Mangesidig massespektrometrisk undersøkelse av nevropeptider i Callinectes sapidus
Summary
Massespektrometrisk karakterisering av nevropeptider gir sekvens-, kvantifiserings- og lokaliseringsinformasjon. Denne optimaliserte arbeidsflyten er ikke bare nyttig for nevropeptidstudier, men også andre endogene peptider. Protokollene her beskriver prøvepreparering, MS-anskaffelse, MS-analyse og databasegenerering av nevropeptider ved hjelp av LC-ESI-MS, MALDI-MS spotting og MALDI-MS-avbildning.
Abstract
Neuropeptider er signalmolekyler som regulerer nesten alle fysiologiske og atferdsprosesser, for eksempel utvikling, reproduksjon, matinntak og respons på eksterne stressfaktorer. Likevel forblir de biokjemiske mekanismene og det fulle komplementet av nevropeptider og deres funksjonelle roller dårlig forstått. Karakterisering av disse endogene peptidene hindres av det enorme mangfoldet i denne klassen av signalmolekyler. I tillegg er nevropeptider bioaktive ved konsentrasjoner 100x – 1000x lavere enn for nevrotransmittere og er utsatt for enzymatisk nedbrytning etter synaptisk frigjøring. Massespektrometri (MS) er et svært følsomt analyseverktøy som kan identifisere, kvantifisere og lokalisere analytter uten omfattende forkunnskaper . Den er velegnet til globalt profilering av nevropeptider og hjelp til oppdagelsen av nye peptider. På grunn av den lave overfloden og det høye kjemiske mangfoldet i denne klassen av peptider, har flere prøveprepareringsmetoder, MS-anskaffelsesparametere og dataanalysestrategier blitt tilpasset fra proteomiske teknikker for å tillate optimal neuropeptidkarakterisering. Her er metoder beskrevet for å isolere nevropeptider fra komplekse biologiske vev for sekvenskarakterisering, kvantifisering og lokalisering ved hjelp av flytende kromatografi (LC)-MS og matriseassistert laseravledning / ionisering (MALDI)-MS. En protokoll for å forberede en nevropeptiddatabase fra den blå krabben, Callinectes sapidus, en organisme uten omfattende genomisk informasjon, er inkludert. Disse arbeidsflytene kan tilpasses for å studere andre klasser av endogene peptider i forskjellige arter ved hjelp av en rekke instrumenter.
Introduction
Nervesystemet er komplekst og krever et nettverk av nevroner for å overføre signaler gjennom en organisme. Nervesystemet koordinerer sensorisk informasjon og biologisk respons. De intrikate og innviklede interaksjonene som er involvert i signaloverføring krever mange forskjellige signalmolekyler som nevrotransmittere, steroider og nevropeptider. Siden nevropeptider er de mest varierte og potente signalmolekylene som spiller nøkkelroller i å aktivere fysiologiske responser på stress og andre stimuli, er det av interesse å bestemme deres spesifikke rolle i disse fysiologiske prosessene. Neuropeptidfunksjon er relatert til deres aminosyrestruktur, som bestemmer mobilitet, reseptorinteraksjon og affinitet1. Teknikker som histokjemi, som er viktig fordi nevropeptider kan syntetiseres, lagres og frigjøres i forskjellige områder av vevet, og elektrofysiologi har blitt brukt til å undersøke nevropeptidstruktur og funksjon 2,3,4, men disse metodene er begrenset av gjennomstrømning og spesifisitet for å løse det enorme sekvensmangfoldet av nevropeptider.
Massespektrometri (MS) muliggjør høy gjennomstrømningsanalyse av nevropeptidstruktur og overflod. Dette kan utføres gjennom forskjellige MS-teknikker, oftest flytende kromatografi-elektrosprayionisering MS (LC-ESI-MS)5 og matriseassistert laseravledning / ionisering MS (MALDI-MS)6. Ved hjelp av massemålinger med høy nøyaktighet og MS-fragmentering gir MS muligheten til å tildele aminosyresekvens og post-translasjonell modifikasjonsstatus (PTM) til nevropeptider fra komplekse blandinger uten forkunnskaper for å hjelpe til med å fastslå deres funksjon 7,8. I tillegg til kvalitativ informasjon muliggjør MS kvantitativ informasjon om nevropeptider gjennom etikettfri kvantsetting (LFQ) eller etikettbaserte metoder som isotopisk eller isobarisk merking9. De viktigste fordelene med LFQ inkluderer enkelhet, lave analysekostnader og reduserte prøveforberedelsestrinn som kan minimere prøvetap. Ulempene med LFQ inkluderer imidlertid økte instrumenttidskostnader, da det krever flere tekniske replikeringer for å løse kvantitativ feil fra kjøre-til-løp-variasjon. Dette fører også til redusert evne til å kvantifisere små variasjoner nøyaktig. Etikettbaserte metoder utsettes for mindre systematisk variasjon, da flere prøver kan merkes differensialt ved hjelp av en rekke stabile isotoper, kombinert i en prøve og analyseres gjennom massespektrometri samtidig. Dette øker også gjennomstrømningen, selv om isotopiske etiketter kan være tidkrevende og kostbare å syntetisere eller kjøpe. Full skanning masse spektra (MS1) spektral kompleksitet øker også som multipleksing øker, noe som reduserer antall unike nevropeptider i stand til å bli fragmentert og derfor identifisert. På den annen side øker isobarisk merking ikke spektral kompleksitet på MS1-nivå, selv om det introduserer utfordringer for lav overflod analytter som nevropeptider. Ettersom isobarisk kvantitet utføres på fragmentionmassespektranivå (MS2), kan det hende at lav overflod av nevropeptider ikke kan kvantifiseres, da mer rikelige matrisekomponenter kan velges for fragmentering, og de utvalgte har kanskje ikke høy nok overflod til å bli kvantifisert. Med isotopisk merking kan kvantasjon utføres på hvert identifisert peptid.
I tillegg til identifisering og kvantifisering kan lokaliseringsinformasjon innhentes av MS gjennom MALDI-MS imaging (MALDI-MSI)10. Ved å rastrere en laser over en prøveoverflate, kan MS-spektra kompileres til et varmekartbilde for hver m/z-verdi . Kartlegging av forbigående nevropeptidsignalintensitet i forskjellige regioner på tvers av forhold kan gi verdifull informasjon for funksjonsbestemmelse11. Lokalisering av nevropeptider er spesielt viktig fordi nevropeptidfunksjonen kan variere avhengig av sted12.
Neuropeptider finnes i lavere overflod in vivo enn andre signalmolekyler, som nevrotransmittere, og krever dermed sensitive metoder for deteksjon13. Dette kan oppnås ved fjerning av høyere overflod matrisekomponenter, for eksempel lipider11,14. Ytterligere hensyn for analyse av nevropeptider må tas sammenlignet med vanlige proteomiske arbeidsflyter, hovedsakelig fordi de fleste nevropepdoniske analyser utelater enzymatisk fordøyelse. Dette begrenser programvarealternativer for nevropeptiddataanalyse ettersom de fleste ble bygget med algoritmer basert på proteomikkdata og proteinmatslag informert av peptiddeteksjon. Imidlertid er mange programvare som PEAKS15 mer egnet til nevropeptidanalyse på grunn av deres de novo-sekvenseringsevner. Flere faktorer må vurderes for analyse av nevropeptider som starter fra utvinningsmetode til MS-dataanalyse.
Protokollene som er beskrevet her inkluderer metoder for prøvepreparering og dimetyl isotopisk merking, datainnsamling og dataanalyse av nevropeptider av LC-ESI-MS, MALDI-MS og MALDI-MSI. Gjennom representative resultater fra flere eksperimenter demonstreres verktøyet og evnen til disse metodene for å identifisere, kvantifisere og lokalisere nevropeptider fra blå krabber, Callinectes sapidus. For bedre å forstå nervesystemet, brukes modellsystemer ofte. Mange organismer har ikke et fullt sekvensert genom tilgjengelig, noe som forhindrer omfattende nevropeptidoppdagelse på peptidnivå. For å dempe denne utfordringen er en protokoll for å identifisere nye nevropeptider og transkripsjonsgruvedrift for å generere databaser for organismer uten fullstendig genominformasjon inkludert. Alle protokoller som presenteres her kan optimaliseres for nevropeptidprøver fra alle arter, samt brukes til analyse av eventuelle endogene peptider.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nøyaktig identifisering, kvantifisering og lokalisering av nevropeptider og endogene peptider som finnes i nervesystemet er avgjørende for å forstå deres funksjon23,24. Massespektrometri er en kraftig teknikk som kan tillate alt dette å bli oppnådd, selv i organismer uten et fullt sekvensert genom. Denne protokollens evne til å oppdage, kvantifisere og lokalisere nevropeptider fra vev samlet inn fra C. sapidus gjennom en kombinasjon av LC-ESI- og …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskningen ble støttet av National Science Foundation (CHE-1710140 og CHE-2108223) og National Institutes of Health (NIH) gjennom grant R01DK071801. A.P. ble delvis støttet av NIH Chemistry-Biology Interface Training Grant (T32 GM008505). N.V.Q. ble delvis støttet av National Institutes of Health, under Ruth L. Kirschstein National Research Service Award fra National Heart Lung and Blood Institute til University of Wisconsin-Madison Cardiovascular Research Center (T32 HL007936). L.L. ønsker å anerkjenne NIH-tilskudd R56 MH110215, S10RR029531 og S10OD025084, samt støtte fra et Vilas Distinguished Achievement Professorship og Charles Melbourne Johnson Professorship med finansiering fra Wisconsin Alumni Research Foundation og University of Wisconsin-Madison School of Pharmacy.
Materials
| Chemicals, Reagents, and Consumables | |||
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix | Supelco | 39319 | |
| Acetic acid | Fisher Chemical | A38S-500 | |
| Acetonitrile Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | A955-500 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| Borane pyridine | Sigma-Aldrich | 179752 | |
| Bruker peptide calibration mix | Bruker Daltonics | NC9846988 | |
| Capillary | Polymicro | 1068150019 | to make nanoflow column (75 µm inner diameter x 360 µm outer diameter) |
| Cryostat cup | Sigma-Aldrich | E6032 | any cup or mold should work |
| Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30108434 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| Formaldehyde – D2 | Sigma-Aldrich | 492620 | |
| Formic acid Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | A117-50 | |
| Gelatin | Difco | 214340 | place in 37 °C water bath to melt |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Labs | 15553953 | |
| Indium tin oxide (ITO)-coated glass slides | Delta Technologies | CB-90IN-S107 | 25 mm x 75 mm x 0.8 mm (width x length x thickness) |
| LC-MS vials | Thermo | TFMSCERT5000-30LVW | |
| Methanol Optima LC/MS Grade | Fisher Chemical | A456-500 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | Hydrophobic film |
| pH-Indicator strips | Supelco | 109450 | |
| Red phosphorus clusters | Sigma-Aldrich | 343242 | |
| Reversed phase C18 material | Waters | 186002350 | manually packed into nanoflow column |
| Wite-out pen | BIC | 150810 | |
| ZipTip | Millipore | Z720070 | |
| Instruments and Tools | |||
| Automatic matrix sprayer system- M5 | HTX Technologies, LLC | ||
| Centrifuge – 5424 R | Eppendorf | 05-401-205 | |
| Cryostat- HM 550 | Thermo Fisher Scientific | 956564A | |
| Desiccant | Drierite | 2088701 | |
| Forceps | WPI | 501764 | |
| MALDI stainless steel target plate | Bruker Daltonics | 8280781 | |
| Pipet-Lite XLS | Rainin | 17014391 | 200 µL |
| Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBDK | |
| RapifleX MALDI-TOF/TOF | Bruker Daltonics | ||
| SpeedVac – SVC100 | Savant | SVC-100D | |
| Ultrasonic Cleaner | Bransonic | 2510R-MTH | for sonication |
| Ultrasonic homogenizer | Fisher Scientific | FB120110 | FB120 Sonic Dismembrator with CL-18 Probe |
| Vaccum pump- Alcatel 2008 A | Ideal Vacuum Products | P10976 | ultimate pressure = 1 x 10-4 Torr |
| Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| Water bath (37C) – Isotemp 110 | Fisher Scientific | 15-460-10 | |
| Data Analysis Software | |||
| Expasy | https://web.expasy.org/translate/ | ||
| FlexAnalysis | Bruker Daltonics | ||
| FlexControl | Bruker Daltonics | ||
| FlexImaging | Bruker Daltonics | ||
| PEAKS Studio | Bioinformatics Solutions, Inc. | ||
| SCiLS Lab | https://scils.de/ | ||
| SignalP 5.0 | https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0 | ||
| tBLASTn | http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_ PROGRAMS=tblastn&PAGE_ TYPE=BlastSearch&SHOW_ DEFAULTS=on&LINK_LOC =blasthome |
References
- Hökfelt, T., et al. Neuropeptides – an overview. Neuropharmacology. 39 (8), 1337-1356 (2000).
- Radhakrishnan, V., Henry, J. L. Electrophysiology of neuropeptides in the sensory spinal cord. Progress in Brain Research. 104, 175-195 (1995).
- Nässel, D. R., Ekström, P. Detection of neuropeptides by immunocytochemistry. Methods in Molecular Biology. 72, 71-101 (1997).
- Martins, J., et al. Activation of Neuropeptide Y Receptors Modulates Retinal Ganglion Cell Physiology and Exerts Neuroprotective Actions In Vitro. ASN Neuro. 7 (4), 1759091415598292 (2015).
- Racaityte, K., Lutz, E. S. M., Unger, K. K., Lubda, D., Boos, K. S. Analysis of neuropeptide Y and its metabolites by high-performance liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry and integrated sample clean-up with a novel restricted-access sulphonic acid cation exchanger. Journal of Chromatography. A. 890 (1), 135-144 (2000).
- Salisbury, J. P., et al. A rapid MALDI-TOF mass spectrometry workflow for Drosophila melanogaster differential neuropeptidomics. Molecular Brain. 6, 60 (2013).
- Schmerberg, C. M., Li, L. Function-driven discovery of neuropeptides with mass spectrometry-based tools. Protein and Peptide Letters. 20 (6), 681-694 (2013).
- Lee, J. E. Neuropeptidomics: Mass Spectrometry-Based Identification and Quantitation of Neuropeptides. Genomics & Informatics. 14 (1), 12-19 (2016).
- Sauer, C. S., Phetsanthad, A., Riusech, O. L., Li, L. Developing mass spectrometry for the quantitative analysis of neuropeptides. Expert Review of Proteomics. 18 (7), 607-621 (2021).
- Pratavieira, M., et al. MALDI Imaging Analysis of Neuropeptides in Africanized Honeybee ( Apis mellifera) Brain: Effect of Aggressiveness. Journal of Proteome Research. 17 (7), 2358-2369 (2018).
- Buchberger, A. R., Vu, N. Q., Johnson, J., DeLaney, K., Li, L. A Simple and Effective Sample Preparation Strategy for MALDI-MS Imaging of Neuropeptide Changes in the Crustacean Brain Due to Hypoxia and Hypercapnia Stress. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (5), 1058-1065 (2020).
- Vu, N. Q., DeLaney, K., Li, L. Neuropeptidomics: Improvements in Mass Spectrometry Imaging Analysis and Recent Advancements. Current Protein & Peptide Science. 22 (2), 158-169 (2021).
- Li, L., Sweedler, J. V. Peptides in the brain: mass spectrometry-based measurement approaches and challenges. Annual Review of Analytical Chemistry (Palo Alto, Calif). 1, 451-483 (2008).
- Li, N., et al. Sequential Precipitation and Delipidation Enables Efficient Enrichment of Low-Molecular Weight Proteins and Peptides from Human Plasma. Journal of Proteome Research. 19 (8), 3340-3351 (2020).
- Zhang, J., et al. PEAKS DB: de novo sequencing assisted database search for sensitive and accurate peptide identification. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 11 (4), (2012).
- Sturm, R. M., Greer, T., Woodards, N., Gemperline, E., Li, L. Mass spectrometric evaluation of neuropeptidomic profiles upon heat stabilization treatment of neuroendocrine tissues in crustaceans. Journal of Proteome Research. 12 (2), 743-752 (2013).
- Gutierrez, G. J., Grashow, R. G. Cancer borealis stomatogastric nervous system dissection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (25), e1207 (2009).
- DeLaney, K., et al. PRESnovo: Prescreening Prior to de novo Sequencing to Improve Accuracy and Sensitivity of Neuropeptide Identification. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (7), 1358-1371 (2020).
- Oleisky, E. R., Stanhope, M. E., Hull, J. J., Christie, A. E., Dickinson, P. S. Differential neuropeptide modulation of premotor and motor neurons in the lobster cardiac ganglion. Journal of Neurophysiology. 124 (4), 1241-1256 (2020).
- Ma, M., et al. Combining in silico transcriptome mining and biological mass spectrometry for neuropeptide discovery in the Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei. Peptides. 31 (1), 27-43 (2010).
- Christie, A. E., Stemmler, E. A., Dickinson, P. S. Crustacean neuropeptides. Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 67 (24), 4135-4169 (2010).
- DeLaney, K., et al. New techniques, applications and perspectives in neuropeptide research. The Journal of Experimental Biology. 221, (2018).
- Habenstein, J., et al. Transcriptomic, peptidomic, and mass spectrometry imaging analysis of the brain in the ant Cataglyphis nodus. Journal of Neurochemistry. 158 (2), 391-412 (2021).
- Maes, K., et al. Improved sensitivity of the nano ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric analysis of low-concentrated neuropeptides by reducing aspecific adsorption and optimizing the injection solvent. Journal of Chromatography. A. 1360, 217-228 (2014).
- Li, G., et al. Nanosecond photochemically promoted click chemistry for enhanced neuropeptide visualization and rapid protein labeling. Nature Communications. 10 (1), 4697 (2019).
- Corbière, A., et al. Strategies for the Identification of Bioactive Neuropeptides in Vertebrates. Frontiers in Neuroscience. 13, 948 (2019).
- Chen, R., Ma, M., Hui, L., Zhang, J., Li, L. Measurement of neuropeptides in crustacean hemolymph via MALDI mass spectrometry. Journal of American Society for Mass Spectrometry. 20 (4), 708-718 (2009).
- Fridjonsdottir, E., Nilsson, A., Wadensten, H., Andrén, P. E. Brain Tissue Sample Stabilization and Extraction Strategies for Neuropeptidomics. Peptidomics: Methods and Strategies. , 41-49 (2018).
- Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. Mass Spectrometry Imaging: A Review of Emerging Advancements and Future Insights. Analytical Chemistry. 90 (1), 240-265 (2018).
- Phetsanthad, A., et al. Recent advances in mass spectrometry analysis of neuropeptides. Mass Spectrometry Reviews. , 21734 (2021).
- Pérez-Cova, M., Bedia, C., Stoll, D. R., Tauler, R., Jaumot, J. MSroi: A pre-processing tool for mass spectrometry-based studies. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 215, 104333 (2021).
- Christie, A. E., Chi, M. Prediction of the neuropeptidomes of members of the Astacidea (Crustacea, Decapoda) using publicly accessible transcriptome shotgun assembly (TSA) sequence data. General and Comparative Endocrinology. 224, 38-60 (2015).
- Livnat, I., et al. A d-Amino Acid-Containing Neuropeptide Discovery Funnel. Analytical Chemistry. 88 (23), 11868-11876 (2016).
- Lehrer, R. I., Ganz, T. Defensins: endogenous antibiotic peptides from human leukocytes. Ciba Foundation Symposium. 171, 276-290 (1992).
