Callinectes sapidus'ta Nöropeptitlerin Çok Yönlü Kütle Spektrometrik Araştırması
Summary
Nöropeptitlerin kütle spektrometrik karakterizasyonu sekans, kantitasyon ve lokalizasyon bilgileri sağlar. Bu optimize edilmiş iş akışı sadece nöropeptit çalışmaları için değil, aynı zamanda diğer endojen peptitler için de yararlıdır. Burada verilen protokoller, LC-ESI-MS, MALDI-MS lekeleme ve MALDI-MS görüntüleme kullanılarak nöropeptitlerin örnek hazırlama, MS edinimi, MS analizi ve veritabanı oluşturmayı açıklamaktadır.
Abstract
Nöropeptitler, gelişim, üreme, gıda alımı ve dış stresörlere yanıt gibi hemen hemen tüm fizyolojik ve davranışsal süreçleri düzenleyen sinyal molekülleridir. Bununla birlikte, nöropeptitlerin biyokimyasal mekanizmaları ve tam tamamlayıcısı ve fonksiyonel rolleri tam olarak anlaşılamamıştır. Bu endojen peptitlerin karakterizasyonu, bu sinyal molekülleri sınıfındaki muazzam çeşitlilik tarafından engellenir. Ek olarak, nöropeptitler, nörotransmitterlerinkinden 100x – 1000x daha düşük konsantrasyonlarda biyoaktiftir ve sinaptik salınımdan sonra enzimatik bozunmaya eğilimlidir. Kütle spektrometresi (MS), kapsamlı a priori bilgi olmadan analitleri tanımlayabilen, ölçebilen ve lokalize edebilen oldukça hassas bir analitik araçtır. Nöropeptitlerin küresel olarak profillenmesi ve yeni peptitlerin keşfine yardımcı olmak için çok uygundur. Bu peptit sınıfının düşük bolluğu ve yüksek kimyasal çeşitliliği nedeniyle, çeşitli numune hazırlama yöntemleri, MS edinme parametreleri ve veri analizi stratejileri, optimal nöropeptit karakterizasyonuna izin vermek için proteomik tekniklerden uyarlanmıştır. Burada, sıvı kromatografisi (LC)-MS ve matris yardımlı lazer desorpsiyon/iyonizasyonu (MALDI)-MS kullanılarak sekans karakterizasyonu, kantitasyonu ve lokalizasyonu için nöropeptitleri karmaşık biyolojik dokulardan izole etmek için yöntemler tanımlanmıştır. Mavi yengeçten bir nöropeptit veritabanı hazırlamak için bir protokol, kapsamlı genomik bilgiye sahip olmayan bir organizma olan Callinectes sapidus dahil edilmiştir. Bu iş akışları, çeşitli aletler kullanılarak farklı türlerdeki diğer endojen peptit sınıflarını incelemek için uyarlanabilir.
Introduction
Sinir sistemi karmaşıktır ve bir organizma boyunca sinyalleri iletmek için bir nöron ağı gerektirir. Sinir sistemi duyusal bilgileri ve biyolojik tepkiyi koordine eder. Sinyal iletiminde yer alan karmaşık ve kıvrımlı etkileşimler, nörotransmiterler, steroidler ve nöropeptitler gibi birçok farklı sinyal molekülü gerektirir. Nöropeptitler, strese ve diğer uyaranlara karşı fizyolojik tepkileri aktive etmede kilit rol oynayan en çeşitli ve güçlü sinyal molekülleri olduğundan, bu fizyolojik süreçlerdeki spesifik rollerini belirlemek ilgi çekicidir. Nöropeptit fonksiyonu, hareketliliği, reseptör etkileşimini ve afinite1’i belirleyen amino asit yapıları ile ilgilidir. Nöropeptitler dokunun farklı bölgelerinde sentezlenebildiği, depolanabildiği ve salınabildiği için önemli olan histokimya ve elektrofizyoloji gibi teknikler, nöropeptit yapısını ve fonksiyonunu araştırmak için kullanılmıştır 2,3,4, ancak bu yöntemler nöropeptitlerin geniş dizi çeşitliliğini çözmek için verim ve özgüllük ile sınırlıdır.
Kütle spektrometresi (MS), nöropeptit yapısının ve bolluğunun yüksek verimli analizini sağlar. Bu, farklı MS teknikleriyle, en yaygın olarak sıvı kromatografi-elektrosprey iyonizasyon MS (LC-ESI-MS)5 ve matris yardımlı lazer desorpsiyon / iyonizasyon MS (MALDI-MS) 6 ile gerçekleştirilebilir. Yüksek hassasiyetli kütle ölçümleri ve MS parçalanması kullanan MS, fonksiyonlarını belirlemeye yardımcı olmak için a priori bilgi olmadan karmaşık karışımlardan nöropeptitlere amino asit dizisi ve post-translasyonel modifikasyon (PTM) durumu atama yeteneği sağlar 7,8. Nitel bilgilere ek olarak, MS, etiketsiz kantitasyon (LFQ) veya izotopik veya izobarik etiketleme9 gibi etiket tabanlı yöntemler yoluyla nöropeptitlerin nicel bilgisini sağlar. LFQ’nun başlıca avantajları arasında basitliği, düşük analiz maliyeti ve numune kaybını en aza indirebilecek daha az numune hazırlama adımları sayılabilir. Bununla birlikte, LFQ’nun dezavantajları, çalıştırmadan çalıştırmaya değişkenlikten kaynaklanan nicel hatayı ele almak için birden fazla teknik çoğaltma gerektirdiğinden, artan cihaz zaman maliyetlerini içerir. Bu aynı zamanda küçük varyasyonları doğru bir şekilde ölçme yeteneğinin azalmasına da yol açar. Etiket tabanlı yöntemler, birden fazla numune çeşitli kararlı izotoplar kullanılarak farklı şekilde etiketlenebildiği, tek bir numunede birleştirilebildiği ve aynı anda kütle spektrometresi ile analiz edilebildiği için daha az sistematik varyasyona tabi tutulur. Bu aynı zamanda verimi de artırır, ancak izotopik etiketlerin sentezlenmesi veya satın alınması zaman alıcı ve maliyetli olabilir. Tam tarama kütle spektrumu (MS1) spektral karmaşıklığı, çoklama arttıkça da artar, bu da parçalanabilen ve dolayısıyla tanımlanabilen benzersiz nöropeptitlerin sayısını azaltır. Tersine, izobarik etiketleme, MS1 seviyesinde spektral karmaşıklığı arttırmaz, ancak nöropeptitler gibi düşük bolluktaki analitler için zorluklar getirir. İzobarik kantitasyon, fragman iyon kütle spektrumu (MS2) seviyesinde gerçekleştirildiğinden, düşük bolluktaki nöropeptitler, parçalanma için daha bol miktarda matris bileşenleri seçilebileceğinden ve seçilenler nicelleştirilecek kadar yüksek bolluğa sahip olmayabileceğinden, nicelleştirilemeyebilir. İzotopik etiketleme ile, tanımlanan her peptid üzerinde kantitasyon yapılabilir.
Tanımlama ve nicelleştirmeye ek olarak, lokalizasyon bilgileri MS tarafından MALDI-MS görüntüleme (MALDI-MSI) yoluyla elde edilebilir10. Bir lazeri örnek bir yüzey boyunca rasterleştirerek, MS spektrumları her m / z değeri için bir ısı haritası görüntüsünde derlenebilir. Farklı bölgelerdeki geçici nöropeptit sinyal yoğunluğunun koşullar arasında haritalanması, fonksiyon tayini için değerli bilgiler sağlayabilir11. Nöropeptitlerin lokalizasyonu özellikle önemlidir, çünkü nöropeptit fonksiyonulokalizasyon 12. yere bağlı olarak farklılık gösterebilir.
Nöropeptitler, nörotransmiterler gibi diğer sinyal moleküllerinden in vivo olarak daha düşük bollukta bulunur ve bu nedenle tespit için hassas yöntemler gerektirir13. Bu, lipitler11,14 gibi daha yüksek bolluk matrisi bileşenlerinin çıkarılmasıyla sağlanabilir. Nöropeptitlerin analizi için ek hususlar, yaygın proteomik iş akışlarıyla karşılaştırıldığında yapılmalıdır, çünkü çoğu nöropeptidomik analiz enzimatik sindirimi atlar. Bu, nöropeptit veri analizi için yazılım seçeneklerini sınırlar, çünkü çoğu proteomik verilere ve peptid tespiti tarafından bilgilendirilen protein eşleşmelerine dayanan algoritmalarla oluşturulmuştur. Bununla birlikte, PEAKS15 gibi birçok yazılım, de novo dizileme yetenekleri nedeniyle nöropeptit analizine daha uygundur. Nöropeptitlerin analizinde ekstraksiyon yönteminden MS veri analizine kadar çeşitli faktörlerin göz önünde bulundurulması gerekmektedir.
Burada açıklanan protokoller, numune hazırlama ve dimetil izotopik etiketleme, veri toplama ve nöropeptitlerin LC-ESI-MS, MALDI-MS ve MALDI-MSI ile veri analizi için yöntemleri içerir. Birkaç deneyden elde edilen temsili sonuçlarla, bu yöntemlerin mavi yengeçlerden nöropeptitleri tanımlama, ölçme ve lokalize etme konusundaki yararı ve yeteneği Callinectes sapidus gösterilmiştir. Sinir sistemini daha iyi anlamak için, model sistemler yaygın olarak kullanılmaktadır. Birçok organizma, peptid seviyesinde kapsamlı nöropeptit keşfini önleyen tam olarak sıralanmış bir genoma sahip değildir. Bu zorluğu hafifletmek için, tam genom bilgisi olmayan organizmalar için veritabanları oluşturmak üzere yeni nöropeptitleri ve transkriptom madenciliğini tanımlamak için bir protokol dahil edilmiştir. Burada sunulan tüm protokoller, herhangi bir türden nöropeptit örnekleri için optimize edilebilir ve ayrıca herhangi bir endojen peptidin analizi için uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sinir sisteminde bulunan nöropeptitlerin ve endojen peptitlerin doğru tanımlanması, nicelleştirilmesi ve lokalizasyonu, fonksiyonlarını anlamak için çok önemlidir23,24. Kütle spektrometresi, tam olarak sıralanmış bir genomu olmayan organizmalarda bile, tüm bunların gerçekleştirilmesine izin verebilecek güçlü bir tekniktir. Bu protokolün, LC-ESI- ve MALDI- MS’in bir kombinasyonu yoluyla C. sapidus’tan toplanan dokudan nöropeptitleri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma Ulusal Bilim Vakfı (CHE-1710140 ve CHE-2108223) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) tarafından R01DK071801 hibesi ile desteklenmiştir. AP kısmen NIH Kimya-Biyoloji Arayüzü Eğitim Hibesi (T32 GM008505) tarafından desteklenmiştir. N.V.Q., Ulusal Kalp Akciğer ve Kan Enstitüsü’nden Wisconsin-Madison Üniversitesi Kardiyovasküler Araştırma Merkezi’ne (T32 HL007936) Ruth L. Kirschstein Ulusal Araştırma Hizmeti Ödülü kapsamında Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından kısmen desteklenmiştir. L.L., NIH hibeleri R56 MH110215, S10RR029531 ve S10OD025084’ün yanı sıra Wisconsin Mezunları Araştırma Vakfı ve Wisconsin-Madison Üniversitesi Eczacılık Fakültesi tarafından sağlanan fon ile Vilas Seçkin Başarı Profesörlüğü ve Charles Melbourne Johnson Profesörlüğünden finansman desteğini kabul etmek ister.
Materials
| Chemicals, Reagents, and Consumables | |||
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix | Supelco | 39319 | |
| Acetic acid | Fisher Chemical | A38S-500 | |
| Acetonitrile Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | A955-500 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| Borane pyridine | Sigma-Aldrich | 179752 | |
| Bruker peptide calibration mix | Bruker Daltonics | NC9846988 | |
| Capillary | Polymicro | 1068150019 | to make nanoflow column (75 µm inner diameter x 360 µm outer diameter) |
| Cryostat cup | Sigma-Aldrich | E6032 | any cup or mold should work |
| Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30108434 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| Formaldehyde – D2 | Sigma-Aldrich | 492620 | |
| Formic acid Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | A117-50 | |
| Gelatin | Difco | 214340 | place in 37 °C water bath to melt |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Labs | 15553953 | |
| Indium tin oxide (ITO)-coated glass slides | Delta Technologies | CB-90IN-S107 | 25 mm x 75 mm x 0.8 mm (width x length x thickness) |
| LC-MS vials | Thermo | TFMSCERT5000-30LVW | |
| Methanol Optima LC/MS Grade | Fisher Chemical | A456-500 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | Hydrophobic film |
| pH-Indicator strips | Supelco | 109450 | |
| Red phosphorus clusters | Sigma-Aldrich | 343242 | |
| Reversed phase C18 material | Waters | 186002350 | manually packed into nanoflow column |
| Wite-out pen | BIC | 150810 | |
| ZipTip | Millipore | Z720070 | |
| Instruments and Tools | |||
| Automatic matrix sprayer system- M5 | HTX Technologies, LLC | ||
| Centrifuge – 5424 R | Eppendorf | 05-401-205 | |
| Cryostat- HM 550 | Thermo Fisher Scientific | 956564A | |
| Desiccant | Drierite | 2088701 | |
| Forceps | WPI | 501764 | |
| MALDI stainless steel target plate | Bruker Daltonics | 8280781 | |
| Pipet-Lite XLS | Rainin | 17014391 | 200 µL |
| Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBDK | |
| RapifleX MALDI-TOF/TOF | Bruker Daltonics | ||
| SpeedVac – SVC100 | Savant | SVC-100D | |
| Ultrasonic Cleaner | Bransonic | 2510R-MTH | for sonication |
| Ultrasonic homogenizer | Fisher Scientific | FB120110 | FB120 Sonic Dismembrator with CL-18 Probe |
| Vaccum pump- Alcatel 2008 A | Ideal Vacuum Products | P10976 | ultimate pressure = 1 x 10-4 Torr |
| Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| Water bath (37C) – Isotemp 110 | Fisher Scientific | 15-460-10 | |
| Data Analysis Software | |||
| Expasy | https://web.expasy.org/translate/ | ||
| FlexAnalysis | Bruker Daltonics | ||
| FlexControl | Bruker Daltonics | ||
| FlexImaging | Bruker Daltonics | ||
| PEAKS Studio | Bioinformatics Solutions, Inc. | ||
| SCiLS Lab | https://scils.de/ | ||
| SignalP 5.0 | https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0 | ||
| tBLASTn | http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_ PROGRAMS=tblastn&PAGE_ TYPE=BlastSearch&SHOW_ DEFAULTS=on&LINK_LOC =blasthome |
References
- Hökfelt, T., et al. Neuropeptides – an overview. Neuropharmacology. 39 (8), 1337-1356 (2000).
- Radhakrishnan, V., Henry, J. L. Electrophysiology of neuropeptides in the sensory spinal cord. Progress in Brain Research. 104, 175-195 (1995).
- Nässel, D. R., Ekström, P. Detection of neuropeptides by immunocytochemistry. Methods in Molecular Biology. 72, 71-101 (1997).
- Martins, J., et al. Activation of Neuropeptide Y Receptors Modulates Retinal Ganglion Cell Physiology and Exerts Neuroprotective Actions In Vitro. ASN Neuro. 7 (4), 1759091415598292 (2015).
- Racaityte, K., Lutz, E. S. M., Unger, K. K., Lubda, D., Boos, K. S. Analysis of neuropeptide Y and its metabolites by high-performance liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry and integrated sample clean-up with a novel restricted-access sulphonic acid cation exchanger. Journal of Chromatography. A. 890 (1), 135-144 (2000).
- Salisbury, J. P., et al. A rapid MALDI-TOF mass spectrometry workflow for Drosophila melanogaster differential neuropeptidomics. Molecular Brain. 6, 60 (2013).
- Schmerberg, C. M., Li, L. Function-driven discovery of neuropeptides with mass spectrometry-based tools. Protein and Peptide Letters. 20 (6), 681-694 (2013).
- Lee, J. E. Neuropeptidomics: Mass Spectrometry-Based Identification and Quantitation of Neuropeptides. Genomics & Informatics. 14 (1), 12-19 (2016).
- Sauer, C. S., Phetsanthad, A., Riusech, O. L., Li, L. Developing mass spectrometry for the quantitative analysis of neuropeptides. Expert Review of Proteomics. 18 (7), 607-621 (2021).
- Pratavieira, M., et al. MALDI Imaging Analysis of Neuropeptides in Africanized Honeybee ( Apis mellifera) Brain: Effect of Aggressiveness. Journal of Proteome Research. 17 (7), 2358-2369 (2018).
- Buchberger, A. R., Vu, N. Q., Johnson, J., DeLaney, K., Li, L. A Simple and Effective Sample Preparation Strategy for MALDI-MS Imaging of Neuropeptide Changes in the Crustacean Brain Due to Hypoxia and Hypercapnia Stress. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (5), 1058-1065 (2020).
- Vu, N. Q., DeLaney, K., Li, L. Neuropeptidomics: Improvements in Mass Spectrometry Imaging Analysis and Recent Advancements. Current Protein & Peptide Science. 22 (2), 158-169 (2021).
- Li, L., Sweedler, J. V. Peptides in the brain: mass spectrometry-based measurement approaches and challenges. Annual Review of Analytical Chemistry (Palo Alto, Calif). 1, 451-483 (2008).
- Li, N., et al. Sequential Precipitation and Delipidation Enables Efficient Enrichment of Low-Molecular Weight Proteins and Peptides from Human Plasma. Journal of Proteome Research. 19 (8), 3340-3351 (2020).
- Zhang, J., et al. PEAKS DB: de novo sequencing assisted database search for sensitive and accurate peptide identification. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 11 (4), (2012).
- Sturm, R. M., Greer, T., Woodards, N., Gemperline, E., Li, L. Mass spectrometric evaluation of neuropeptidomic profiles upon heat stabilization treatment of neuroendocrine tissues in crustaceans. Journal of Proteome Research. 12 (2), 743-752 (2013).
- Gutierrez, G. J., Grashow, R. G. Cancer borealis stomatogastric nervous system dissection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (25), e1207 (2009).
- DeLaney, K., et al. PRESnovo: Prescreening Prior to de novo Sequencing to Improve Accuracy and Sensitivity of Neuropeptide Identification. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (7), 1358-1371 (2020).
- Oleisky, E. R., Stanhope, M. E., Hull, J. J., Christie, A. E., Dickinson, P. S. Differential neuropeptide modulation of premotor and motor neurons in the lobster cardiac ganglion. Journal of Neurophysiology. 124 (4), 1241-1256 (2020).
- Ma, M., et al. Combining in silico transcriptome mining and biological mass spectrometry for neuropeptide discovery in the Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei. Peptides. 31 (1), 27-43 (2010).
- Christie, A. E., Stemmler, E. A., Dickinson, P. S. Crustacean neuropeptides. Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 67 (24), 4135-4169 (2010).
- DeLaney, K., et al. New techniques, applications and perspectives in neuropeptide research. The Journal of Experimental Biology. 221, (2018).
- Habenstein, J., et al. Transcriptomic, peptidomic, and mass spectrometry imaging analysis of the brain in the ant Cataglyphis nodus. Journal of Neurochemistry. 158 (2), 391-412 (2021).
- Maes, K., et al. Improved sensitivity of the nano ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric analysis of low-concentrated neuropeptides by reducing aspecific adsorption and optimizing the injection solvent. Journal of Chromatography. A. 1360, 217-228 (2014).
- Li, G., et al. Nanosecond photochemically promoted click chemistry for enhanced neuropeptide visualization and rapid protein labeling. Nature Communications. 10 (1), 4697 (2019).
- Corbière, A., et al. Strategies for the Identification of Bioactive Neuropeptides in Vertebrates. Frontiers in Neuroscience. 13, 948 (2019).
- Chen, R., Ma, M., Hui, L., Zhang, J., Li, L. Measurement of neuropeptides in crustacean hemolymph via MALDI mass spectrometry. Journal of American Society for Mass Spectrometry. 20 (4), 708-718 (2009).
- Fridjonsdottir, E., Nilsson, A., Wadensten, H., Andrén, P. E. Brain Tissue Sample Stabilization and Extraction Strategies for Neuropeptidomics. Peptidomics: Methods and Strategies. , 41-49 (2018).
- Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. Mass Spectrometry Imaging: A Review of Emerging Advancements and Future Insights. Analytical Chemistry. 90 (1), 240-265 (2018).
- Phetsanthad, A., et al. Recent advances in mass spectrometry analysis of neuropeptides. Mass Spectrometry Reviews. , 21734 (2021).
- Pérez-Cova, M., Bedia, C., Stoll, D. R., Tauler, R., Jaumot, J. MSroi: A pre-processing tool for mass spectrometry-based studies. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 215, 104333 (2021).
- Christie, A. E., Chi, M. Prediction of the neuropeptidomes of members of the Astacidea (Crustacea, Decapoda) using publicly accessible transcriptome shotgun assembly (TSA) sequence data. General and Comparative Endocrinology. 224, 38-60 (2015).
- Livnat, I., et al. A d-Amino Acid-Containing Neuropeptide Discovery Funnel. Analytical Chemistry. 88 (23), 11868-11876 (2016).
- Lehrer, R. I., Ganz, T. Defensins: endogenous antibiotic peptides from human leukocytes. Ciba Foundation Symposium. 171, 276-290 (1992).
