Encapsulation rapide du cytosquelette reconstitué à l’intérieur de vésicules unilamellaires géantes
Summary
Cet article présente une méthode simple pour la production rapide de vésicules unilamellaires géantes avec des protéines cytosquelettiques encapsulées. La méthode s’avère utile pour la reconstitution ascendante des structures cytosquelettiques dans le confinement et les interactions cytosquelette-membrane.
Abstract
Les vésicules unilamellaires géantes (GUV) sont fréquemment utilisées comme modèles de membranes biologiques et constituent donc un excellent outil pour étudier les processus cellulaires liés à la membrane in vitro. Ces dernières années, l’encapsulation dans les GUV s’est avérée être une approche utile pour les expériences de reconstitution en biologie cellulaire et dans des domaines connexes. Il imite mieux les conditions de confinement à l’intérieur des cellules vivantes, par opposition à la reconstitution biochimique conventionnelle. Les méthodes d’encapsulation à l’intérieur des GUV ne sont souvent pas faciles à mettre en œuvre, et les taux de réussite peuvent différer considérablement d’un laboratoire à l’autre. Une technique qui s’est avérée efficace pour encapsuler des systèmes protéiques plus complexes est appelée encapsulation croisée d’interface gouttelette continue (cDICE). Ici, une méthode basée sur cDICE est présentée pour encapsuler rapidement des protéines cytosquelettiques dans des GUV avec une efficacité d’encapsulation élevée. Dans cette méthode, tout d’abord, les gouttelettes lipido-monocouches sont générées en émulsionnant une solution protéique d’intérêt dans un mélange lipide/huile. Après avoir été ajoutées dans une chambre rotative imprimée en 3D, ces gouttelettes monocouches lipidiques passent ensuite à travers une deuxième monocouche lipidique à une interface eau/huile à l’intérieur de la chambre pour former des GUV qui contiennent le système protéique. Cette méthode simplifie la procédure globale d’encapsulation dans les GUV et accélère le processus, et nous permet ainsi de confiner et d’observer l’évolution dynamique de l’assemblage du réseau à l’intérieur des vésicules bicouches lipidiques. Cette plate-forme est pratique pour étudier la mécanique des interactions cytosquelette-membrane en confinement.
Introduction
Les compartiments bicouches lipidiques sont utilisés comme modèles de cellules synthétiques pour l’étude des réactions organiques fermées et des processus membranaires ou comme modules porteurs dans les applications d’administrationde médicaments 1,2. La biologie ascendante avec des composants purifiés nécessite un minimum de systèmes expérimentaux pour explorer les propriétés et les interactions entre les biomolécules, telles que les protéines et les lipides 3,4. Cependant, avec les progrès du domaine, il y a un besoin accru de systèmes expérimentaux plus complexes qui imitent mieux les conditions dans les cellules biologiques. L’encapsulation dans les GUV est une approche pratique qui peut offrir certaines de ces propriétés cellulaires en fournissant une bicouche lipidique déformable et sélectivement perméable et un espace de réaction confiné. En particulier, la reconstitution in vitro de systèmes cytosquelettiques, en tant que modèles de cellules synthétiques, peut bénéficier de l’encapsulation dans les compartiments membranaires5. De nombreuses protéines du cytosquelette se lient et interagissent avec la membrane cellulaire. Comme la plupart des assemblages cytosquelettiques forment des structures qui couvrent l’ensemble de la cellule, leur forme est naturellement déterminée par le confinement de la tailled’une cellule 6.
Différentes méthodes sont utilisées pour générer des GUV, telles que le gonflement 7,8, la fusion de petites vésicules 9,10, le transfert d’émulsion 11,12, le jet pulsé13 et d’autres approches microfluidiques14,15. Bien que ces méthodes soient encore utilisées, chacune a ses limites. Ainsi, une approche robuste et simple avec un rendement élevé d’encapsulation GUV est hautement souhaitable. Bien que des techniques telles que le gonflement spontané et l’électrosuit soient largement adoptées pour la formation de GUV, ces méthodes sont principalement compatibles avec des compositions lipidiques spécifiques16, des tampons à faible concentration de sel17, une taille moléculaire encapsulanteplus petite 18 et nécessitent un volume élevé d’encapsulant. La fusion de plusieurs petites vésicules dans un GUV est intrinsèquement énergétiquement défavorable, nécessitant ainsi une spécificité dans les compositions lipidiques chargées9 et / ou les agents externes induisant la fusion, tels que les peptides19 ou d’autres produits chimiques. Le transfert d’émulsion et les méthodes microfluidiques, d’autre part, peuvent nécessiter une stabilisation des gouttelettes par l’élimination des tensioactifs et des solvants après la formation de bicouches, respectivement18,20. La complexité de la configuration expérimentale et du dispositif dans les techniques microfluidiques telles que le jet pulsé impose un défi supplémentaire21. cDICE est une méthode basée sur l’émulsion dérivée de principes similaires régissant le transfert d’émulsion22,23. Une solution aqueuse (solution externe) et un mélange lipid-huile sont stratifiés par forces centrifuges dans une chambre cylindrique rotative (chambre cDICE) formant une interface saturée de lipides. La navette de gouttelettes aqueuses monocouches lipidiques dans la chambre cDICE rotative entraîne la fermeture éclair d’une bicouche lorsque les gouttelettes traversent l’interface saturée de lipides dans la solution aqueuse externe22,24. L’approche cDICE est une technique robuste pour l’encapsulation GUV. Avec la méthode modifiée présentée, non seulement le rendement élevé des vésicules typique de la cDICE avec un temps d’encapsulation significativement plus court (quelques secondes) est atteint, mais le temps de génération de GUV qui permet l’observation des processus dépendant du temps (par exemple, la formation d’un réseau cytosquelettique d’actine) est considérablement réduit. Le protocole prend environ 15-20 minutes du début à la collecte et à l’imagerie GUV. Ici, la génération de GUV est décrite à l’aide de la méthode cDICE modifiée pour encapsuler l’actine et les protéines de liaison à l’actine (ABP). Cependant, la technique présentée est applicable pour encapsuler un large éventail de réactions biologiques et d’interactions membranaires, de l’assemblage de biopolymères à l’expression de protéines sans cellules en passant par le transfert de cargaison basé sur la fusion membranaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
Différentes méthodes de génération de GUV ont été explorées pour la création de cellules synthétiques Cependant, la complexité des procédures, le temps prolongé pour atteindre l’encapsulation, la restriction des types de lipides et de la composition moléculaire de l’encapsulant, le besoin de produits chimiques non physiologiques pour faciliter l’encapsulation, le faible rendement en GUV et les incohérences dans l’efficacité de l’encapsulation ont continué à défier les chercheurs dans ce domain…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
APL reconnaît le soutien d’une bourse de recherche Humboldt pour chercheurs expérimentés et de la National Science Foundation (1939310 et 1817909) et des National Institutes of Health (R01 EB030031).
Materials
| 18:1 Liss Rhod PE lipid in chloroform | Avanti Polar Lipids | 810150C | |
| 96 Well Optical Btm Pit PolymerBase | ThermoFisher Scientific | 165305 | |
| Actin from rabbit skeletal muscle | Cytoskeleton | AKL99-A | |
| ATTO 488-actin from rabbit skeletal muscle | Hypermol | 8153-01 | |
| Axygen microtubes (200 µL) | Fisher Scientific | 14-222-262 | for handling ABPs |
| Black resin | Formlabs | RS-F2-GPBK-04 | |
| Cholesterol (powder) | Avanti Polar Lipids | 700100P | |
| Choloroform | Sigma Aldrich | 67-66-3 | |
| Clear resin | Formlabs | RS-F2-GPCL-04 | |
| CSU-X1 Confocal Scanner Unit | YOKOGAWA | CSU-X1 | |
| Density gradient medium (Optiprep) | Sigma-Aldrich | D1556 | |
| DOPC lipid in chloroform | Avanti Polar Lipids | 850375C | |
| Fascin | homemade | N/A | |
| F-buffer | homemade | N/A | |
| Fisherbrand microtubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| FS02 Sonicator | Fischer Scientific | FS20 | |
| G-buffer | homemade | N/A | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 158968 | |
| iXon X3 camera | Andor | DU-897E-CS0 | |
| Mineral oil | Acros Organics | 8042-47-5 | |
| Olympus IX81 Inverted Microscope | Olympus | IX21 | |
| Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective | Olumpus | 1-U2B933 | |
| Silicone oil | Sigma-Aldrich | 317667 |
References
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