proteiner: Hvordan "molekylær kirurgi" af rygraden påvirker foldning og stabilitet

Published: February 3, 2022 doi: 10.3791/63320
Automatic Translation
1, 2, 3, 1,2, 1
1Institute of Chemistry, Technische Universität Berlin, 2Department of Chemistry, University of Manitoba, 3Institute of Physics, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg

Summary

For at overvinde begrænsningerne ved klassisk stedstyret mutagenese blev prolinanaloger med specifikke modifikationer inkorporeret i flere fluorescerende proteiner. Vi viser, hvordan udskiftningen af hydrogen med fluor eller af singlen med dobbeltbindinger i prolinrester ("molekylær kirurgi") påvirker grundlæggende proteinegenskaber, herunder deres foldning og interaktion med lys.

Abstract

Udskiftning af prolinrester (Pro) i proteiner med den traditionelle stedstyrede mutagenese med en af de resterende 19 kanoniske aminosyrer er ofte skadelig for proteinfoldning og især kromoformodning i grønne fluorescerende proteiner og beslægtede varianter. Et rimeligt alternativ er at manipulere oversættelsen af proteinet, så alle Pro-rester erstattes af rester - specifikt af analoger, en metode kendt som selektiv trykinkorporering (SPI). De indbyggede kemiske modifikationer kan bruges som en slags "molekylær kirurgi" til fint at dissekere målbare ændringer eller endda rationelt manipulere forskellige proteinegenskaber. Her viser undersøgelsen nytten af SPI-metoden til at studere prolinernes rolle i organisationen af den typiske β-tønde struktur af spektrale varianter af det grønne fluorescerende protein (GFP) med 10-15 proliner i deres rækkefølge: forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP), NowGFP og KillerOrange. Pro-rester er til stede i forbindelsessektioner mellem individuelle β-strenge og udgør tøndestilladsets lukkelåg og er således ansvarlige for isolering af kromoforen fra vand, dvs. fluorescensegenskaber. Selektive trykinkorporeringsforsøg med (4R)-fluorprolin (R-Flp), (4S)-fluorprolin (S-Flp), 4,4-difluorprolin (Dfp) og 3,4-dehydroprolin (Dhp) blev udført under anvendelse af en prolin-auxotrofisk E. coli-stamme som ekspressionsvært. Vi fandt ud af, at fluorescerende proteiner med S-Flp og Dhp er aktive (dvs. fluorescerende), mens de to andre analoger (Dfp og R-Flp) producerede dysfunktionelle, misfoldede proteiner. Inspektion af UV-Vis absorptions- og fluorescensemissionsprofiler viste få karakteristiske ændringer i proteinerne indeholdende Pro-analoger. Undersøgelse af de foldbare kinetiske profiler i EGFP-varianter viste en accelereret omfoldningsproces i nærvær af S-Flp, mens processen lignede vildtype i proteinet indeholdende Dhp. Denne undersøgelse viser SPI-metodens evne til at producere subtile modifikationer af proteinrester på atomart niveau ("molekylær kirurgi"), som kan vedtages til undersøgelse af andre proteiner af interesse. Det illustrerer resultaterne af prolinudskiftninger med tætte kemiske analoger på folde- og spektroskopiske egenskaber i klassen af fluorescerende proteiner med β tønde.

Introduction

Klassisk stedstyret mutagenese tillader permutation af enhver eksisterende genkodet proteinsekvens ved kodonmanipulation på DNA-niveau. For at studere proteinfoldning og stabilitet er det ofte ønskeligt at erstatte lignende aminosyrer med lignende modstykker. Imidlertid er traditionel proteinmutagenese bestemt begrænset til strukturelt lignende udskiftninger blandt kanoniske aminosyrer som Ser / Ala / Cys, Thr / Val, Glu / Gln, Asp / Asn, Tyr / Phe, som er til stede i standard genetisk kode repertoire. På den anden side er der ingen sådanne muligheder for andre kanoniske aminosyrer som Trp, Met, His eller Pro, som ofte spiller væsentlige strukturelle og funktionelle roller i proteiner1. En ideel tilgang til at studere disse interaktioner i forbindelse med den meget specifikke interne arkitektur af proteiner og deres foldeproces er at generere ikke-forstyrrende isosteriske modifikationer. Når isosteriske aminosyreanaloger af disse kanoniske aminosyrer, også kendt som ikke-kanoniske aminosyrer (ncAA'er), indsættes i proteiner, tillader de subtile ændringer selv på niveau med enkeltatomer eller atomgrupper såsom H / F, CH2 / S / Se / Te kendt som "atommutationer"2. En sådan "molekylær kirurgi" producerer ændrede proteiner, hvis egenskaber udelukkende skyldes udveksling af enkeltatomer eller grupper af atomer, som i gunstige tilfælde kan analyseres, og de detekterede ændringer kan rationaliseres. På denne måde udvides omfanget af proteinsyntese til undersøgelse af proteinfoldning og struktur langt ud over klassisk DNA-mutagenese. Bemærk, at proteiner genereret af stedstyret mutagenese normalt betegnes som "mutanter", mens proteiner med substituerede kanoniske aminosyrer betegnes som "varianter" 3, "alloproteiner"4 eller "proteinkongenere"5.

Det grønne fluorescerende protein (GFP), der først blev identificeret i den marine organisme Aequorea victoria, udviser lysegrøn fluorescens, når den udsættes for ultraviolet-til-blåt lys 6,7. I dag bruges GFP almindeligvis som et meget følsomt mærkningsværktøj til rutinemæssig visualisering af genekspression og proteinlokalisering i celler via fluorescerende mikroskopi. GFP har også vist sig nyttig i forskellige biofysiske 8,9,10 og biomedicinske 11,12 undersøgelser samt i proteinteknik 13,14,15. Streng analyse af GFP-strukturen muliggjorde oprettelsen af adskillige varianter præget af varieret stabilitet og fluorescensmaksemaksima 16,17. De fleste af de GFP-varianter, der anvendes i celle- og molekylærbiologi, er monomere proteiner både i opløsning og i krystal18. Deres vigtigste strukturelle organisation er typisk for alle medlemmer af GFP-familien, uafhængig af deres fylogenetiske oprindelse, og består af 11 β-strenge, der danner en såkaldt β-tønde, mens en knækket α-helix løber gennem midten af tønden og bærer kromoforen (figur 1A). Den autokatalytiske modning af kromoforen (figur 1B) kræver præcis placering af sidekæderne omkring den på proteinets centrale sted; mange af disse sidekæder er stærkt bevaret i andre GFP-varianter19. I de fleste fluorescerende proteiner fra vandmænd som Aequorea victoria består den grønnemitterende kromofor af to aromatiske ringe, herunder en phenolring af Tyr66 og den femleddede heterocykliske struktur af imidazolinon (figur 1B). Kromoforen, når den er korrekt indlejret i proteinmatrixen, er ansvarlig for den karakteristiske fluorescens af hele proteinet. Den er placeret i midten af strukturen, mens tøndestrukturen isolerer den fra det vandige medium20. Eksponering af kromoforen for bulkvandet ville resultere i fluorescensslukning, dvs. tab af fluorescens21.

Den korrekte foldning af den tøndelignende struktur er afgørende for at beskytte kromoforen mod fluorescensslukning22. Prolin (Pro) rester spiller en særlig rolle i den strukturelle organisation af GFP23. Da de ikke er i stand til at understøtte en β-streng, udgør de forbindelsessløjfer, der er ansvarlige for at opretholde proteinstrukturen som helhed. Ikke overraskende findes 10-15 prolinrester i både Aequorea- og Anthoathecata-afledte GSP'er; nogle af dem er stærkt bevaret i andre typer fluorescerende β-tønde proteiner. Proliner forventes kritisk at påvirke foldeegenskaber på grund af deres ejendommelige geometriske egenskaber. For eksempel danner ni i Aequorea-afledte GMP'er af de ti prolinrester (figur 2A) trans- og kun en danner en cis-peptidbinding (Pro89). Pro58 er essentiel, dvs. ikke udskiftelig med resten af de 19 kanoniske aminosyrer. Denne rest kan være ansvarlig for den korrekte placering af Trp57-restproduktet, som er rapporteret at være afgørende for kromoformodning og den samlede GFP-foldning24. Fragmentet PVPWP med tre prolinrester (Pro54, Pro56, Pro58) og Trp57 er den væsentlige del af det "nedre låg" i GFP-strukturen fra figur 1A. PVPWP-strukturmotivet findes i flere proteiner såsom cytokromer og eukaryote spændingsaktiverede kaliumkanaler25. Prolin-til-alanin-substitutioner i positionerne 75 og 89 er også skadelige for proteinekspression og foldning og afskaffelse af kromoformodning. Pro75 og Pro89 er en del af det "øvre låg", der begraver kromoforen (figur 1A) og bevares på tværs af 11-strengede fluorescerende proteiner β tønde23. Disse to "låg" holder kromoforen udelukket fra det vandige opløsningsmiddel, selv når den stabile tertiære struktur er delvist brudt26. En sådan specifik molekylær arkitektur beskytter fluoroforen mod kollisionel (dynamisk) fluorescensslukning, f.eks. ved vand, ilt eller andre diffusible ligander.

For at udføre molekylær teknik af GFP-strukturen bør man indføre aminosyresubstitutioner i proteinets primære struktur. Talrige mutationer er blevet udført på GFP, hvilket giver varianter med forhøjet stabilitet, hurtig og pålidelig foldning og variable fluorescensegenskaber17. Ikke desto mindre betragtes mutation af prolinrester i de fleste tilfælde som en risikabel tilgang på grund af det faktum, at ingen af de resterende 19 kanoniske aminosyrer korrekt kan genoprette prolinrestens konformationsprofil27. Således er der udviklet en alternativ tilgang, hvor prolinrester erstattes med andre prolinbaserede strukturer, kaldet prolinanaloger28. På grund af sin unikke cykliske kemiske struktur udviser prolin to karakteristiske konformationsovergange (figur 1C): 1) prolinringen puckering, en hurtig proces, der indebærer organisering af rygraden, som primært påvirker φ torsionsvinkel, og 2) peptidbinding cis / trans isomerisering, en langsom proces, der påvirker rygradsfoldning via ω torsionsvinklerne. På grund af sin langsomme natur er sidstnævnte overgang almindeligvis ansvarlig for de hastighedsbegrænsende trin i foldeprocessen af hele proteinet. Det har tidligere vist sig, at peptidbinding cis / trans-isomerisering omkring nogle prolinrester har langsomme trin i foldningen af GFP-varianter. For eksempel har dannelsen af cis-peptidbindingen ved Pro89 det langsomme trin i foldningsprocessen, fordi den er afhængig af bindingsovergangen fra trans til cis29. En hurtigere omfoldning kan opnås efter udskiftning af Pro89 med en all-trans peptid loop, dvs. ved at afskaffe en cis-to-trans isomeriseringshændelse 30. Ud over cis / trans-isomeriseringen kan puckerovergangene også generere dybtgående ændringer i proteinfoldning på grund af rygradsorganisationen og pakningen inden for proteininteriøret27,31.

Kemiske modifikationer resulterer i ændring af prolinresternes iboende konformationsovergange og påvirker derved proteinets evne til at folde. Visse prolineanaloger er særligt attraktive kandidater til prolinsubstitution i proteiner, da de tillader manipulation og undersøgelse af foldeegenskaberne. For eksempel er (4R)-fluorprolin (R-Flp), (4S)-fluorprolin (S-Flp), 4,4-difluoroprolin (Dfp) og 3,4-dehydroprolin (Dhp) fire analoger (figur 1D), der adskiller sig minimalt fra prolin med hensyn til både molekylært volumen og polaritet32. Samtidig udviser hver analog en særskilt ringpuckering: S-Flp stabiliserer C 4-endo puckeren, R-Flp stabiliserer C 4-exo puckeren, Dfp udviser ingen tilsyneladende pucker præference, mens Dhp afskaffer puckering (figur 1D) 33. Ved at anvende disse analoger i proteinstrukturen kan man manipulere med den konformationelle overgang af prolinresterne og dermed påvirke egenskaberne af de resulterende GFP-varianter.

I dette arbejde satte vi os for at indarbejde det udpegede sæt prolineanaloger (figur 1D) i strukturen af GFP-varianter ved hjælp af den selektive trykinkorporeringsmetode (SPI, figur 3)34. Udskiftning af aminosyrerester med deres nærmeste isostrukturelle analoger er et anvendt bioteknologisk koncept i proteindesign35,36. Således illustrerer virkningerne af prolinanaloger i et modelprotein deres potentiale til at tjene som værktøjer inden for proteinteknik37. Produktionen af proteiner indeholdende ønskede analoger blev udført i modificerede E. coli-stammer, der ikke er i stand til at producere prolin (prolin-auxotrofi). Således kunne de blive tvunget til at acceptere udskiftning af substrater i processen med proteinbiosyntese38. Denne globale substitution af prolin er muliggjort af den naturlige substratfleksibilitet af endogene aminoacyl-tRNA-syntetaser39, de vigtigste enzymer, der katalyserer esterificeringen af tRNA'er med passende aminosyrer40. Generelt, som skitseret i figur 3, udføres cellulær vækst i et defineret medium, indtil den midterste logaritmiske vækstfase er nået. I det næste trin udtømmes aminosyren, der skal udskiftes, intracellulært fra ekspressionssystemet under fermentering og udveksles efterfølgende med den ønskede analog eller ncAA. Målproteinekspression induceres derefter til restspecifik ikke-kanonisk aminosyreinkorporering. Substitutionen af den kognataminosyre med dens analog forekommer på en proteom-bred måde. Selv om denne bivirkning kan have en negativ indvirkning på væksten af værtsstammen, påvirkes kvaliteten af målproteinproduktionen for det meste ikke, da de cellulære ressourcer i rekombinant ekspression hovedsageligt er rettet mod produktionen af målproteinet 41,42. Derfor er et stramt reguleret, inducerbart udtrykssystem og stærke promotorer afgørende for høj inkorporeringseffektivitet43. Vores tilgang er baseret på flere restspecifikke inkorporelser af ncA'er som reaktion på sansekodoner (sense codon-omfordeling), hvorved antallet af positioner til Pro-analog indsættelse inden for målgenet kan manipuleres via stedstyret mutagenese44. En lignende tilgang blev anvendt i vores tidligere rapport om fremstilling af rekombinante peptider med antimikrobielle egenskaber45. I dette arbejde har vi anvendt SPI-metoden, som gør det muligt at erstatte alle prolinrester med beslægtede analoger for at generere proteiner, der forventes at have forskellige fysisk-kemiske egenskaber, der ikke er til stede i proteiner syntetiseret med det kanoniske aminosyrerepertoire. Ved at karakterisere folde- og fluorescensprofilen for resulterende varianter sigter vi mod at fremvise virkningerne af atomsubstitutioner i varianter af GFP.

Protocol

1. Introduktion af ekspressionsplasmider i kompetente pro-auxotrofiske E. coli-celler

  1. Bland 1 ng af hver prøveplasmid, pQE-80L H 6-EGFP, pQE-80L H6-NowGFP og pQE-80L H6-KillerOrange, med 50 μL kemisk kompetente eller elektrokompetente celler i den pro-auxotrofe E. coli K12-afledte stamme JM83 (Addgene #50348 eller ATCC #35607) til transformation ved hjælp af varmechokmetoden eller elektroporation i henhold til de tilgængelige protokoller46 47.
    BEMÆRK: Ekspressionsvektoren pQE-80L EGFP-H6 koder for et C-terminalt 6xHis-mærket forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP), ekspressionsvektorerne pQE-80L H 6-NowGFP og pQE-80L H6-KillerOrange koder for henholdsvis en N-terminalt 6xHis-mærket NowGFP48 eller en N-terminalt 6xHis-mærket KillerOrange49, hver i en pQE-80L plasmid rygrad. Alle målgener er under kontrol af en bakteriel T5-promotor reguleret af lac-operatøren. Ampicillinresistens blev anvendt som en udvælgelsesmarkør og colE1 som replikationens oprindelse. Se materialetabellen for yderligere oplysninger om pQE-80L plasmidet. Alternativ pro-auxotrofisk E. coli, der stammer fra stammer K-12 og B, kan også anvendes til ekspression og bør give lignende resultater. Den beregnede molekylmasse af deH6-mærkede enkelte protonerede ([M+H]+) vildtypeproteiner (efter kromoformodning) er 27.745,33 Da (EGFP-H6), 27.931,50 Da (H6-NowGFP) og 27.606,09 Da (H6-KillerOrange). De primære strukturer af målproteinerne er angivet i tabel 1 (His-tag understreget). Glutamin (Q) inden for His-tag-sekvensen af NowGFP blev identificeret ved DNA-sekventering efter subkloning af NowGFP cDNA modtaget fra Pletnev et al.51 i pQE-80L plasmidet. Det hindrer ikke proteinrensning eller egenskaberne af det fluorescerende protein.
  2. Cellerne genvindes i 950 μL SOC-medium ved 37 °C i 1 time.
  3. 50 μL af de genvundne celler spredes på Luria Agar (LA) mellemstore plader (se supplerende materiale) indeholdende glucose (10 g/l) og ampicillin (100 μg/ml).
  4. Inkuber LA-mellempladerne ved 37 °C natten over eller 30 °C i 24 timer.

2. Produktion af rekombinante fluorescerende proteiner af vildtypen (indeholdende kanonisk prolin) og procedure for selektiv trykinkorporering (SPI) til fremstilling af fluorescerende proteiner med prolineanaloger (S-Flp, R-Flp, Dfp, Dhp)

  1. Overnatningskultur af Pro-auxotrofisk E. coli K12-afledt stamme JM83, der huser pQE-80L EGFP- H6, pQE-80L H 6-NowGFP og pQE-80L H 6-KillerOrange
    1. Brug en steril pipettespids eller podningssløjfe til at vælge en enkelt koloni fra en LA-mediumplade og resuspend cellerne i 5 ml Lysogeny Broth (LB) medium (se Supplerende materiale; indeholdende 10 g / L glucose, 100 μg / ml ampicillin) i et sterilt 14 ml polystyrenkulturrør.
      BEMÆRK: Frisktransformerede kolonier anbefales til podning. Celler på LA-mellemplader (fra trin 2.2.), der opbevares ved 4 °C, skal anvendes inden for få dage.
    2. Cellekulturen vokser natten over ved 37 °C i en orbital shaker ved 200-250 o/min.
  2. Produktion af rekombinant EGFP- H6, H6-NowGFP og H6-KillerOrange med native prolin og de tilsvarende proteinvarianter med prolinanaloger
    1. Inokuler 200 ml frisk NMM-medium (7,5 mM (NH4)2SO4, 50 mM K2HPO4 og 22 mM KH2PO4, 8,5 mM NaCl, 1 mM MgSO4, 20 mM D-glucose, 1 μg/ml FeCl2, 1 μg/ml CaCl2, 10 μg/ml thiamin, 10 μg/ml biotin, 0,01 μg/ml sporstoffer (CuSO4, ZnCl2, MnCl2, (NH4)2MoO4), pH ~7,2) med alle kanoniske l-aminosyrer (50 mg/l); se Supplerende materiale) suppleret med 100 μg/ml ampicillin med 2 ml af overnatningskulturen i en 2-L Erlenmeyer-kolbe.
      BEMÆRK: Afhængigt af proteintypen kan alternative dyrkningsmedier som MOPS medium52, glucose-mineralsalte medium53, Davis minimal medium54, M9 minimal medium55 eller GMML56 testes for at optimere proteinudbyttet.
    2. Inkuber cellerne ved 37 °C i en orbital ryster ved 220 o /min i ~3 timer og 30 min.
    3. Mål den optiske densitet ved 600 nm (OD600) i et spektrofotometer hvert 30. minut, indtil en OD600-værdi på ~ 0,7 er nået.
      BEMÆRK: Til OD600-bestemmelse i et spektrofotometer skal kuvetten have en banelængde på 1 cm. Det tilsvarende dyrkningsmedium anvendes til referencemålingen ("nul"). Inkubationstiden, indtil en OD600-værdi på ~ 0,7 er nået, kan afhænge af kulturvolumen. 3 timer 30 minutter er en omtrentlig værdi. I en variation af protokollens undertrin 2.2.1-2.2.3. kulturen fra undertrin 2.1.2. anvendes til at inokulere frisk NMMΔPro-medium (se supplerende materiale) suppleret med en begrænset koncentration af prolin (f.eks. 5 mg/l i stedet for 50 mg/l), og cellerne dyrkes natten over ved 37 °C i en orbitalryster ved 220 o/min. Den næste dag udføres OD600-bestemmelsen hvert 30. minut, indtil forskellene mellem målingerne er mindre end 0,05. Den maksimale OD600-værdi skal være omkring 1 (± 0,3). Den indledende, begrænsede prolinkoncentration kan justeres afhængigt af ekspressionsstammen og dyrkningsmediet (se Diskussion).
    4. Spin ned cellesuspensionen i 10 minutter ved 3.000 x g og 4 ° C.
    5. Dekanter forsigtigt supernatanten i affald.
    6. Vasketrin: Genophænd cellerne i 50 ml iskold NMMΔAA (uden aminosyre, se Supplerende materiale) eller NMMΔPro (uden prolin, se Supplerende materiale) medium ved omhyggelig pipettering.
      BEMÆRK: Til dette vasketrin kan en af de to angivne buffere bruges, da det kun er vigtigt at slippe af med resterende prolin i inkubationsmediet.
    7. Cellerne adskilles fra mediet ved sedimentering ved 4 °C i en centrifuge ved 3.000 x g i 10 min.
    8. Dekanter forsigtigt supernatanten i affald.
    9. Forsigtigt pipette op og ned for at resuspend cellepillen i 200 ml NMMΔPro medium suppleret med 100 μg/ml ampicillin i en 2-L Erlenmeyer-kolbe.
      BEMÆRK: Den resulterende cellesuspension kan adskilles i flere prøver med samme volumen for at opnå identiske startkulturer til sammenligning af proteinekspression i nærvær af Pro- eller prolinanaloger (f.eks. adskillelse i 4 x 50 ml i 100 ml Erlenmeyer-kolber).
    10. Inkuber i 30 minutter ved 37 °C i en orbital ryster ved 220 o / min for fuldstændig udtømning af Pro.
      BEMÆRK: Dette trin er afgørende for fuldstændigt at nedbryde Pro fra celler.
    11. Tilsæt et passende volumen af enten L-prolin eller R-Flp, S-Flp, Dfp og Dhp fra 50 mM stamopløsning for at justere 1 mM endelig koncentration i cellesuspensionen.
      BEMÆRK: Som hovedregel bør friske 50 mM lageropløsninger af Pro- eller prolinederivater altid fremstilles inden brug. Kun hvis hydrolyse af den pågældende kanoniske eller ikke-kanoniske aminosyre i en vandig opløsning ikke er bekymrende, kan frosne lagre også anvendes.
    12. Tilsæt 0,5 mM IPTG fra en 1 M stamopløsning for at inducere målproteinekspression.
    13. Målproteinet udtrykkes natten over (12 timer) ved 37 °C i en orbitalryster ved 220 o/min.
    14. Mål OD600 den næste dag.
      BEMÆRK: OD600-bestemmelse udføres for at kvantificere mængden af celler efter proteinekspression. En lavere OD600-værdi sammenlignet med den værdi, der blev målt før vasketrin 2.2.3, indikerer cytotoksicitet af den tilførte aminosyre. I dette tilfælde skal proceduren gentages med koncentrationen af den tilførte aminosyre minimeret (ned til 0,1 mM).
    15. Centrifuger og opsaml bakteriecellerne ved 5.000 x g og 4 °C i 10 minutter og dekanter supernatanten til affald.
    16. Vasketrin: Resuspend cellerne ved omhyggelig pipettering i 50 ml bindingsbuffer (50 mM Tris-HCI, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM DTT) indeholdende 10% glycerol og overfør cellesuspensionen til et 50 ml konisk polystyrenrør.
    17. Centrifuger og opsaml bakteriecellerne ved 5.000 x g og 4 °C i 10 minutter og dekanter supernatanten til affald.
    18. Cellepillen opbevares i et 50 ml konisk polystyrenrør ved -20 °C eller -80 °C indtil videre anvendelse (proteinrensning, se nedenfor).

3. Oprensningsprocedure for proteinprøver ved immobiliseret metalionaffinitetskromatografi (IMAC)

  1. Bakteriel cellelyse
    BEMÆRK: Udfør alle trin i cellelyse på is eller ved 4 °C for at forhindre nedbrydning af målproteinet.
    1. Tø bakteriecellepillen op på is eller ved 4 °C i et 50 ml konisk polystyrenrør i 10-20 minutter.
    2. Tilsæt 10 ml iskold bindingsbuffer (se Supplerende materiale) og pipetter forsigtigt op og ned for at resuspend cellepillen.
    3. Der tilsættes 100 μL 50 mg/ml lysozym, 100 μL 1 mg/ml DNase I, 100 μL 1 mg/ml RNase A, 30 μL 1 MMgCl2. Omvendt forsigtigt cellesuspensionen fem gange, og opbevar det lukkede rør på is eller ved 4 °C i 60 minutter.
      BEMÆRK: Lysozym inducerer kemisk cellelyse ved at forstyrre bakteriecellevæggen.
    4. Sonikere prøven til celleforstyrrelse ved hjælp af en ultralydhomogenisator (f.eks. 3 gange i 3 minutter i et 50 ml polystyrenrør på en isvandsblanding, puls 2 s / pause 4 s, 45% amplitude).
      BEMÆRK: Alternativt kan andre celleforstyrrelsesmetoder anvendes, f.eks. højtrykshomogenisering i 20 cyklusser ved 14.000 psi. Fortynd om nødvendigt med en bindende buffer (se Supplerende materiale) for at nå det minimale instrumentvolumen. Desuden kan proteinekstraktionsreagenser anvendes til celleforstyrrelse. Se eksempler på materialetabellen .
    5. Centrifuge i 60 minutter ved 18.000 x g, 4 °C.
    6. Noter væskevolumenet for undertrin 3.1.9. og hæld supernatanten i et frisk 50 ml polystyrenrør.
    7. Ryd supernatanten ved hjælp af et membranfilter med en porediameter på 0,45 μm.
    8. Tag en prøve af "lysat" for SDS-PAGE (se afsnit 4. nedenfor); dette svarer til "opløselig proteinfraktion", supernatanten fra undertrin 3.1.6.
    9. Der tilsættes et tilsvarende volumenddH20som bestemt i undertrin 3.1.6. at resuspendere celleaffaldet for at opretholde den samme fortynding af prøverne til efterfølgende SDS-PAGE-analyse.
    10. Tag en prøve af "pellet" til SDS-PAGE (se afsnit 4. nedenfor); dette svarer til "uopløselig proteinfraktion", suspensionen af celleaffald fra undertrin 3.1.9.
  2. Immobiliseret metalaffinitetskromatografi (IMAC) rensning
    BEMÆRK: Oprensning af målfluorescerende protein kan udføres ved 4 °C eller ved stuetemperatur (RT). For sidstnævnte mulighed skal du vente på, at lysatet, søjlen og alle buffere udligner ved RT for at forhindre dannelse af luftbobler på grund af fordampning af luft fanget i kold opløsning ved placering i en varm søjle.
    1. Prøven renses ved hjælp af en 1 ml færdigpakket eller selvpakket IMAC FPLC-kolonne (fast protein [eller ydeevne] væskekromatografi) i henhold til producentens anvisninger; indstil det maksimale søjletryk til 0,3 MPa og strømningshastigheden til 1 ml/min; anvende bindingsbuffer (se Supplerende materiale) til kolonneligevægt, vaskebuffer (se Supplerende materiale) til vasketrinnet og elueringsbuffer (se Supplerende materiale) til målproteineluering.
      BEMÆRK: Alternativt kan et automatiseret FPLC-system anvendes til at eluere målproteinet med elueringsbuffer, der kører en lineær imidazolkoncentrationsgradient (20-200 mM).
    2. Saml og saml eluatfraktionerne med fluorescerende proteiner (vælg efter synlig grøn eller orange farve).
    3. Overfør de samlede fraktioner til en dialysemembran (molekylvægtsafskæring (MWCO) på 5.000-10.000) i henhold til producentens anvisninger og dialyser mindst tre gange mod dialysebuffer eller MS-buffer (se Supplerende materiale). Udfør f.eks. dialyse af en prøve på 1 ml tre gange mod 100 ml buffer i mindst 2 timer hver runde. For en detaljeret protokol henvises til Budisa et al.34.
    4. Der forberedes en 1:100 gange fortynding af den dialyserede elueringsfraktion i PBS-buffer (se Supplerende materiale).
    5. Absorbansspektret for de fortyndede prøver registreres i et UV-Vis-spektrofotometer.
    6. Beregn proteinkoncentrationen baseret på Lambert-Beer-loven som følger ved hjælp af litteraturværdier for de molære udryddelseskoefficienter, ε ved specifik bølgelængde (for EGFP ved 488 nm ε488 = 55.000 cm-1· M-1, NowGFP ved 493 nm ε493 = 53.600 cm-1· M-1, KillerOrange ved 514 nm ε514 = 22.600 cm-1· M-1):
      Equation 1 (Lambert-Øl lov)
      c-protein = proteinkoncentration [mg/ml]
      A = absorbans ved specifik bølgelængde
      ε = molær udryddelseskoefficient ved specifik bølgelængde [M-1·cm-1]
      d = kuvette sti længde, her 1 cm
      MW = molekylvægt af protein [g/mol]
      Brug dialysebuffer (se supplerende materiale) til referencemålingen ("nul").
    7. Tag en prøve af "eluat" for SDS-PAGE (se afsnit 4 nedenfor), læg 1-10 μg protein (beregnet i henhold til det foregående trin) pr. Prøvebrønde for Coomassie Brilliant Blue-stained gels.
      BEMÆRK: Juster SDS-prøvemængder afhængigt af den påførte farvningsmetode og farvestoffets følsomhed, hvis der anvendes forbindelser, der adskiller sig fra Coomassie Brilliant Blue, til farvning af proteinbånd.
    8. Proteinprøven fryses og opbevares i dialysebuffer (se supplerende materiale) ved -80 °C.
      BEMÆRK: Under denne opbevaringstilstand skal proteinprøver være stabile i mindst 6 måneder. Alternative laboratorie-UV-Vis- og fluorescensspektrofotometre kan anvendes til registrering af absorptions- og fluorescensemissionsspektre af målproteiner. Følgende excitationsbølgelængder kan anvendes til fluorescensemissionsmålinger: 488 nm (EGFP), 493 nm (NowGFP) og 510 nm (KillerOrange).

4. SDS-PAGE prøveforberedelse

  1. Absorbans A bestemmes ved 280 nm (A280 nm) for prøver "eluat", "lysat" og "pellet" fra afsnit 3. Juster sondevolumenet for at opnå A280nm = 2 ved at tilføje en passende mængde elueringsbuffer (det endelige sondevolumen skal være mindst 80 μL).
  2. Prøven blandes i et forhold på 4:1 (v/v) med 5x SDS-belastningsbuffer (se Supplerende materiale) ved pipettering, f.eks. 80 μL af prøven med 20 μL 5x SDS-belastningsbuffer.
  3. SDS-prøverne koges ved 95 °C i 5 minutter i et vandbad eller en varmeblok for at denaturere proteinerne.
  4. Lad prøverne køle af til RT, og drej sonderne ned ved 13.000 x g i 1 minut i en mikrocentrifuge, inden de lægges på gelen.
  5. Brug 5-10 μL til Coomassie Brilliant Blue-stained SDS-PAGE. Du kan finde flere oplysninger om SDS-PAGE-proceduren i57.
    BEMÆRK: Juster SDS-prøvemængderne afhængigt af den påførte farvningsmetode og farvestoffets følsomhed. Resultatet af SDS-PAGE bør kontrolleres nøje for at sikre, at prøverne indeholder mere end 95 % af det samlede protein i et bånd svarende til den forventede molekylvægt af det ønskede protein. Til dette skal du tage et fotografi af den Coomassie-farvede gel og sammenligne intensiteten af proteinbåndet med ønsket molekylvægt med intensiteten af alle andre bånd i banen (hvis nogen) ved densitometri. Til densitometrisk evaluering af båndintensiteter kan softwaren ImageJ bruges58. For eksperimentelt at bevise inkorporeringen af de ønskede ncAA'er i det protein, der er af interesse, bør intakt proteinmasseanalyse ved højtydende væskekromatografi (HPLC) koblet til elektrosprayioniseringstid-of-flight massespektrometri (LC-ESI-TOF-MS) udføres som beskrevet59 (se protokol afsnit 5 og materialetabel deri for eksemplarisk udstyr).

5. Fluorescensemission af proteinvarianter

  1. Før proceduren skal du kontrollere resultatet fra SDS-PAGE-eksperimentet for at sikre, at prøvens renhed er >95% (se BEMÆRK efter trin 4.5.)
  2. Prøverne af hver oprenset proteinvariant justeres til en koncentration på 0,3 μM, idet den beregnede absorbansværdi ved den relevante bølgelængde anvendes som reference (undertrin 3.2.5.). Sørg for, at det omtrentlige endelige prøvevolumen er 200 μL.
  3. Lad de fortyndede prøver udligne i 1 time ved RT.
  4. Overfør prøverne til en 1 cm kvartskuvette og mål et fluorescensemissionsspektrum af prøverne ved hjælp af et fluorescensspektrometer (se materialetabellen) under anvendelse af følgende excitationsbølgelængder: 488 nm (for EGFP), 493 nm (for NowGFP), 510 nm (for KillerOrange).

6. Denaturering og omfoldning af EGFP-varianter

  1. Før proceduren skal du kontrollere resultatet fra SDS-PAGE-eksperimentet for at sikre, at prøvens renhed er >95% (se BEMÆRK efter trin 4.5.)
  2. For hver oprenset proteinvariant forberedes to prøver med et slutvolumen på 2 μL i en koncentration på 300 μM (se bestemmelse af proteinkoncentration i undertrin 3.2.4-3.2.6).
  3. Der tilsættes 18 μL 1,11x PBS-buffer (se supplerende materiale) indeholdende 8,89 M urinstof og 5,56 mM DTT til 2 μL af hver oprenset proteinvariant (for at opnå 1x PBS indeholdende 8 M urinstof og 5 mM DTT) for at fremkalde denaturering.
    BEMÆRK: I trin 6.4-6.6 skal du behandle hver prøve separat.
  4. Prøverne inkuberes i 5 minutter ved 95 °C.
  5. De 20 μL prøver fortyndes 100 gange ved at tilsætte 1980 μL 1x PBS (se supplerende materiale) indeholdende 5 mM DTT for at fremkalde renaturering, hvilket giver en endelig proteinkoncentration på 0,3 μM og straks overfører 200 μL af prøverne til en 1 cm kvartskuvette.
    BEMÆRK: Det er meget vigtigt at arbejde hurtigt her, da renaturering starter med det samme.
  6. Indsæt kvartskuvetten i et passende fluorescensspektrometer (se materialetabellen), og overvåg proteinfoldningen i prøverne ved at erhverve et fluorescensspektrum hver 3. s over 30 minutter. For hver proteinvariant skal der anvendes 295 nm fluorescensexcitation for den første prøve og 488 nm fluorescensexcitation for den anden.
  7. Overfør omfoldningsprøverne til 1,5 ml mikrocentrifugerør, luk låget, og opbevar prøverne på RT i mørke i 24 timer for at muliggøre fuldstændig omfoldning af EGFP-varianter.
  8. Fluorescensemission af genfoldede proteinprøver måles i henhold til trin 6.6 ved hjælp af den samme excitationsbølgelængde som før for at fange det tidsmæssige endepunkt for fluorescensgenvinding.

Representative Results

I begyndelsen af undersøgelsen valgte vi tre forskellige fluorescerende proteinvarianter, der deler den overordnede GFP-arkitektur. Det første protein, der blev valgt, var EGFP, som er en konstrueret variant afledt af den oprindelige GFP fra vandmanden Aequorea victoria indeholdende Phe64Leu / Ser65Thr mutationer. Det andet udvalgte protein var NowGFP 51,60. Det er også en variant af A. victoria GFP afledt af mutagenese i flere trin via forudgående fluorescerende proteiner. NowGFP indeholder 18 mutationer sammenlignet med sin umiddelbare forgænger fluorescerende protein "Cerulean"61. Til gengæld er proteinet "Cerulean" et derivat af det forbedrede cyanfluorescerende protein (ECFP)62,63, et protein, der tidligere er udvalgt af rettet laboratorieudvikling og indeholder en tryptofanbaseret kromofor. Både EGFP og NowGFP anvendes i vid udstrækning i cellebiologi og biofysiske undersøgelser, og de indeholder ti bevarede prolinrester i deres strukturer. Derudover har NowGFP en ellevte prolinrest i position 230, som optrådte på grund af den omfattende mutationshistorie for denne proteinvariant. Det tredje protein, der blev valgt, var KillerOrange fluorescerende protein64,65. Det er et derivat af kromoproteinet anm2CP fra hydrozoan slægten Anthoathecata. Proteinsekvensen indeholder 15 prolinrester, og kromoforen er baseret på en tryptofan snarere end en tyrosinrest. Røntgenstrukturer med høj opløsning er rapporteret for alle tre udvalgte proteiner (figur 2)51,65,66.

I det første trin blev prolinanaloger (figur 1D) indarbejdet i alle prolinpositioner af tre modelproteiner (EGFP, NowGFP og KillerOrange) ved selektiv trykinkorporering (SPI, et skema over proceduren er angivet i figur 3). Instrumentelt blev den prolin-auxotrofe E. coli K12-stamme JM8367 anvendt til ekspression af proteinerne i nærvær af prolin og analoger (figur 1D), hvilket gav henholdsvis vildtype og modificerede proteiner. Pellets fra celler, der udtrykker det oprindelige protein og varianter, der bærer S-Flp og Dhp, havde den typiske lyse farve på grund af den intakte kromofor, mens varianter indeholdende R-Flp og Dfp forblev farveløse, hvilket indikerer fejlfoldning og aflejring af udfoldet protein i inklusionslegemer (figur 4A). SDS-PAGE-analyse af de udtrykte prøver bekræftede tilstedeværelsen af uopløselige R-Flp-holdige proteiner (figur 4B-D), hvilket udelukkede yderligere undersøgelser. Selv om dette ligger uden for denne undersøgelses anvendelsesområde, skal det bemærkes, at problemer med proteinopløselighed og fejlfoldning til en vis grad kan afhjælpes ved hjælp af in vitro-omfoldningsprocedurer 68. I modsætning hertil blev indfødte proteiner såvel som S-Flp- og Dhp-bærende varianter hovedsageligt fundet i de opløselige fraktioner (figur 4B-D). Vildtypen, såvel som S-Flp- og Dhp-holdige varianter, kunne isoleres yderligere og karakteriseres i fluorescensundersøgelser. Opløselige proteiner blev oprenset ved immobiliseret metalionaffinitetskromatografi (IMAC), hvilket gav 20-30 mg/l dyrkningsvolumen for EGFP, 60-80 mg for NowGFP og KillerOrange, hvis udbytte for vildtype og modificerede proteiner var meget ens. Væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS)-koblet analyse bekræftede den forventede identitet og renhed af isolaterne opnået på denne måde (figur 5). I massespektrene producerede hver prolinudskiftning med S-Flp et +18 Da-skift pr. hver prolinrest i sekvensen, mens skiftet for prolin-til-Dhp-udskiftningen var -2 Da pr. Rest.

I det næste trin blev lysabsorption og emissionsspektre registreret for at analysere de potentielle virkninger af ikke-kanoniske prolinanaloger inkorporering på de spektroskopiske egenskaber af de overordnede fluorescerende proteiner (figur 6). UV-Vis-absorptionsspektre viste et typisk bånd omkring 280 nm, der var karakteristisk for aromatiske rester, tyrosin og tryptofan, mens kromoforabsorbansen blev fundet ved 488 nm for EGFP og 493 nm for NowGFP (figur 6A, B). I KillerOrange bestod kromoforabsorbanceområdet af to bånd (figur 6C), som svarer til to mulige konfigurations- og ladningstilstande for den komplekse kromofor. Båndet omkring 510 nm er kendt som den tilstand, hvorfra fluorescens forekommer med højt kvanteudbytte49,65. I prolinudskiftningsvarianterne blev følgende observeret: Inkorporering af Dhp ændrede ikke absorbansspektrene for EGFP og NowGFP, mens S-Flp producerede en forbedret UV-absorption. Sidstnævnte kan forklares med inducerede forskelle i tryptofanrestmikromiljøerne, især Trp57 klemt inde mellem tre S-Flp i PVPWP-motivet (figur 6A,B)69. En mere triviel forklaring på en højere UV-absorption kan dog stamme fra en øget brøkdel af forkert foldet protein. Da proteinkoncentrationen blev vurderet ved kvantificering af absorbansegenskaber, kan tilstedeværelsen af et protein med en forkert moden kromofor øge absorbansen, mens denne fraktion ikke tælles med i den samlede koncentration (figur 6A,B). Til støtte for denne hypotese observerede vi, at den S-Flp-holdige EGFP udviste et markant reduceret forhold mellem kromofor versus kombineret tryptofan og tyrosinabsorbenans (ε (CRO)/ε (Tyr + Trp) = 0,96) sammenlignet med en højere værdi (1,57) i moderproteinet (tabel 2)70. Tilstedeværelsen af en ikke-fluorescerende fraktion i den S-Flp-holdige EGFP vil være en vigtig medvirkende faktor til yderligere analyse af proteinegenskaberne. I KillerOrange-varianten, der indeholdt S-Flp, blev der observeret en forbedret absorbans sammen med en rødforskydning i kromoforbåndet. Denne kendsgerning indikerede, at kromofordannelsen favoriserede en konfiguration med et stort fluorescenskvanteudbytte (figur 6C).

Efterfølgende analyserede vi fluorescensspektrene for de proteiner, der blev registreret ved excitation ved de tilsvarende maksimale absorbansbølgelængder. Resultaterne viser, at spektrene forblev stort set identiske for de undersøgte fluorescerende proteinvarianter med prolin og erstatninger, S-Flp og Dhp. Dette resultat indebærer, at analogerne under ingen omstændigheder ændrede kromoforens kemiske miljø (figur 6G-I). På trods af denne kendsgerning blev der set markante forskelle i fluorescensspektrene af KillerOrange registreret ved excitation ved 295 nm, derfor ved tryptophan excitation. Dette eksperiment sporer fluorescensresonansenergioverførsel (FRET) eller direkte excitonisk kobling, der forekommer mellem tryptofansidekæderne og den modne kromofor, da begge er placeret i en kort afstand på højst 25 Å. For EGFP- og NowGFP-varianter, da emissionsspektrene blev målt ved hjælp af 295 nm excitation, blev der observeret en stærk kromoforemission sammen med næsten ingen tryptofanemission (figur 6D,E). De varianter, der indeholdt S-Flp, udviste imidlertid en lidt større tryptofan-specifik emission. Denne observation kan knyttes til et utalt bidrag fra det udfoldede apoprotein, der indeholder tryptophaner, men ikke den modne kromofor. Væsentligt øget tryptofan-specifik emission blev set i KillerOrange, hvilket indikerer en mangel på fluorescensslukning via den forventede mekanisme for excitationsenergioverførsel eller excitonisk kobling. Proteinvarianterne indeholdende prolin og S-Flp udviste sammenlignelig tryptofanemission sammen med det foretrukne rødforskudte fluorescenstræk ved et højt kvanteudbytte. I modsætning hertil viste varianten, der indeholdt Dhp, et drastisk fald i kromoforfluorfluorescensintensiteten, formodentlig på grund af mindre strukturelle virkninger (figur 6F).

Dernæst sammenlignede vi proteinernes foldeegenskaber ved at udføre et udfoldelses-/renatureringseksperiment. Fluorescensemissionsspektre blev registreret i foldet tilstand (protokol punkt 5), efter kemisk denaturering og efterfølgende i processen med omfoldning overvåget over en periode på 24 timer (protokolafsnit 6). Spektrene blev registreret ved excitation ved begge relevante bølgelængder, 295 nm, og ved maksimum af kromoforernes absorbansspektre, mens den resulterende fluorescens præsenteres som normaliseret til den maksimale værdi for hvert protein (figur 7). I slutningen af protokollen observerede vi, at EGFP-varianter kunne foldes igen, mens NowGFP- og KillerOrange-varianterne - når de først var denatureret - forblev udfoldede (data ikke vist). Således varierede omfoldningskapaciteten af de oprindelige fluorescensproteiner betydeligt. Bemærk, at KillerOrange er udviklet som en fotosensitizer startende fra hydrozoan chromoprotein variant KillerRed65,71, og dens omfoldning halter typisk bagud på trods af den robuste β-tønde struktur. I vores eksperimenter fandt vi, at egfp-kromoforfluorfluorescensen af vildtypen kun blev genvundet delvist, selvom den tryptofanspecifikke fluorescens var større efter renaturering (figur 7A,D). I det væsentlige blev der observeret lignende adfærd i varianten indeholdende Dhp (figur 7C, F). I S-Flp-holdige EGFP blev et lignende resultat observeret, når excitationen blev udført ved den tryptofanspecifikke bølgelængde på 295 nm (figur 7B). Påfaldende nok genvandt fluorescensen i en meget højere udstrækning, da kromoforen blev ophidset ved 488 nm (figur 7E). Det ser ud til, at S-Flp inducerer et meget bedre udbytte af genfoldning sammenlignet med de to andre varianter. Denne gavnlige effekt blev imidlertid ikke set ved anvendelse af 295 nm excitation på grund af ukendte molekylære interaktioner.

Derefter blev genfoldningshastigheden overvåget ved at registrere fluorescens af både tryptofan og kromoforen separat, mens processens endepunkt blev bestemt ved 24 timer efter renatureringens start. Kun EGFP-varianter viste en relativt hurtig omfoldningskinetik, der kunne evalueres pålideligt, mens ingen af de denaturerede NowGFP- og KillerOrange-varianter kunne komme sig til en værdi, der muliggjorde yderligere kvantitative målinger. I EGFP var genvindingen af tryptofanemissioner dobbelt så hurtig (afsluttet i 750 sek.) sammenlignet med genvindingen af kromoforemissionen (afsluttet i 1 500 sek.), hvilket indikerer kompleksiteten af de underliggende processer (figur 8). Ved begge excitationsbølgelængder blev genfoldningshastigheden forhøjet ved tilstedeværelsen af S-Flp i overensstemmelse med litteraturdata25. Samtidig viste den Dhp-holdige variant en omfoldningsprofil svarende til vildtype.

Figure 1
Figur 1: Grønt fluorescerende protein (GFP) strukturelt stillads, kromoforbygning, prolinkonformationsovergange og syntetiske analoger, der anvendes i denne undersøgelse. (A) Strukturen af GFP består af β-strenge, der danner en næsten perfekt tønde (dvs. en "dåse" med dimensionerne 4,2 nm x 2,4 nm), der er dækket i begge ender af α-spiralformede låg. 27 kDa GFP-proteinet viser en tertiær struktur bestående af elleve β-strenge, to korte α-helices og kromoforen i midten. De konformationelle tilstande af tilstødende proliner er forbundet med kromofordannelse. (B) Autokatalytisk modning (kondensering) af kromoforen forekommer ved restkoncentrationer ser65, Tyr66 og Gly67 og fortsætter i flere trin: For det første torsionsjusteringer i polypeptidrygraden for at bringe carboxylcarbonet fra Thr65 i nærheden af amidnitrogenet i Gly67. Derefter forekommer dannelsen af et heterocyklisk imidazolin-5-et ringsystem ved nukleofilt angreb på dette carbonatom af glycinens amidnitrogen og efterfølgende dehydrering. Endelig får systemet synlig fluorescens, når oxidation af tyrosin alfa-beta-carbonbindingen med molekylært oxygen fører til udvidelsen af det konjugerede system i imidazolinringsystemet, i slutningen inklusive tyrosinphenylringen og dens para-oxygen-substituent. Den resulterende para-hydroxybenzyliden imidazolinonkromofor i midten af β-tønden adskilles fuldstændigt fra bulkopløsningsmidlet. (C) Skeletstrukturformlerne og geometrierne i 1) prolinringen (puckers) og 2) den foregående amidbinding repræsenterer de vigtigste konformationsovergange af prolinresten. (D) De prolinanaloger, der anvendes i dette arbejde med de udpegede prolinringpukkere. Figuren blev genereret ved hjælp af ChemDraw og Discovery Studio Visualizer. GFP-strukturen er fra PDB-strukturindgang 2Q6P. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Fluorescerende proteiner anvendt i denne undersøgelse. Panelerne viser båndrepræsentationen af de typiske β-tønde strukturer af tre forskellige varianter af fluorescerende proteiner: EGFP, NowGFP og KillerOrange, med båndfarve, der repræsenterer farven på fluorescensemission af hver variant. Prolinrester (kode på et bogstav) fremhæves som pinde, og de relevante positioner kommenteres. Kromoforer er vist med indledende aminosyresammensætning med fed skrift. Alle strukturrepræsentationer blev produceret med PyMol baseret på følgende PDB-strukturposter: 2Q6P for EGFP, 4RYS for NowGFP, 4ZFS for KillerOrange. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Flowdiagrampræsentation af SPI-metoden til restspecifik inkorporering af ikke-kanoniske prolineanaloger. En prolin-auxotrofisk Escherichia coli (E. coli) værtsstamme, der bærer genet af interesse på et ekspressionsplasmid, dyrkes i et defineret minimalt medium med alle 20 kanoniske aminosyrer, indtil en OD600 på ~ 0,7 er nået, hvor cellekulturen er i den midterste logaritmiske vækstfase. Celler høstes og overføres til frisk minimal medium indeholdende 19 kanoniske aminosyrer og en prolinanalog. Efter tilsætning af en inducer udføres proteinekspression natten over. Endelig isoleres målproteinet ved cellelyse og renses inden yderligere analyse. I en variation af protokollen dyrkes cellerne i et defineret minimalt medium med 19 kanoniske aminosyrer, og prolin tilsættes i en begrænset mængde (f.eks. En femtedel af koncentrationen af de andre aminosyrer). Ved denne foranstaltning udtømmer cellerne prolin i mediet, før de kan forlade den logaritmiske vækstfase, og derefter tilsættes analogen efterfølgende, og proteinet af interesseproduktion induceres. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Ekspressionsanalyse af EGFP-, NowGFP- og KillerOrange-varianter. (A) Cellepiller fra 1 ml ekspressionskultur, normaliseret til OD600 = 2. SDS-PAGE analyse af (B) EGFP, (C) NowGFP og (D) KillerOrange varianter. Opløselige (S) og uopløselige fraktioner (I) af hvert fluorescerende proteinderivat blev indlæst på 15% acrylamidgel samt eluerede fraktioner (E) fra IMAC af opløselige proteiner. PageRuler Unstained Protein Ladder blev brugt som markør (M) i banerne betegnet med (M). De forventede regioner af det pågældende protein er indrammet. Inkorporerede aminosyrer ved prolinpositioner er Pro, R-Flp, S-Flp og Dhp (i (A) cellepiller fra fluorescerende proteinvarianter, der indeholder Dfp i stedet for Dhp, vises). Geler blev farvet af 1% (m / v) Coomassie Brillant Blue. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Massespektrometrisk analyse af fluorescerende proteinvarianter. A) Repræsentative dekonvoluterede ESI-MS-spektre af H6-mærket EGFP (sort), S-Flp-EGFP (orange) og Dhp-EGFP (cyan) med placeringen af de vigtigste massetoppe angivet som tal (i Da). De beregnede molekylmasser [M+H]+ af deH6-mærkede proteiner er: For EGFP 27.745,33 Da (observeret 27.746,15 Da); for S-Flp-EGFP 27 925,33 Da (observeret 27.925,73 Da); for Dhp-EGFP 27.725,33 Da (observeret 27.726,01 Da). (B) Repræsentative dekonvoluterede ESI-MS-spektre af H6-mærket NowGFP (sort), S-Flp-NowGFP (orange) og Dhp-NowGFP (cyan) med placeringen af de vigtigste massetoppe angivet som tal (i Da). De beregnede masser af deH6-mærkede proteiner er: For NowGFP 27.931,50 Da (observeret 27.946,46 Da; forskellen på ~ 16 Da skyldes sandsynligvis oxidation af et methionin i proteinet); for S-Flp-NowGFP 28.129,50 Da (observeret 28.130,08 Da); for Dhp-NowGFP 27.909,50 Da (observeret 27.910,22 Da). (C) Repræsentative dekonvoluterede ESI-MS-spektre af H6-mærket KillerOrange (sort), S-Flp-KillerOrange (orange) og Dhp-KillerOrange (cyan) med placeringen af de vigtigste massetoppe angivet som tal (i Da). De beregnede masser af deH6-mærkede proteiner er: For KillerOrange 27.606,09 Da (observeret 27.605,91 Da); for S-Flp-KillerOrange 27.876,09 Da (observeret 27.876,08 Da); for Dhp-KillerOrange 27.576,09 Da (observeret 27.575,93 Da). Afvigelser mellem de observerede og beregnede molekylmasser på ca. 1 Da ligger inden for fejlområdet for ESI-MS-udstyret. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Lysabsorptions- og fluorescensemissionsspektre af fluorescerende proteinvarianter. Normaliserede UV-Vis-absorptionsspektre er vist for varianterne (A) af EGFP, (B) af NowGFP og (C) af KillerOrange. Spektre blev normaliseret til det maksimale af kromoforabsorbance (ca. 500 nm). Normaliserede fluorescensemissionsspektre er vist af varianterne (D,G) af EGFP, (E,H) af NowGFP og (F,I) af KillerOrange. Spektre i (D,E,F) blev målt ved excitation med ultraviolet lys (295 nm), for spektrene i (G,H,I) 488 nm, 493 nm og 510 nm lys blev anvendt til henholdsvis excitation, og spektrene blev normaliseret til det respektive maksimum af kromoforemission (ca. 500 nm). I hvert panel svarer sorte kurver til spektrene af den fluorescerende proteinvariant med indfødt prolin, orange kurver angiver spektrene af S-Flp-substituerede proteiner, og blå kurver svarer til Dhp-substituerede proteiner. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: Fluorescensemissionsspektre af EGFP-varianter i omfoldningsforsøg. Normaliserede fluorescensemissionsspektre på 0,3 μM opløsninger af fluorescerende proteinvarianter i den oprindelige tilstand og efter denaturering og omfoldning: Spektre i (A,B,C) blev målt ved excitation med ultraviolet lys (295 nm ) (A) for EGFP, (B) for S-Flp-EGFP og (C) for Dhp-EGFP. Spektre i (D,E,F) blev målt ved excitation med grønt lys (488 nm) (D) for EFGP, (E) for S-Flp-EGFP og (F) for Dhp-EGFP. Emissionsspektrene for de indfødte (sorte kurver) og omfoldede prøver (grøn svarer til egfp, orange til S-Flp-EGFP og blå til Dhp-EGFP, henholdsvis) for hver proteinvariant normaliseres til den maksimale fluorescens i den relevante oprindelige tilstand. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 8
Figur 8: Overvågning af proteinfoldning og kromoformodning af EGFP-varianter med fluorescens. (A) Fluorescensemission i området Trp fluorescens (emission blev sat til 330 nm) registreret ved excitation med ultraviolet lys (295 nm). (B) Udvikling af fluorescensamplituden i området for kromoforemission ved excitation med grønt lys (488 nm). De tidsafhængige fluorescensspor blev normaliseret til enhed (100%) i henhold til fluorescensamplituden nået i slutningen af overvågningsintervallet. I hvert panel svarer sorte kurver til spektrene af den fluorescerende proteinvariant med indfødt prolin, orange kurver angiver spektrene af S-Flp-substituerede proteiner, og blå kurver svarer til Dhp-substituerede proteiner. Klik her for at se en større version af denne figur.

Konstruere Aminosyresekvenser (6xHans tag understreget):
EGFP-H6 MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVP
WPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTR
AEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVN
FKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDH
MVLLEFVTAAGITLGMDELYKHHHHHH
H6-NowGFP MRGSHHQHHHGSVSKGEKLFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGK
MSLKFICTTGKLPVPWPTLKTTLTWGMQCFARYPDHMKQHDFFKSAMPEGY
VQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGVDFKEDGNILGHKLEYN
AISGNANITADKQKNGIKAYFTIRHDVEDGSVLLADHYQQNTPIGDGPVLLPD
NHYLSTQSKQSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGIPLGADELYK
H6-KillerOrange MRGSHHHHHHGSECGPALFQSDMTFKIFIDGEVNGQKFTIVADGSSKFPH
GDFNVHAVCETGKLPMSWKPICHLIQWGEPFFARYPDGISHFAQECFPEG
LSIDRTVRFENDGTMTSHHTYELSDTCVVSRITVNCDGFQPDGPIMRDQ
LVDILPSETHMFPHGPNAVRQLAFIGFTTADGGLMMGHLDSKMTFNGSR
AIEIPGPHFVTIITKQMRDTSDKRDHVCQREVAHAHSVPRITSAIGSDQD

Tabel 1: Primære strukturer af målproteinerne. His-tags understreges i hver sekvens.

λ [nm] ε [M-1·cm-1] (EGFP) ε [M-1·cm-1] (S-Flp-EGFP) ε [M-1·cm-1] (Dhp-EGFP)
488 (≡ CRO) 31.657 (± 1.341) 22.950 (± 290) 27.800 (± 542)
280 (≡ Tyr+Trp) 20.116 (± 172) 23.800 (± 715) 17.300 (± 554)
Værdier for udryddelseskoefficient ε (i M-1·cm-1) beregnes ud fra registrerede UV-Vis-absorptionsspektre for relevante EGFP-varianter ved hjælp af kendte proteinkoncentrationer. Valgt bølgelængde ved 280 nm svarer til den maksimale absorbans af aromatiske rester, tyrosin og tryptofan, og 488 nm repræsenterer kromoforabsorbancebølgelængden.

Tabel 2: Udryddelseskoefficienter (ε) for EGFP-varianter ved udvalgte bølgelængder. Værdier for udryddelseskoefficienten ε (i M-1·cm-1) beregnes ud fra registrerede UV-Vis-absorptionsspektre for relevante EGFP-varianter ved hjælp af kendte proteinkoncentrationer. Den valgte bølgelængde på 280 nm svarer til den maksimale absorbans af aromatiske rester, tyrosin og tryptofan, mens 488 nm repræsenterer den maksimale kromoforabsorbancebølgelængde.

Supplerende materiale: Udarbejdelse af lageropløsninger og buffere Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

I naturen forekommer manipulationer med proteinstrukturer og funktioner typisk på grund af mutationer, fænomenet, der fører til udveksling af en aminosyreidentitet på bestemte positioner i proteinsekvensen. Denne naturlige mekanisme anvendes i vid udstrækning som en bioteknologisk metode til proteinteknik i form af mutagenese, og den er afhængig af repertoiret af de 20 kanoniske aminosyrer, der er involveret i processen. Udvekslingen af prolinrester er imidlertid problematisk. På grund af sin specielle rygradsgruppearkitektur er den næppe udskiftelig med de resterende 19 rester til erstatning72. For eksempel er prolin typisk kendt som en sekundær strukturbryder i polypeptidsekvenser på grund af dets dårlige kompatibilitet med de mest almindelige sekundære strukturer, dvs. α-helix og β-streng. Denne prolinfunktion går let tabt, når resten muteres til en anden aminosyre fra det fælles repertoire. Udskiftningen af prolin med dets kemiske analoger tilbyder en alternativ tilgang, som gør det muligt at bevare de grundlæggende rygradsegenskaber i moderprolinresten, samtidig med at der pålægges bias på dets specifikke konformationsovergange eller producerer moduleringer af molekylært volumen og polaritet. For eksempel er det muligt at forsyne bakteriekulturer med analoge strukturer såsom hydroxy-, fluor-, alkyl-, dehydroproliner, strukturer med variable ringstørrelser og mere, hvilket letter produktionen af et protein, der indeholder specifikke prolinresterændringer.

Den selektive trykinkorporeringsmetode (SPI), der er beskrevet i denne undersøgelse, muliggør en global, dvs. restspecifik udskiftning af alle proliner i målproteinet med relaterede kemiske analoger. Betydningen af metoden afspejles af, at SPI gør det muligt at skabe sekvensændringer, der er utilgængelige for almindelige mutageneseteknikker. For eksempel tillader det produktion af et målprotein, der indeholder ret små strukturelle ændringer, der typisk ikke kan overstige en eller to atomudskiftninger /deletioner/tilføjelser, som det fremgår af denne undersøgelse. Sådanne proteinmodifikationer kaldes "atommutationer"73,74. I et fluorescerende protein som GFP kan resultatet af denne molekylære indtrængen ses i foldningshastigheden, lokale polariteter, proteinpakning, stabilitet af de involverede strukturelle træk. Ændringerne i absorbans- og fluorescensegenskaberne produceres indirekte på grund af virkningen på proteinfoldning og restmikromiljøer. Præcisionen af de molekylære ændringer, der udføres af SPI, er typisk meget højere sammenlignet med mutationer af proliner til andre kanoniske rester, hvor sidstnævnte typisk er skadelig for proteinfoldning, produktion og isolering.

Som produktionsmetode bruger SPI-tilgangen substrattolerancen for aminoacyl-tRNA-syntetaselommen over for kemiske analoger af den oprindelige aminosyre. Syntetase er ansvarlig for den korrekte identifikation af aminosyrestrukturen, mens inkorporeringen i proteiner sker nedstrøms i oversættelsesprocessen. Instrumentelt udføres proteinproduktion, isolering og oprensning i SPI på en måde, der er typisk for andre rekombinante proteinekspressionsteknikker; dog med nogle tilføjelser til protokollen som følger: Prolin, som er på vej til udskiftning, tilvejebringes i begyndelsen af fermenteringsprocessen, således at cellerne kan vokse og udvikle deres intakte cellulære maskineri. Cellekulturen får imidlertid ikke lov til at nå den maksimale optiske densitet for at holde cellerne i den logaritmiske fase optimal til proteinekspression. Der er to store variationer af SPI-metoden på dette tidspunkt. I den første justeres koncentrationen af prolin i det oprindelige vækstmedium (et kemisk defineret medium), således at udtømning af prolin sker uden nogen ekstern indtrængen. Cellerne udtømmer prolin i mediet, før de kan forlade den logaritmiske vækstfase, og derefter tilsættes analogen efterfølgende, og proteinet af interesseproduktion induceres. I den anden version af metoden dyrkes cellerne i det medium, der indeholder prolin indtil midten af deres logaritmiske fase. På dette tidspunkt skal cellerne tages ud og fysisk overføres til et andet medium, som ikke længere indeholder prolin, kun analogen, med efterfølgende induktion af proteinet af interesse. I begge versioner tilvejebringes det analoge og proteininduktionsreagenset til de forvoksede celler. Isoleringen og oprensningen af vildtypeproteinet udføres på samme måde som for varianterne. I princippet kan enhver tilgængelig Pro-auxotrofisk stamme bruges som udtryksvært. Ikke desto mindre anbefales ekspressionstest for at identificere den mest egnede vært. Test af forskellige kemisk definerede medier kan også bruges til at optimere proteinudbyttet.

Der er visse krav til de kemiske analoger, der skal overvejes for SPI, såsom opløselighed og koncentration. Den metaboliske tilgængelighed og optagelse af aminosyrer er afhængig af antallet af opløste molekyler i mediet. For at øge opløseligheden af en bestemt forbindelse kan der vælges let sure eller alkaliske forhold. Da de kunstige molekyler kan forårsage væksthæmmende virkninger på grund af deres celletoksicitet, bør koncentrationen sænkes til et minimum for at undgå cellestress75.

En mindre svaghed ved SPI er faldet i inkorporeringseffektiviteten med et større antal positioner, der skal udveksles. I princippet kan en reduktion af aminosyrefrekvensen i målbiomolekylet ved stedstyret mutagenese løse dette problem. Imidlertid kan de strukturelle og funktionelle egenskaber ved et ønsket protein påvirkes ved at ændre den primære struktur.

Som tidligere nævnt tillader SPI restspecifik udskiftning af den kanoniske aminosyre. Dette indebærer, at ikke-kanoniske aminosyrer indsættes i alle positioner af den kanoniske aminosyre i målproteinet, herunder konserverede rester, der er uundværlige for proteinfunktion eller foldning. Alternative metoder til stedsspecifik inkorporering er den eneste mulighed for at løse dette problem3. I de sidste par årtier er den ortogonale parmetode blevet udviklet, der kan producere proteiner indeholdende modificerede rester på foruddefinerede steder. Den mest almindelige ændring af denne metode er kendt som stopkodonundertrykkelse. Denne metode er baseret på et konstrueret ortogonalt oversættelsessystem dedikeret til stedsspecifik inkorporering af syntetiske aminosyrer76. Mere end 200 aminosyrer med forskellige sidekædemodifikationer er blevet inkorporeret i proteiner til dato ved hjælp af denne tilgang77. Disse oversættelsessystemer er dog stadig ikke egnede til indsættelser af prolinanaloger i målproteiner. Desuden betragtes metodens ydeevne som lav i tilfælde af mindre aminosyremodifikationer, fordi en vis baggrundspromiskuitet af aminoacyl-tRNA-syntetase typisk forbliver i de konstruerede oversættelsessystemer.

Ved hjælp af SPI producerede vi en række β-tønde fluorescerende proteinvarianter og studerede resultaterne af udvekslingen af prolin med dets unaturlige analoger. I tilfælde af prolinudskiftning med R-Flp og Dfp blev der produceret et dysfunktionelt protein af ekspressionsværten. Effekten er sandsynligvis produceret af protein misfoldning. Sidstnævnte kan stamme fra C4-exo-konformationen fremmet af R-Flp, som ikke er ugunstigt stillet af moderproteinstrukturerne27. Med Dfp vil fejlfoldningen sandsynligvis blive produceret af den formindskede hastighed af trans-til-cis-peptidbindingsisomeriseringen ved prolinresten27. Sidstnævnte er kendt for at være blandt de begrænsende trin i den kinetiske profil af proteinfoldningen, der påvirker β-tønde dannelse og efterfølgende kromoformodning. For begge aminosyrer, R-Flp og Dfp, resulterede proteinproduktionen faktisk i et aggregeret og uopløseligt protein. Følgelig kunne kromofordannelse ikke forekomme, og fluorescensen gik helt tabt. Med S-Flp og Dhp blev der imidlertid observeret korrekt proteinmodning, hvilket resulterede i fluorescerende proteinprøver for hver analog / proteinkombination. På trods af nogle moduleringer i proteinets absorbans- og fluorescensegenskaber forblev disse stort set de samme som for vildtypeproteinerne. Effekten af aminosyresubstitutionen blev afsløret i de omfoldede kinetikundersøgelser. Sidstnævnte viste en hurtigere omfoldning i tilfælde af udskiftning med S-Flp. Modelundersøgelser har vist, at denne rest kan generere en vis forbedring i trans-til-cis-amidrotationshastigheden og føre til dannelsen af C4-endo-konformationen. Begge disse faktorer vil sandsynligvis bidrage til de gavnlige kinetiske virkninger af denne rest i EGFP. I modsætning hertil producerede Dhp kinetiske foldeprofiler, der maksimalt ligner moderproteinet. Mangfoldigheden af de resultater, der frembringes af blotte atommutationer i de undersøgte fluorescerende proteiner, illustrerer SPI-produktionsmetodens potentiale til at ændre målproteinets egenskaber. Proteinændringerne induceret ved prolinudskiftning med analogerne har yderligere konsekvenser i konstruktionen af enzymer 78,79,80 og ionkanaler 81,82 samt i generel teknik af proteinstabilitet.

Den grundlæggende begrænsning af SPI-metoden er dens "alt-eller-ingen" -tilstand ved udveksling af prolin, der befinder sig med relaterede analoger. Det ville være en stor fordel at kunne vælge præcist, hvilke prolinrester der skal erstattes med analogerne, og hvilke der skal forblive uændrede. På nuværende tidspunkt er der imidlertid ingen teknik, der kan udføre en så sofistikeret produktion ved hjælp af en mikrobiel produktionsvært. Kemisk syntese af proteiner83,84 samt cellefri produktion85,86 er de to alternative metoder, der kan producere positionsspecifikke prolinmodifikationer. Ikke desto mindre gør deres operationelle kompleksitet og lave produktionsudbytter dem ringere sammenlignet med produktionen i levende celler. Fra nu af er SPI fortsat den mest operationelt enkle og robuste tilgang til produktion af komplekse proteiner, der bærer atommutationer. Ved at indføre unaturlige aminosyreerstatninger gør metoden det muligt at modificere proteinegenskaber på en målrettet måde, som her eksemplificeret ved ændringer i foldning og lysabsorption/emission af fluorescerende proteiner genereret af prolinudskiftninger.

Disclosures

Forfatterne afslører alle og eventuelle interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af den tyske forskningsfond (Cluster of Excellence "Unifying Systems in Catalysis) til T.F. og NB og af forbundsministeriet for uddannelse og videnskab (BMBF-programmet "HSP 2020", TU-WIMIplus Project SynTUBio) til F.-J.S. og T.M.T.T.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile VWR HiPerSolv CHROMANORM ULTRA for LC-MS, 83642 LC-MS grade required
Acrylamide and bisacrylamide aqueous stock solution at a ratio of 37.5:1 (ROTIPHORESE Gel 30) Carl Roth 3029.1
Agar-agar Carl Roth 5210
Ammonium molybdate ((NH4)2MoO4) Sigma-Aldrich 277908
Ammonium peroxydisulphate (APS) Carl Roth 9592.2 ≥98 %, p.a., ACS grade required
Ammonium sulfate ((NH4)2SO4) Sigma-Aldrich A4418
Ampicillin sodium salt Carl Roth K029
Biotin Sigma-Aldrich B4501
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B0126
Calcium chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich C5670
Coomassie Brillant Blue R 250 Carl Roth 3862
Copper sulfate (CuSO4) Carl Roth CP86.1
D-glucose Carl Roth 6780
1,2-Bis-(dimethylamino)-ethane, N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) Carl Roth 2367.3 ≥99 %, p.a., for electrophoresis
1,4-dithiothreitol (DTT) Carl Roth 6908
Dichloromethane (DCM) Sigma-Aldrich 270997
di-potassium hydrogen phosphate (K2HPO4) Carl Roth P749.1
di-sodium hydrogen phosphate (Na2HPO4) Carl Roth X987
DNase I Sigma-Aldrich D5025
Dowex 50WX8-100 (hydrogen form) Acros Organics / Thermo Fisher Scientific (Waltham, U.S.A.) 10731181 cation exchange resin
Ethanol Carl Roth 9065.1
Formic acid VWR HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS, 84865 LC-MS grade required
Glacial acetic acid Carl Roth 3738.5 100 %, p. a.
Glycerol Carl Roth 3783
Imidazole Carl Roth X998
Hydrogen chlroide (HCl) Merck 295426
Iron(II) chloride (FeCl2) Sigma-Aldrich 380024
Isopropanol Carl Roth AE73.1
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma-Aldrich I6758
Lysozyme Sigma-Aldrich L6876
Magnesium chloride (MgCl2) Carl Roth KK36.1
Magnesium sulfate (MgSO4) Carl Roth 8283.2
Manganese chloride (MnCl2) Sigma-Aldrich 63535
β-mercaptoethanol Carl Roth 4227.3
PageRuler Unstained Protein Ladder Thermo Fisher Scientific 26614
Potassium chloride (KCl) Carl Roth 6781.3
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) Sigma-Aldrich P5655
RNase A Carl Roth 7156
Sodium chloride (NaCl) Carl Roth P029
Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4) Carl Roth T879
Sodium dodecyl sulphate (NaC12H25SO4) Carl Roth 0183
Thiamine Sigma-Aldrich T4625
Trifluoroacetic acid (TFA) Sigma-Aldrich T6508
Tris hydrochloride (Tris-HCl) Sigma-Aldrich 857645
Tris(hydroxymethyl)-aminomethane (Tris) Carl Roth 5429
Tryptone Carl Roth 8952
Yeast extract Carl Roth 2363
Zinc chloride (ZnCl2) Sigma-Aldrich 229997
L-alanine Sigma-Aldrich A7627
L-arginine Sigma-Aldrich A5006
L-asparagine Sigma-Aldrich A8381
L-aspartic acid Sigma-Aldrich A0884
L-cysteine Sigma-Aldrich C7352
L-glutamic acid Sigma-Aldrich G2128
L-glutamine Sigma-Aldrich G3126
L-glycine Sigma-Aldrich G7126
L-histidine Sigma-Aldrich H8000
L-isoleucine Sigma-Aldrich I2752
L-leucine Sigma-Aldrich L8000
L-lysine Sigma-Aldrich L5501
L-methionine Sigma-Aldrich M9625
L-phenylalanine Sigma-Aldrich P2126
L-proline Sigma-Aldrich P0380
L-serine Sigma-Aldrich S4500
L-threonine Sigma-Aldrich T8625
L-tryptophan Sigma-Aldrich T0254
L-tyrosine Sigma-Aldrich T3754
L-valine Sigma-Aldrich V0500
(4S)-fluoroproline Bachem 4033274 Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression.
(4R)-fluoroproline Bachem 4033275 Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression
3,4-dehydroproline Bachem 4003545 Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression
4,4-difluoroproline Enamine EN400-17448 Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression
Conical polystyrene (Falcon) tubes, 15 mL Fisher Scientific 14-959-49B
Conical polystyrene (Falcon) tubes, 50 mL Fisher Scientific 14-432-22
Dialysis membrane, Molecular Weight Cut-Off (MWCO) 5,000 Spectrum Medical Industries Spectra/Por MWCO 5000 dialysis membrane, 133198
Immobilized Metal ion Affinity Chromatography (IMAC) column 1 mL, Ni-NTA GE Healthcare HisTrap HP, 1 mL, 17-5247-01
Luer-Lock syringe, 5 mL Carl Roth EP96.1
Luer-Lock syringe, 20 mL Carl Roth T550.1
Luer-Lock syringe, 50 mL Carl Roth T552.1
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL Eppendorf 30120086
Petri dishes (polystyrene, sterile) Carl Roth TA19
pQE-80L plasmid vector Qiagen no longer available replaced by N-terminus pQE Vector set Cat No./ID: 32915
Pro-auxotrophic E. coli strain JM83 Addgene 50348 https://www.addgene.org/50348/
Pro-auxotrophic E. coli strain JM83 ATCC 35607
Round-bottom polystyrene tubes, 14 mL Fisher Scientific Corning Falcon, 14-959-1B
Syringe filter 0.45 µm with polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane Carl Roth CCY1.1
High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) column for LC-ESI-TOF-MS Sigma-Aldrich Supelco Discovery BIO Wide Pore C5 HPLC column, 3 µm particle size, 10 cm x 2.1 mm with conical 0.1 mL glass inserts, screw caps and septa
HPLC autosampler vials 1.5 mL Sigma-Aldrich Supelco 854165
Mass spectrometer for LC-ESI-TOF-MS Agilent Agilent 6530 Accurate-Mass QTOF
Mass spectrometry data analysis software Agilent MassHunter Qualitative Analysis software v. B.06.00
Benchtop centrifuge for 1.5 mL Eppendorf tubes Eppendorf 5427 R
Cooling centrifuge for 50 mL Falcon tubes Eppendorf 5810 R
Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) system GE Healthcare ÄKTA pure 25 L
Fluorescence spectrometer Perkin Elmer LS 55
High pressure microfluidizer for bacterial cell disruption Microfluidics LM series with “Z” type chamber
Orbital shaker for bacterial cultivation Infors HT Minitron
Peristaltic pump for liquid chromatography (LC) GE Healthcare P-1
Ultrasonic homogenizer for bacterial cell disruption Omnilab Bandelin SONOPULS HD 3200, 5650182 with MS72 sonifier tip
UV-Vis spectrophotometer Biochrom ULTROSPEC 2100
UV-Vis/NIR spectrophotometer Perkin Elmer LAMBDA 950 UV/Vis/NIR

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Agostini, F., Völler, J. -S., Koksch, B., Acevedo-Rocha, C. G., Kubyshkin, V., Budisa, N. Biocatalysis with unnatural amino acids: Enzymology meets xenobiology. Angewandte Chemie (International ed. In English). 56 (33), 9680-9703 (2017).
  2. Minks, C., Alefelder, S., Moroder, L., Huber, R., Budisa, N. Towards new protein engineering: In vivo building and folding of protein shuttles for drug delivery and targeting by the selective pressure incorporation (SPI) method. Tetrahedron. 56 (48), 9431-9442 (2000).
  3. Hoesl, M. G., Budisa, N. Expanding and engineering the genetic code in a single expression experiment. Chembiochem: A, European Journal of Chemical Biology. 12 (4), 552-555 (2011).
  4. Wiltschi, B., Budisa, N. Natural history and experimental evolution of the genetic code. Applied Microbiology and Biotechnology. 74 (4), 739-753 (2007).
  5. Hoesl, M. G., et al. Lipase congeners designed by genetic code engineering. ChemCatChem. 3 (1), 213-221 (2011).
  6. FPbase avGFP. , Available from: https://www.fpbase.org/protein/avgfp/ (2011).
  7. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annual Review of Biochemistry. 67, 509-544 (1998).
  8. Zhang, Y., et al. Identification of genes expressed in C. elegans touch receptor neurons. Nature. 418 (6895), 331-335 (2002).
  9. Misteli, T., Spector, D. L. Applications of the green fluorescent protein in cell biology and biotechnology. Nature Biotechnology. 15 (10), 961-964 (1997).
  10. Hanson, M. R., Köhler, R. H. GFP imaging: methodology and application to investigate cellular compartmentation in plants. Journal of Experimental Botany. 52 (356), 529-539 (2001).
  11. Sakamoto, S., Shoyama, Y., Tanaka, H., Morimoto, S. Application of green fluorescent protein in immunoassays. Advances in Bioscience and Biotechnology. 05 (6), 557-563 (2014).
  12. Akbar, M., Kim, H. Y. Green fluorescent protein tagging: A novel tool in biomedical research. Indian Journal of Biotechnology. 4, 466-470 (2005).
  13. Kobayashi, T., Morone, N., Kashiyama, T., Oyamada, H., Kurebayashi, N., Murayama, T. Engineering a novel multifunctional green fluorescent protein tag for a wide variety of protein research. PloS One. 3 (12), 3822 (2008).
  14. Kent, K. P., Oltrogge, L. M., Boxer, S. G. Synthetic control of green fluorescent protein. Journal of the American Chemical Society. 131 (44), 15988-15989 (2009).
  15. Born, J., Pfeifer, F. Improved GFP variants to study gene expression in Haloarchaea. Frontiers in Microbiology. 10, 1200 (2019).
  16. Pakhomov, A. A., Martynov, V. I. GFP family: structural insights into spectral tuning. Chemistry & Biology. 15 (8), 755-764 (2008).
  17. Zimmer, M. Green fluorescent protein (GFP): applications, structure, and related photophysical behavior. Chemical Reviews. 102 (3), 759-781 (2002).
  18. Valbuena, F. M., Fitzgerald, I., Strack, R. L., Andruska, N., Smith, L., Glick, B. S. A photostable monomeric superfolder green fluorescent protein. Traffic. 21 (8), Copenhagen, Denmark. 534-544 (2020).
  19. Craggs, T. D. Green fluorescent protein: structure, folding and chromophore maturation. Chemical Society Reviews. 38 (10), 2865-2875 (2009).
  20. Maddalo, S. L., Zimmer, M. The role of the protein matrix in green fluorescent protein fluorescence. Photochemistry and Photobiology. 82 (2), 367-372 (2006).
  21. Cui, G., Lan, Z., Thiel, W. Intramolecular hydrogen bonding plays a crucial role in the photophysics and photochemistry of the GFP chromophore. Journal of the American Chemical Society. 134 (3), 1662-1672 (2012).
  22. Yang, F., Moss, L. G., Phillips, G. N. The molecular structure of green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 14 (10), 1246-1251 (1996).
  23. Andrews, B. T., Roy, M., Jennings, P. A. Chromophore packing leads to hysteresis in GFP. Journal of Molecular Biology. 392 (1), 218-227 (2009).
  24. Xie, J. -B., Zhou, J. -M. Trigger factor assisted folding of green fluorescent protein. Biochemistry. 47 (1), 348-357 (2008).
  25. Steiner, T., Hess, P., Bae, J. H., Wiltschi, B., Moroder, L., Budisa, N. Synthetic biology of proteins: tuning GFPs folding and stability with fluoroproline. PloS One. 3 (3), 1680 (2008).
  26. Andrews, B. T., Schoenfish, A. R., Roy, M., Waldo, G., Jennings, P. A. The rough energy landscape of superfolder GFP is linked to the chromophore. Journal of Molecular Biology. 373 (2), 476-490 (2007).
  27. Kubyshkin, V., Davis, R., Budisa, N. Biochemistry of fluoroprolines: the prospect of making fluorine a bioelement. Beilstein Journal of Organic Chemistry. 17, 439-460 (2021).
  28. Renner, C., Alefelder, S., Bae, J. H., Budisa, N., Huber, R., Moroder, L. Fluoroprolines as tools for protein design and engineering. Angewandte Chemie (International ed. In English). 40 (5), 923-925 (2001).
  29. Fukuda, H., Arai, M., Kuwajima, K. Folding of green fluorescent protein and the cycle3 mutant. Biochemistry. 39 (39), 12025-12032 (2000).
  30. Rosenman, D. J., et al. Green-lighting green fluorescent protein: faster and more efficient folding by eliminating a cis-trans peptide isomerization event. Protein Science: A Publication of the Protein Society. 23 (4), 400-410 (2014).
  31. Vitagliano, L., Berisio, R., Mastrangelo, A., Mazzarella, L., Zagari, A. Preferred proline puckerings in cis and trans peptide groups: implications for collagen stability. Protein Science: A Publication of the Protein Society. 10 (12), 2627-2632 (2001).
  32. Kubyshkin, V. Experimental lipophilicity scale for coded and noncoded amino acid residues. Organic and Biomolecular Chemistry. 19 (32), 7031-7040 (2021).
  33. Kubyshkin, V., Budisa, N. cis-trans-Amide isomerism of the 3,4-dehydroproline residue, the 'unpuckered' proline. Beilstein Journal of Organic Chemistry. 12, 589-593 (2016).
  34. Budisa, N. Prolegomena to future experimental efforts on genetic code engineering by expanding its amino acid repertoire. Angewandte Chemie (International ed. In English). 43 (47), 6426-6463 (2004).
  35. Beatty, K. E., Tirrel, D. A. Noncanonical amino acids in protein science and engineering. Protein Engineering. Nucleic Acids and Molecular Biology. 22, Springer. Berlin, Heidelberg. (2009).
  36. Budisa, N. Engineering the Genetic Code: Expanding the Amino Acid Repertoire for the Design of Novel Proteins. , WILEY-VCH. Weinheim. (2006).
  37. Merkel, L., Budisa, N. Organic fluorine as a polypeptide building element: in vivo expression of fluorinated peptides, proteins and proteomes. Organic & Biomolecular Chemistry. 10 (36), 7241-7261 (2012).
  38. van Eldijk, M. B., van Hest, J. C. M. Residue-specific incorporation of non-canonical amino acids for protein engineering. Methods in Molecular Biology. 1728, Clifton, N.J. 137-145 (2018).
  39. Hartman, M. C. T. Non-canonical amino acid substrates of E. coli aminoacyl-tRNA synthetases. Chembiochem: A European Journal of Chemical Biology. , (2021).
  40. Gomez, M. A. R., Ibba, M. Aminoacyl-tRNA synthetases. RNA. 26 (8), 910-936 (2020).
  41. Grant, M. M., Brown, A. S., Corwin, L. M., Troxler, R. F., Franzblau, C. Effect of l-azetidine 2-carboxylic acid on growth and proline metabolism in Escherichia coli. Biochimica et Biophysica Acta. 404 (2), 180-187 (1975).
  42. Budisa, N., Steipe, B., Demange, P., Eckerskorn, C., Kellermann, J., Huber, R. High-level biosynthetic substitution of methionine in proteins by its analogs 2-aminohexanoic acid, selenomethionine, telluromethionine and ethionine in Escherichia coli. European Journal of Biochemistry. 230 (2), 788-796 (1995).
  43. Budisa, N., Pal, P. P. Designing novel spectral classes of proteins with a tryptophan-expanded genetic code. Biological Chemistry. 385 (10), 893-904 (2004).
  44. Hoesl, M. G., Budisa, N. Recent advances in genetic code engineering in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology. 23 (5), 751-757 (2012).
  45. Nickling, J. H., et al. Antimicrobial peptides produced by selective pressure incorporation of non-canonical amino acids. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (135), e57551 (2018).
  46. JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: Electroporation. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2021).
  47. JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2021).
  48. Sarkisyan, K. S., et al. fluorescent protein with anionic tryptophan-based chromophore and long fluorescence lifetime. Biophysical Journal. 109 (2), 380-389 (2015).
  49. Sarkisyan, K. S., et al. KillerOrange, a genetically encoded photosensitizer activated by blue and green light. PloS One. 10 (12), 0145287 (2015).
  50. Grigorenko, B. L., Krylov, A. I., Nemukhin, A. V. Molecular modeling clarifies the mechanism of chromophore maturation in the green fluorescent protein. Journal of the American Chemical Society. 139 (30), 10239-10249 (2017).
  51. Pletnev, V. Z., et al. Structure of the green fluorescent protein NowGFP with an anionic tryptophan-based chromophore. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 71, Pt 8 1699-1707 (2015).
  52. Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. Culture medium for enterobacteria. Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).
  53. Hörnsten, E. G. On culturing Escherichia coli on a mineral salts medium during anaerobic conditions. Bioprocess Engineering. 12 (3), 157-162 (1995).
  54. Davis, B. D. The Isolation of biochemically deficient mutants of bacteria by means of penicillin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 35 (1), 1-10 (1949).
  55. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY, USA. (2001).
  56. Wang, Y. -S., et al. The de novo engineering of pyrrolysyl-tRNA synthetase for genetic incorporation of L-phenylalanine and its derivatives. Molecular bioSystems. 7 (3), 714-717 (2011).
  57. JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. ImageJ at (2021).
  58. ImageJ. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/ (2021).
  59. Baumann, T., et al. Engineering 'Golden' fluorescence by selective pressure incorporation of non-canonical amino acids and protein analysis by mass spectrometry and fluorescence. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57017 (2018).
  60. FPbase NowFFP. , Available from: https://www.fpbase.org/protein/nowgfp/ (2021).
  61. Markwardt, M. L., et al. An improved cerulean fluorescent protein with enhanced brightness and reduced reversible photoswitching. PloS One. 6 (3), 17896 (2011).
  62. Gotthard, G., von Stetten, D., Clavel, D., Noirclerc-Savoye, M., Royant, A. Chromophore isomer stabilization is critical to the efficient fluorescence of cyan fluorescent proteins. Biochemistry. 56 (49), 6418-6422 (2017).
  63. Lelimousin, M., et al. Intrinsic dynamics in ECFP and Cerulean control fluorescence quantum yield. Biochemistry. 48 (42), 10038-10046 (2009).
  64. FPbase mKillerOrange. , Available from: https://www.fpbase.org/protein/mkillerorange/ (2021).
  65. Pletneva, N. V., et al. Crystal structure of phototoxic orange fluorescent proteins with a tryptophan-based chromophore. PloS One. 10 (12), 0145740 (2015).
  66. Royant, A., Noirclerc-Savoye, M. Stabilizing role of glutamic acid 222 in the structure of Enhanced Green Fluorescent Protein. Journal of Structural Biology. 174 (2), 385-390 (2011).
  67. Larregola, M., Moore, S., Budisa, N. Congeneric bio-adhesive mussel foot proteins designed by modified prolines revealed a chiral bias in unnatural translation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 421 (4), 646-650 (2012).
  68. Yamaguchi, H., Miyazaki, M. Refolding techniques for recovering biologically active recombinant proteins from inclusion bodies. Biomolecules. 4 (1), 235-251 (2014).
  69. Ghisaidoobe, A. B. T., Chung, S. J. Intrinsic tryptophan fluorescence in the detection and analysis of proteins: A focus on Förster resonance energy transfer techniques. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 22518-22538 (2014).
  70. Pal, P. P., et al. Structural and spectral response of Aequorea victoria green fluorescent proteins to chromophore fluorination. Biochemistry. 44 (10), 3663-3672 (2005).
  71. Pletnev, S., et al. Structural basis for phototoxicity of the genetically encoded photosensitizer KillerRed. The Journal of Biological Chemistry. 284 (46), 32028-32039 (2009).
  72. Kubyshkin, V., Budisa, N. Anticipating alien cells with alternative genetic codes: away from the alanine world. Current Opinion in Biotechnology. 60, 242-249 (2019).
  73. Minks, C., Huber, R., Moroder, L., Budisa, N. Atomic mutations at the single tryptophan residue of human recombinant annexin V: effects on structure, stability, and activity. Biochemistry. 38 (33), 10649-10659 (1999).
  74. Budisa, N., Huber, R., Golbik, R., Minks, C., Weyher, E., Moroder, L. Atomic mutations in annexin V thermodynamic studies of isomorphous protein variants. European Journal of Biochemistry. 253, 1-9 (1998).
  75. Lin, X., Yu, A. C. S., Chan, T. F. Efforts and challenges in engineering the genetic code. Life. 7, Basel, Switzerland. (2017).
  76. Völler, J. -S., Budisa, N. Coupling genetic code expansion and metabolic engineering for synthetic cells. Current Opinion in Biotechnology. 48, 1-7 (2017).
  77. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annual Review of Biochemistry. 79, 413-444 (2010).
  78. Lukesch, M. S., Pavkov-Keller, T., Gruber, K., Zangger, K., Wiltschi, B. Substituting the catalytic proline of 4-oxalocrotonate tautomerase with non-canonical analogues reveals a finely tuned catalytic system. Scientific Reports. 9 (1), 2697 (2019).
  79. Acevedo-Rocha, C. G., et al. Non-canonical amino acids as a useful synthetic biological tool for lipase-catalysed reactions in hostile environments. Catalysis Science & Technology. 3 (5), 1198 (2013).
  80. Holzberger, B., Marx, A. Replacing 32 proline residues by a non-canonical amino acid results in a highly active DNA polymerase. Journal of the American Chemical Society. 132 (44), 15708-15713 (2010).
  81. Mosesso, R., Dougherty, D. A., Lummis, S. C. R. Proline residues in the transmembrane/extracellular domain interface loops have different behaviors in 5-HT3 and nACh receptors. ACS Chemical Neuroscience. 10 (7), 3327-3333 (2019).
  82. Mosesso, R., Dougherty, D. A., Lummis, S. C. R. Probing proline residues in the prokaryotic ligand-gated ion channel, ELIC. Biochemistry. 57 (27), 4036-4043 (2018).
  83. Torbeev, V. Deciphering protein folding using chemical protein synthesis. Total Chemical Synthesis of Proteins. 1st ed. , WILEY-VCH. Weinheim. (2021).
  84. Torbeev, V. Y., Hilvert, D. Both the cis-trans equilibrium and isomerization dynamics of a single proline amide modulate β2-microglobulin amyloid assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20051-20056 (2013).
  85. Kawakami, T., Ishizawa, T., Murakami, H. Extensive reprogramming of the genetic code for genetically encoded synthesis of highly N-alkylated polycyclic peptidomimetics. Journal of the American Chemical Society. 135 (33), 12297-12304 (2013).
  86. Cui, Z., Johnston, W. A., Alexandrov, K. Cell-free approach for non-canonical amino acids incorporation into polypeptides. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 1031 (2020).

Tags

Bioengineering udgave 180 ikke-kanoniske aminosyrer prolinanaloger selektiv trykinkorporering proteinfoldning foldekinetik proteinstabilitet
Restspecifik udveksling af prolin ved hjælp af prolinanaloger i fluorescerende proteiner: Hvordan "molekylær kirurgi" af rygraden påvirker foldning og stabilitet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Thi To, T. M., Kubyshkin, V.,… More

Thi To, T. M., Kubyshkin, V., Schmitt, F. J., Budisa, N., Friedrich, T. Residue-Specific Exchange of Proline by Proline Analogs in Fluorescent Proteins: How "Molecular Surgery" of the Backbone Affects Folding and Stability. J. Vis. Exp. (180), e63320, doi:10.3791/63320 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter