Mangesidet massespektrometrisk undersøgelse af neuropeptider i Callinectes sapidus
Summary
Massespektrometrisk karakterisering af neuropeptider giver sekvens-, kvantations- og lokaliseringsinformation. Denne optimerede arbejdsgang er ikke kun nyttig til neuropeptidundersøgelser, men også andre endogene peptider. Protokollerne her beskriver prøveforberedelse, MS-erhvervelse, MS-analyse og databasegenerering af neuropeptider ved hjælp af LC-ESI-MS, MALDI-MS-spotting og MALDI-MS-billeddannelse.
Abstract
Neuropeptider er signalmolekyler, der regulerer næsten alle fysiologiske og adfærdsmæssige processer, såsom udvikling, reproduktion, fødeindtagelse og reaktion på eksterne stressorer. Alligevel forbliver de biokemiske mekanismer og det fulde supplement til neuropeptider og deres funktionelle roller dårligt forstået. Karakterisering af disse endogene peptider hindres af den enorme mangfoldighed inden for denne klasse af signalmolekyler. Derudover er neuropeptider bioaktive i koncentrationer 100x – 1000x lavere end neurotransmittere og er tilbøjelige til enzymatisk nedbrydning efter synaptisk frigivelse. Massespektrometri (MS) er et meget følsomt analytisk værktøj, der kan identificere, kvantificere og lokalisere analytter uden omfattende a priori viden. Det er velegnet til globalt profilering af neuropeptider og hjælp til opdagelsen af nye peptider. På grund af den lave overflod og høje kemiske mangfoldighed af denne klasse af peptider er flere prøveforberedelsesmetoder, MS-erhvervelsesparametre og dataanalysestrategier blevet tilpasset fra proteomics-teknikker for at muliggøre optimal neuropeptidkarakterisering. Her beskrives metoder til isolering af neuropeptider fra komplekse biologiske væv til sekvenskarakterisering, kvantitering og lokalisering ved hjælp af væskekromatografi (LC)-MS og matrixassisteret laserdesorption/ionisering (MALDI)-MS. En protokol til fremstilling af en neuropeptiddatabase fra den blå krabbe, Callinectes sapidus, en organisme uden omfattende genomisk information, er inkluderet. Disse arbejdsgange kan tilpasses til at studere andre klasser af endogene peptider i forskellige arter ved hjælp af en række instrumenter.
Introduction
Nervesystemet er komplekst og kræver et netværk af neuroner til at transmittere signaler gennem en organisme. Nervesystemet koordinerer sensorisk information og biologisk respons. De indviklede og indviklede interaktioner involveret i signaloverførsel kræver mange forskellige signalmolekyler såsom neurotransmittere, steroider og neuropeptider. Da neuropeptider er de mest forskelligartede og potente signalmolekyler, der spiller nøgleroller i aktivering af fysiologiske reaktioner på stress og andre stimuli, er det af interesse at bestemme deres specifikke rolle i disse fysiologiske processer. Neuropeptidfunktion er relateret til deres aminosyrestruktur, som bestemmer mobilitet, receptorinteraktion og affinitet1. Teknikker som histokemi, hvilket er vigtigt, fordi neuropeptider kan syntetiseres, opbevares og frigives i forskellige områder af vævet, og elektrofysiologi er blevet anvendt til at undersøge neuropeptidstruktur og funktion 2,3,4, men disse metoder er begrænset af gennemstrømning og specificitet for at løse den enorme sekvensdiversitet af neuropeptider.
Massespektrometri (MS) muliggør analyse af neuropeptidstruktur og overflod med høj kapacitet. Dette kan udføres gennem forskellige MS-teknikker, oftest væskekromatografi-elektrosprayionisering MS (LC-ESI-MS)5 og matrixassisteret laserdesorption/ionisering MS (MALDI-MS)6. Ved hjælp af massemålinger med høj nøjagtighed og MS-fragmentering giver MS mulighed for at tildele aminosyresekvens og posttranslationel modifikation (PTM) status til neuropeptider fra komplekse blandinger uden forudgående viden for at hjælpe med at fastslå deres funktion 7,8. Ud over kvalitativ information muliggør MS kvantitativ information om neuropeptider gennem etiketfri kvantation (LFQ) eller etiketbaserede metoder såsom isotopisk eller isobarisk mærkning9. De vigtigste fordele ved LFQ inkluderer dens enkelhed, lave analyseomkostninger og reducerede prøveforberedelsestrin, som kan minimere prøvetab. Ulemperne ved LFQ omfatter imidlertid øgede instrumenttidsomkostninger, da det kræver flere tekniske replikater for at imødegå kvantitative fejl fra run-to-run-variabilitet. Dette fører også til en nedsat evne til nøjagtigt at kvantificere små variationer. Etiketbaserede metoder udsættes for mindre systematisk variation, da flere prøver kan mærkes forskelligt ved hjælp af en række stabile isotoper, kombineres til en prøve og analyseres gennem massespektrometri samtidigt. Dette øger også gennemstrømningen, selvom isotopetiketter kan være tidskrævende og dyre at syntetisere eller købe. Fuld scanningsmassespektre (MS1) spektral kompleksitet øges også, når multiplexering øges, hvilket reducerer antallet af unikke neuropeptider, der kan fragmenteres og derfor identificeres. Omvendt øger isobarisk mærkning ikke spektral kompleksitet på MS1-niveau, selvom det introducerer udfordringer for analytter med lav overflod såsom neuropeptider. Da isobarisk kvantificering udføres på fragmentionsmassespektre (MS2) niveau, kan neuropeptider med lav overflod muligvis ikke kvantificeres, da mere rigelige matrixkomponenter kan vælges til fragmentering, og de udvalgte muligvis ikke har høj nok overflod til at blive kvantificeret. Med isotopmærkning kan kvantation udføres på hvert identificeret peptid.
Ud over identifikation og kvantificering kan lokaliseringsoplysninger opnås af MS gennem MALDI-MS-billeddannelse (MALDI-MSI)10. Ved at rastere en laser hen over en prøveoverflade kan MS-spektre kompileres til et varmekortbillede for hver m/z-værdi . Kortlægning af forbigående neuropeptidsignalintensitet i forskellige regioner på tværs af forhold kan give værdifuld information til funktionsbestemmelse11. Lokalisering af neuropeptider er især vigtig, fordi neuropeptidfunktionen kan variere afhængigt af placering12.
Neuropeptider findes i lavere overflod in vivo end andre signalmolekyler, såsom neurotransmittere, og kræver derfor følsomme metoder tilpåvisning 13. Dette kan opnås ved fjernelse af matrixkomponenter med højere overflod, såsom lipider11,14. Yderligere overvejelser i forbindelse med analysen af neuropeptider skal foretages i forhold til almindelige proteomics-arbejdsgange, hovedsageligt fordi de fleste neuropeptidomiske analyser udelader enzymatisk fordøjelse. Dette begrænser softwaremulighederne for neuropeptiddataanalyse, da de fleste blev bygget med algoritmer baseret på proteomics-data og proteinmatch informeret af peptiddetektion. Imidlertid er mange software som PEAKS15 mere velegnet til neuropeptidanalyse på grund af deres de novo-sekventeringsfunktioner. Flere faktorer skal overvejes til analyse af neuropeptider startende fra ekstraktionsmetode til MS-dataanalyse.
De protokoller, der er beskrevet her, omfatter metoder til prøveforberedelse og dimethylisotopmærkning, dataindsamling og dataanalyse af neuropeptider af LC-ESI-MS, MALDI-MS og MALDI-MSI. Gennem repræsentative resultater fra flere eksperimenter demonstreres nytten og evnen af disse metoder til at identificere, kvantificere og lokalisere neuropeptider fra blå krabber, Callinectes sapidus. For bedre at forstå nervesystemet anvendes modelsystemer ofte. Mange organismer har ikke et fuldt sekventeret genom til rådighed, hvilket forhindrer omfattende neuropeptidopdagelse på peptidniveau. For at afbøde denne udfordring er en protokol til identifikation af nye neuropeptider og transkriptomminedrift til generering af databaser for organismer uden fuldstændig genominformation inkluderet. Alle protokoller, der præsenteres her, kan optimeres til neuropeptidprøver fra enhver art såvel som anvendes til analyse af eventuelle endogene peptider.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den nøjagtige identifikation, kvantificering og lokalisering af neuropeptider og endogene peptider, der findes i nervesystemet, er afgørende for at forstå deres funktion23,24. Massespektrometri er en kraftfuld teknik, der kan gøre det muligt at opnå alt dette, selv i organismer uden et fuldt sekventeret genom. Denne protokols evne til at detektere, kvantificere og lokalisere neuropeptider fra væv indsamlet fra C. sapidus gennem en kombination af LC…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskning blev støttet af National Science Foundation (CHE-1710140 og CHE-2108223) og National Institutes of Health (NIH) gennem tilskud R01DK071801. A.P. blev delvist støttet af NIH Chemistry-Biology Interface Training Grant (T32 GM008505). N.V.Q. blev delvist støttet af National Institutes of Health under Ruth L. Kirschstein National Research Service Award fra National Heart Lung and Blood Institute til University of Wisconsin-Madison Cardiovascular Research Center (T32 HL007936). L.L. vil gerne anerkende NIH-tilskud R56 MH110215, S10RR029531 og S10OD025084 samt finansieringsstøtte fra et Vilas Distinguished Achievement Professorat og Charles Melbourne Johnson Professorat med finansiering fra Wisconsin Alumni Research Foundation og University of Wisconsin-Madison School of Pharmacy.
Materials
| Chemicals, Reagents, and Consumables | |||
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix | Supelco | 39319 | |
| Acetic acid | Fisher Chemical | A38S-500 | |
| Acetonitrile Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | A955-500 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| Borane pyridine | Sigma-Aldrich | 179752 | |
| Bruker peptide calibration mix | Bruker Daltonics | NC9846988 | |
| Capillary | Polymicro | 1068150019 | to make nanoflow column (75 µm inner diameter x 360 µm outer diameter) |
| Cryostat cup | Sigma-Aldrich | E6032 | any cup or mold should work |
| Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30108434 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| Formaldehyde – D2 | Sigma-Aldrich | 492620 | |
| Formic acid Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | A117-50 | |
| Gelatin | Difco | 214340 | place in 37 °C water bath to melt |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Labs | 15553953 | |
| Indium tin oxide (ITO)-coated glass slides | Delta Technologies | CB-90IN-S107 | 25 mm x 75 mm x 0.8 mm (width x length x thickness) |
| LC-MS vials | Thermo | TFMSCERT5000-30LVW | |
| Methanol Optima LC/MS Grade | Fisher Chemical | A456-500 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | Hydrophobic film |
| pH-Indicator strips | Supelco | 109450 | |
| Red phosphorus clusters | Sigma-Aldrich | 343242 | |
| Reversed phase C18 material | Waters | 186002350 | manually packed into nanoflow column |
| Wite-out pen | BIC | 150810 | |
| ZipTip | Millipore | Z720070 | |
| Instruments and Tools | |||
| Automatic matrix sprayer system- M5 | HTX Technologies, LLC | ||
| Centrifuge – 5424 R | Eppendorf | 05-401-205 | |
| Cryostat- HM 550 | Thermo Fisher Scientific | 956564A | |
| Desiccant | Drierite | 2088701 | |
| Forceps | WPI | 501764 | |
| MALDI stainless steel target plate | Bruker Daltonics | 8280781 | |
| Pipet-Lite XLS | Rainin | 17014391 | 200 µL |
| Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBDK | |
| RapifleX MALDI-TOF/TOF | Bruker Daltonics | ||
| SpeedVac – SVC100 | Savant | SVC-100D | |
| Ultrasonic Cleaner | Bransonic | 2510R-MTH | for sonication |
| Ultrasonic homogenizer | Fisher Scientific | FB120110 | FB120 Sonic Dismembrator with CL-18 Probe |
| Vaccum pump- Alcatel 2008 A | Ideal Vacuum Products | P10976 | ultimate pressure = 1 x 10-4 Torr |
| Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| Water bath (37C) – Isotemp 110 | Fisher Scientific | 15-460-10 | |
| Data Analysis Software | |||
| Expasy | https://web.expasy.org/translate/ | ||
| FlexAnalysis | Bruker Daltonics | ||
| FlexControl | Bruker Daltonics | ||
| FlexImaging | Bruker Daltonics | ||
| PEAKS Studio | Bioinformatics Solutions, Inc. | ||
| SCiLS Lab | https://scils.de/ | ||
| SignalP 5.0 | https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0 | ||
| tBLASTn | http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_ PROGRAMS=tblastn&PAGE_ TYPE=BlastSearch&SHOW_ DEFAULTS=on&LINK_LOC =blasthome |
References
- Hökfelt, T., et al. Neuropeptides – an overview. Neuropharmacology. 39 (8), 1337-1356 (2000).
- Radhakrishnan, V., Henry, J. L. Electrophysiology of neuropeptides in the sensory spinal cord. Progress in Brain Research. 104, 175-195 (1995).
- Nässel, D. R., Ekström, P. Detection of neuropeptides by immunocytochemistry. Methods in Molecular Biology. 72, 71-101 (1997).
- Martins, J., et al. Activation of Neuropeptide Y Receptors Modulates Retinal Ganglion Cell Physiology and Exerts Neuroprotective Actions In Vitro. ASN Neuro. 7 (4), 1759091415598292 (2015).
- Racaityte, K., Lutz, E. S. M., Unger, K. K., Lubda, D., Boos, K. S. Analysis of neuropeptide Y and its metabolites by high-performance liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry and integrated sample clean-up with a novel restricted-access sulphonic acid cation exchanger. Journal of Chromatography. A. 890 (1), 135-144 (2000).
- Salisbury, J. P., et al. A rapid MALDI-TOF mass spectrometry workflow for Drosophila melanogaster differential neuropeptidomics. Molecular Brain. 6, 60 (2013).
- Schmerberg, C. M., Li, L. Function-driven discovery of neuropeptides with mass spectrometry-based tools. Protein and Peptide Letters. 20 (6), 681-694 (2013).
- Lee, J. E. Neuropeptidomics: Mass Spectrometry-Based Identification and Quantitation of Neuropeptides. Genomics & Informatics. 14 (1), 12-19 (2016).
- Sauer, C. S., Phetsanthad, A., Riusech, O. L., Li, L. Developing mass spectrometry for the quantitative analysis of neuropeptides. Expert Review of Proteomics. 18 (7), 607-621 (2021).
- Pratavieira, M., et al. MALDI Imaging Analysis of Neuropeptides in Africanized Honeybee ( Apis mellifera) Brain: Effect of Aggressiveness. Journal of Proteome Research. 17 (7), 2358-2369 (2018).
- Buchberger, A. R., Vu, N. Q., Johnson, J., DeLaney, K., Li, L. A Simple and Effective Sample Preparation Strategy for MALDI-MS Imaging of Neuropeptide Changes in the Crustacean Brain Due to Hypoxia and Hypercapnia Stress. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (5), 1058-1065 (2020).
- Vu, N. Q., DeLaney, K., Li, L. Neuropeptidomics: Improvements in Mass Spectrometry Imaging Analysis and Recent Advancements. Current Protein & Peptide Science. 22 (2), 158-169 (2021).
- Li, L., Sweedler, J. V. Peptides in the brain: mass spectrometry-based measurement approaches and challenges. Annual Review of Analytical Chemistry (Palo Alto, Calif). 1, 451-483 (2008).
- Li, N., et al. Sequential Precipitation and Delipidation Enables Efficient Enrichment of Low-Molecular Weight Proteins and Peptides from Human Plasma. Journal of Proteome Research. 19 (8), 3340-3351 (2020).
- Zhang, J., et al. PEAKS DB: de novo sequencing assisted database search for sensitive and accurate peptide identification. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 11 (4), (2012).
- Sturm, R. M., Greer, T., Woodards, N., Gemperline, E., Li, L. Mass spectrometric evaluation of neuropeptidomic profiles upon heat stabilization treatment of neuroendocrine tissues in crustaceans. Journal of Proteome Research. 12 (2), 743-752 (2013).
- Gutierrez, G. J., Grashow, R. G. Cancer borealis stomatogastric nervous system dissection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (25), e1207 (2009).
- DeLaney, K., et al. PRESnovo: Prescreening Prior to de novo Sequencing to Improve Accuracy and Sensitivity of Neuropeptide Identification. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (7), 1358-1371 (2020).
- Oleisky, E. R., Stanhope, M. E., Hull, J. J., Christie, A. E., Dickinson, P. S. Differential neuropeptide modulation of premotor and motor neurons in the lobster cardiac ganglion. Journal of Neurophysiology. 124 (4), 1241-1256 (2020).
- Ma, M., et al. Combining in silico transcriptome mining and biological mass spectrometry for neuropeptide discovery in the Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei. Peptides. 31 (1), 27-43 (2010).
- Christie, A. E., Stemmler, E. A., Dickinson, P. S. Crustacean neuropeptides. Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 67 (24), 4135-4169 (2010).
- DeLaney, K., et al. New techniques, applications and perspectives in neuropeptide research. The Journal of Experimental Biology. 221, (2018).
- Habenstein, J., et al. Transcriptomic, peptidomic, and mass spectrometry imaging analysis of the brain in the ant Cataglyphis nodus. Journal of Neurochemistry. 158 (2), 391-412 (2021).
- Maes, K., et al. Improved sensitivity of the nano ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric analysis of low-concentrated neuropeptides by reducing aspecific adsorption and optimizing the injection solvent. Journal of Chromatography. A. 1360, 217-228 (2014).
- Li, G., et al. Nanosecond photochemically promoted click chemistry for enhanced neuropeptide visualization and rapid protein labeling. Nature Communications. 10 (1), 4697 (2019).
- Corbière, A., et al. Strategies for the Identification of Bioactive Neuropeptides in Vertebrates. Frontiers in Neuroscience. 13, 948 (2019).
- Chen, R., Ma, M., Hui, L., Zhang, J., Li, L. Measurement of neuropeptides in crustacean hemolymph via MALDI mass spectrometry. Journal of American Society for Mass Spectrometry. 20 (4), 708-718 (2009).
- Fridjonsdottir, E., Nilsson, A., Wadensten, H., Andrén, P. E. Brain Tissue Sample Stabilization and Extraction Strategies for Neuropeptidomics. Peptidomics: Methods and Strategies. , 41-49 (2018).
- Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. Mass Spectrometry Imaging: A Review of Emerging Advancements and Future Insights. Analytical Chemistry. 90 (1), 240-265 (2018).
- Phetsanthad, A., et al. Recent advances in mass spectrometry analysis of neuropeptides. Mass Spectrometry Reviews. , 21734 (2021).
- Pérez-Cova, M., Bedia, C., Stoll, D. R., Tauler, R., Jaumot, J. MSroi: A pre-processing tool for mass spectrometry-based studies. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 215, 104333 (2021).
- Christie, A. E., Chi, M. Prediction of the neuropeptidomes of members of the Astacidea (Crustacea, Decapoda) using publicly accessible transcriptome shotgun assembly (TSA) sequence data. General and Comparative Endocrinology. 224, 38-60 (2015).
- Livnat, I., et al. A d-Amino Acid-Containing Neuropeptide Discovery Funnel. Analytical Chemistry. 88 (23), 11868-11876 (2016).
- Lehrer, R. I., Ganz, T. Defensins: endogenous antibiotic peptides from human leukocytes. Ciba Foundation Symposium. 171, 276-290 (1992).
