कैलिनेक्ट्स सैपिडस में न्यूरोपेप्टाइड्स की बहुआयामी मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक जांच
Summary
न्यूरोपेप्टाइड्स के मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक लक्षण वर्णन अनुक्रम, मात्रा और स्थानीयकरण जानकारी प्रदान करता है। यह अनुकूलित वर्कफ़्लो न केवल न्यूरोपेप्टाइड अध्ययनों के लिए उपयोगी है, बल्कि अन्य अंतर्जात पेप्टाइड्स के लिए भी उपयोगी है। यहां प्रदान किए गए प्रोटोकॉल नमूना तैयारी, एमएस अधिग्रहण, एमएस विश्लेषण, और एलसी-ईएसआई-एमएस, मालडी-एमएस स्पॉटिंग और मालडी-एमएस इमेजिंग का उपयोग करके न्यूरोपेप्टाइड्स के डेटाबेस उत्पादन का वर्णन करते हैं।
Abstract
न्यूरोपेप्टाइड्स सिग्नलिंग अणु हैं जो लगभग सभी शारीरिक और व्यवहारिक प्रक्रियाओं को विनियमित करते हैं, जैसे कि विकास, प्रजनन, भोजन का सेवन, और बाहरी तनावों की प्रतिक्रिया। फिर भी, जैव रासायनिक तंत्र और न्यूरोपेप्टाइड्स के पूर्ण पूरक और उनकी कार्यात्मक भूमिकाओं को खराब तरीके से समझा जाता है। इन अंतर्जात पेप्टाइड्स के लक्षण वर्णन सिग्नलिंग अणुओं के इस वर्ग के भीतर विशाल विविधता से बाधित है। इसके अतिरिक्त, न्यूरोपेप्टाइड्स सांद्रता में बायोएक्टिव होते हैं 100x – न्यूरोट्रांसमीटर की तुलना में 1000x कम और सिनैप्टिक रिलीज के बाद एंजाइमेटिक गिरावट के लिए प्रवण होते हैं। मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) एक अत्यधिक संवेदनशील विश्लेषणात्मक उपकरण है जो व्यापक रूप से एक प्राथमिकता ज्ञान के बिना एनालिस्ट की पहचान, मात्रा निर्धारित और स्थानीयकरण कर सकता है। यह विश्व स्तर पर प्रोफाइलिंग न्यूरोपेप्टाइड्स और उपन्यास पेप्टाइड्स की खोज में सहायता करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है। पेप्टाइड्स के इस वर्ग की कम बहुतायत और उच्च रासायनिक विविधता के कारण, कई नमूना तैयारी विधियों, एमएस अधिग्रहण मापदंडों और डेटा विश्लेषण रणनीतियों को इष्टतम न्यूरोपेप्टाइड लक्षण वर्णन की अनुमति देने के लिए प्रोटिओमिक्स तकनीकों से अनुकूलित किया गया है। यहां, तरल क्रोमैटोग्राफी (एलसी) -एमएस और मैट्रिक्स-असिस्टेड लेजर desorption / ionization (MALDI) -MS का उपयोग करके अनुक्रम लक्षण वर्णन, मात्रा और स्थानीयकरण के लिए जटिल जैविक ऊतकों से न्यूरोपेप्टाइड्स को अलग करने के लिए विधियों का वर्णन किया गया है। नीले केकड़े से एक न्यूरोपेप्टाइड डेटाबेस तैयार करने के लिए एक प्रोटोकॉल, कैलिनेक्ट्स सैपिडस, व्यापक जीनोमिक जानकारी के बिना एक जीव, शामिल है। इन वर्कफ़्लोज़ को विभिन्न प्रकार के उपकरणों का उपयोग करके विभिन्न प्रजातियों में अंतर्जात पेप्टाइड्स के अन्य वर्गों का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
Introduction
तंत्रिका तंत्र जटिल है और एक जीव में संकेतों को प्रसारित करने के लिए न्यूरॉन्स के एक नेटवर्क की आवश्यकता होती है। तंत्रिका तंत्र संवेदी जानकारी और जैविक प्रतिक्रिया का समन्वय करता है। सिग्नल ट्रांसमिशन में शामिल जटिल और जटिल इंटरैक्शन को न्यूरोट्रांसमीटर, स्टेरॉयड और न्यूरोपेप्टाइड्स जैसे कई अलग-अलग सिग्नलिंग अणुओं की आवश्यकता होती है। चूंकि न्यूरोपेप्टाइड्स सबसे विविध और शक्तिशाली सिग्नलिंग अणु हैं जो तनाव और अन्य उत्तेजनाओं के लिए शारीरिक प्रतिक्रियाओं को सक्रिय करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, इसलिए इन शारीरिक प्रक्रियाओं में उनकी विशिष्ट भूमिका निर्धारित करना दिलचस्पी है। न्यूरोपेप्टाइड फ़ंक्शन उनकी अमीनो एसिड संरचना से संबंधित है, जो गतिशीलता, रिसेप्टर इंटरैक्शन और आत्मीयता1 को निर्धारित करता है। हिस्टोकेमिस्ट्री जैसी तकनीकें, जो महत्वपूर्ण हैं क्योंकि न्यूरोपेप्टाइड्स को ऊतक के विभिन्न क्षेत्रों में संश्लेषित, संग्रहीत और जारी किया जा सकता है, और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी को न्यूरोपेप्टाइड संरचना और फ़ंक्शन 2,3,4 की जांच करने के लिए नियोजित किया गया है, लेकिन ये विधियां न्यूरोपेप्टाइड्स की विशाल अनुक्रम विविधता को हल करने के लिए थ्रूपुट और विशिष्टता द्वारा सीमित हैं।
मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) न्यूरोपेप्टाइड संरचना और बहुतायत के उच्च थ्रूपुट विश्लेषण को सक्षम बनाता है। यह विभिन्न एमएस तकनीकों के माध्यम से किया जा सकता है, सबसे अधिक तरल क्रोमैटोग्राफी-इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण एमएस (एलसी-ईएसआई-एमएस) 5 और मैट्रिक्स-असिस्टेड लेजर desorption / ionization MS (MALDI-MS)6। उच्च सटीकता द्रव्यमान माप और एमएस विखंडन का उपयोग करते हुए, एमएस अपने कार्य 7,8 का पता लगाने में सहायता करने के लिए एक प्राथमिकता ज्ञान के बिना जटिल मिश्रण से न्यूरोपेप्टाइड्स को अमीनो एसिड अनुक्रम और पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन (पीटीएम) की स्थिति असाइन करने की क्षमता प्रदान करता है। गुणात्मक जानकारी के अलावा, एमएस लेबल-मुक्त मात्रा (एलएफक्यू) या लेबल-आधारित विधियों जैसे आइसोटोपिक या आइसोबेरिक लेबलिंग9 के माध्यम से न्यूरोपेप्टाइड्स की मात्रात्मक जानकारी को सक्षम बनाता है। एलएफक्यू के मुख्य लाभों में इसकी सादगी, विश्लेषण की कम लागत और नमूना तैयारी के कदम कम हो गए हैं जो नमूना हानि को कम कर सकते हैं। हालांकि, LFQ के नुकसान में बढ़ी हुई साधन समय लागत शामिल है क्योंकि इसे रन-टू-रन परिवर्तनशीलता से मात्रात्मक त्रुटि को संबोधित करने के लिए कई तकनीकी प्रतिकृतियों की आवश्यकता होती है। यह छोटे बदलावों को सही ढंग से मापने की क्षमता में कमी की ओर भी जाता है। लेबल-आधारित विधियों को कम व्यवस्थित भिन्नता के अधीन किया जाता है क्योंकि कई नमूनों को विभिन्न प्रकार के स्थिर आइसोटोप का उपयोग करके अलग-अलग लेबल किया जा सकता है, एक नमूने में संयुक्त किया जा सकता है, और एक साथ मास स्पेक्ट्रोमेट्री के माध्यम से विश्लेषण किया जा सकता है। यह थ्रूपुट को भी बढ़ाता है, हालांकि आइसोटोपिक लेबल संश्लेषित करने या खरीदने के लिए समय लेने वाला और महंगा हो सकता है। पूर्ण स्कैन मास स्पेक्ट्रा (एमएस 1) वर्णक्रमीय जटिलता भी बढ़ जाती है क्योंकि मल्टीप्लेक्सिंग बढ़ जाती है, जो अद्वितीय न्यूरोपेप्टाइड्स की संख्या को कम कर देती है जो खंडित होने में सक्षम होती है और इसलिए, पहचानकी जाती है। इसके विपरीत, आइसोबेरिक लेबलिंग एमएस 1 स्तर पर वर्णक्रमीय जटिलता को नहीं बढ़ाता है, हालांकि यह न्यूरोपेप्टाइड्स जैसे कम बहुतायत वाले एनालिस्ट के लिए चुनौतियों का परिचय देता है। जैसा कि आइसोबेरिक मात्रा टुकड़ा आयन द्रव्यमान स्पेक्ट्रा (एमएस 2) स्तर पर किया जाता है, कम-बहुतायत वाले न्यूरोपेप्टाइड्स को परिमाणित करने में असमर्थ हो सकता है क्योंकि विखंडन के लिए अधिक प्रचुर मात्रा में मैट्रिक्स घटकों का चयन किया जा सकता है और चयनित लोगों में परिमाणित करने के लिए उच्च पर्याप्त बहुतायत नहीं हो सकती है। आइसोटोपिक लेबलिंग के साथ, प्रत्येक पहचाने गए पेप्टाइड पर मात्रा का प्रदर्शन किया जा सकता है।
पहचान और परिमाणीकरण के अलावा, स्थानीयकरण जानकारी एमएस द्वारा MALDI-MS इमेजिंग (MALDI-MSI)10 के माध्यम से प्राप्त की जा सकती है। एक नमूना सतह पर एक लेजर rastering द्वारा, एमएस स्पेक्ट्रा प्रत्येक m / z मान के लिए एक गर्मी मानचित्र छवि में संकलित किया जा सकता है। परिस्थितियों में विभिन्न क्षेत्रों में क्षणिक न्यूरोपेप्टाइड सिग्नल तीव्रता का मानचित्रण कार्य निर्धारण11 के लिए मूल्यवान जानकारी प्रदान कर सकता है। न्यूरोपेप्टाइड्स का स्थानीयकरण विशेष रूप से महत्वपूर्ण है क्योंकि न्यूरोपेप्टाइड फ़ंक्शन स्थान12 के आधार पर भिन्न हो सकता है।
न्यूरोपेप्टाइड्स अन्य सिग्नलिंग अणुओं की तुलना में विवो में कम बहुतायत में पाए जाते हैं, जैसे कि न्यूरोट्रांसमीटर, और इस प्रकार पता लगाने के लिए संवेदनशील तरीकों की आवश्यकता होतीहै 13। यह उच्च बहुतायत मैट्रिक्स घटकों को हटाने के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है, जैसे लिपिड11,14। सामान्य प्रोटिओमिक्स वर्कफ़्लो की तुलना में न्यूरोपेप्टाइड्स के विश्लेषण के लिए अतिरिक्त विचार किए जाने की आवश्यकता होती है, मुख्य रूप से क्योंकि अधिकांश न्यूरोपेप्टिडोमिक विश्लेषण एंजाइमेटिक पाचन को छोड़ देते हैं। यह न्यूरोपेप्टाइड डेटा विश्लेषण के लिए सॉफ्टवेयर विकल्पों को सीमित करता है क्योंकि अधिकांश को पेप्टाइड डिटेक्शन द्वारा सूचित प्रोटिओमिक्स डेटा और प्रोटीन मैचों के आधार पर एल्गोरिदम के साथ बनाया गया था। हालांकि, कई सॉफ़्टवेयर जैसे PEAKS15 उनकी डे नोवो अनुक्रमण क्षमताओं के कारण न्यूरोपेप्टाइड विश्लेषण के लिए अधिक अनुकूल है। निष्कर्षण विधि से एमएस डेटा विश्लेषण तक शुरू होने वाले न्यूरोपेप्टाइड्स के विश्लेषण के लिए कई कारकों पर विचार करने की आवश्यकता है।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल में नमूना तैयारी और डाइमिथाइल आइसोटोपिक लेबलिंग, डेटा अधिग्रहण, और एलसी-ईएसआई-एमएस, मालडी-एमएस और मालडी-एमएसआई द्वारा न्यूरोपेप्टाइड्स के डेटा विश्लेषण के लिए तरीके शामिल हैं। कई प्रयोगों के प्रतिनिधि परिणामों के माध्यम से, नीले केकड़ों, कैलिनेक्ट्स सैपिडस से न्यूरोपेप्टाइड्स की पहचान करने, मात्रा निर्धारित करने और स्थानीयकरण करने के लिए इन तरीकों की उपयोगिता और क्षमता का प्रदर्शन किया जाता है। तंत्रिका तंत्र को बेहतर ढंग से समझने के लिए, मॉडल सिस्टम आमतौर पर उपयोग किए जाते हैं। कई जीवों में पूरी तरह से अनुक्रमित जीनोम उपलब्ध नहीं होता है, जो पेप्टाइड स्तर पर व्यापक न्यूरोपेप्टाइड खोज को रोकता है। इस चुनौती को कम करने के लिए, पूर्ण जीनोम जानकारी के बिना जीवों के लिए डेटाबेस उत्पन्न करने के लिए उपन्यास न्यूरोपेप्टाइड्स और ट्रांसक्रिप्टोम खनन की पहचान करने के लिए एक प्रोटोकॉल शामिल है। यहां प्रस्तुत सभी प्रोटोकॉल को किसी भी प्रजाति से न्यूरोपेप्टाइड नमूनों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, साथ ही साथ किसी भी अंतर्जात पेप्टाइड्स के विश्लेषण के लिए लागू किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
तंत्रिका तंत्र में पाए जाने वाले न्यूरोपेप्टाइड्स और अंतर्जात पेप्टाइड्स की सटीक पहचान, परिमाणीकरण और स्थानीयकरण उनके कार्य23,24 को समझने की दिशा में महत्वपूर्ण हैं। मास स्पेक्ट…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध को राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (CHE-1710140 और CHE-2108223) और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (NIH) द्वारा अनुदान R01DK071801 के माध्यम से समर्थित किया गया था। एपी एनआईएच रसायन विज्ञान-जीव विज्ञान इंटरफ़ेस प्रशिक्षण अनुदान (T32 GM008505) द्वारा भाग में समर्थित था। N.V.Q. को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ द्वारा भाग में समर्थित किया गया था, रूथ एल किर्शस्टीन नेशनल रिसर्च सर्विस अवार्ड के तहत नेशनल हार्ट लंग एंड ब्लड इंस्टीट्यूट से विस्कॉन्सिन-मैडिसन कार्डियोवैस्कुलर रिसर्च सेंटर (T32 HL007936) के विश्वविद्यालय के लिए। एलएल एनआईएच अनुदान R56 MH110215, S10RR029531, और S10OD025084, साथ ही साथ एक विलास विशिष्ट उपलब्धि प्रोफेसरशिप और चार्ल्स मेलबोर्न जॉनसन प्रोफेसरशिप से विस्कॉन्सिन पूर्व छात्र अनुसंधान फाउंडेशन और विस्कॉन्सिन-मैडिसन स्कूल ऑफ फार्मेसी द्वारा प्रदान किए गए वित्त पोषण के साथ वित्त पोषण समर्थन स्वीकार करना चाहते हैं।
Materials
| Chemicals, Reagents, and Consumables | |||
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix | Supelco | 39319 | |
| Acetic acid | Fisher Chemical | A38S-500 | |
| Acetonitrile Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | A955-500 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| Borane pyridine | Sigma-Aldrich | 179752 | |
| Bruker peptide calibration mix | Bruker Daltonics | NC9846988 | |
| Capillary | Polymicro | 1068150019 | to make nanoflow column (75 µm inner diameter x 360 µm outer diameter) |
| Cryostat cup | Sigma-Aldrich | E6032 | any cup or mold should work |
| Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30108434 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| Formaldehyde – D2 | Sigma-Aldrich | 492620 | |
| Formic acid Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | A117-50 | |
| Gelatin | Difco | 214340 | place in 37 °C water bath to melt |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Labs | 15553953 | |
| Indium tin oxide (ITO)-coated glass slides | Delta Technologies | CB-90IN-S107 | 25 mm x 75 mm x 0.8 mm (width x length x thickness) |
| LC-MS vials | Thermo | TFMSCERT5000-30LVW | |
| Methanol Optima LC/MS Grade | Fisher Chemical | A456-500 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | Hydrophobic film |
| pH-Indicator strips | Supelco | 109450 | |
| Red phosphorus clusters | Sigma-Aldrich | 343242 | |
| Reversed phase C18 material | Waters | 186002350 | manually packed into nanoflow column |
| Wite-out pen | BIC | 150810 | |
| ZipTip | Millipore | Z720070 | |
| Instruments and Tools | |||
| Automatic matrix sprayer system- M5 | HTX Technologies, LLC | ||
| Centrifuge – 5424 R | Eppendorf | 05-401-205 | |
| Cryostat- HM 550 | Thermo Fisher Scientific | 956564A | |
| Desiccant | Drierite | 2088701 | |
| Forceps | WPI | 501764 | |
| MALDI stainless steel target plate | Bruker Daltonics | 8280781 | |
| Pipet-Lite XLS | Rainin | 17014391 | 200 µL |
| Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBDK | |
| RapifleX MALDI-TOF/TOF | Bruker Daltonics | ||
| SpeedVac – SVC100 | Savant | SVC-100D | |
| Ultrasonic Cleaner | Bransonic | 2510R-MTH | for sonication |
| Ultrasonic homogenizer | Fisher Scientific | FB120110 | FB120 Sonic Dismembrator with CL-18 Probe |
| Vaccum pump- Alcatel 2008 A | Ideal Vacuum Products | P10976 | ultimate pressure = 1 x 10-4 Torr |
| Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| Water bath (37C) – Isotemp 110 | Fisher Scientific | 15-460-10 | |
| Data Analysis Software | |||
| Expasy | https://web.expasy.org/translate/ | ||
| FlexAnalysis | Bruker Daltonics | ||
| FlexControl | Bruker Daltonics | ||
| FlexImaging | Bruker Daltonics | ||
| PEAKS Studio | Bioinformatics Solutions, Inc. | ||
| SCiLS Lab | https://scils.de/ | ||
| SignalP 5.0 | https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0 | ||
| tBLASTn | http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_ PROGRAMS=tblastn&PAGE_ TYPE=BlastSearch&SHOW_ DEFAULTS=on&LINK_LOC =blasthome |
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