Kwantitatieve fractioneringstechniek voor microtubuli om stabiele microtubuli, labiele microtubuli en vrije tubuline in muizenweefsels te scheiden

Summary

Microtubuli, die tubulinepolymeren zijn, spelen een cruciale rol als onderdeel van het cytoskelet in eukaryote cellen en staan bekend om hun dynamische instabiliteit. Deze studie ontwikkelde een methode voor het fractioneren van microtubuli om ze te scheiden in stabiele microtubuli, labiele microtubuli en vrije tubuline om de stabiliteit van microtubuli in verschillende muizenweefsels te evalueren.

Abstract

Microtubuli, samengesteld uit α/β-tubulinedimeren, zijn een cruciaal onderdeel van het cytoskelet in eukaryote cellen. Deze buisachtige polymeren vertonen dynamische instabiliteit als tubuline-heterodimeersubeenheden repetitieve polymerisatie en depolymerisatie ondergaan. Nauwkeurige controle van de stabiliteit en dynamiek van microtubuli, bereikt door posttranslationele modificaties van tubuline en microtubuli-geassocieerde eiwitten, is essentieel voor verschillende cellulaire functies. Disfuncties in microtubuli zijn sterk betrokken bij de pathogenese, waaronder neurodegeneratieve aandoeningen. Lopend onderzoek richt zich op microtubuli-gerichte therapeutische middelen die de stabiliteit moduleren en mogelijke behandelingsopties bieden voor deze ziekten en kankers. Daarom is het begrijpen van de dynamische toestand van microtubuli cruciaal voor het beoordelen van ziekteprogressie en therapeutische effecten.

Traditioneel wordt de dynamiek van microtubuli in vitro of in gekweekte cellen beoordeeld door middel van ruwe fractionering of immunoassay, met behulp van antilichamen die gericht zijn op posttranslationele modificaties van tubuline. Het nauwkeurig analyseren van de tubulinestatus in weefsels met behulp van dergelijke procedures brengt echter uitdagingen met zich mee. In deze studie ontwikkelden we een eenvoudige en innovatieve fractioneringsmethode voor microtubuli om stabiele microtubuli, labiele microtubuli en vrije tubuline in muizenweefsels te scheiden.

De procedure omvatte het homogeniseren van ontlede muizenweefsels in een microtubuli-stabiliserende buffer met een volumeverhouding van 19:1. De homogenaten werden vervolgens gefractioneerd door middel van een ultracentrifugatieproces in twee stappen na de eerste langzame centrifugatie (2.400 × g) om vuil te verwijderen. De eerste ultracentrifugatiestap (100.000 × g) precipiteerde stabiele microtubuli, terwijl het resulterende supernatans werd onderworpen aan een tweede ultracentrifugatiestap (500.000 × g) om labiele microtubuli en oplosbare tubulinedimeren te fractioneren. Deze methode bepaalde de verhoudingen van tubuline die stabiele of labiele microtubuli in de muizenhersenen vormen. Bovendien werden duidelijke weefselvariaties in de stabiliteit van microtubuli waargenomen die correleerden met de proliferatieve capaciteit van samenstellende cellen. Deze bevindingen benadrukken het aanzienlijke potentieel van deze nieuwe methode voor het analyseren van de stabiliteit van microtubuli in fysiologische en pathologische omstandigheden.

Introduction

Microtubuli (MT’s) zijn langwerpige buisvormige structuren die bestaan uit protofilamenten die bestaan uit α/β-tubuline heterodimeersubeenheden. Ze spelen een essentiële rol in verschillende cellulaire processen, zoals celdeling, beweeglijkheid, vormbehoud en intracellulair transport, waardoor ze integrale componenten zijn van het eukaryote cytoskelet¹. Het min-uiteinde van MT’s, waar de α-tubuline-subeenheid wordt blootgesteld, is relatief stabiel, terwijl het plus-uiteinde, waar de β-tubuline-subeenheid wordt blootgesteld, dynamische depolymerisatie en polymerisatie ondergaat². Deze continue cyclus van tubulinedimeeradditie en dissociatie aan het plus-uiteinde, aangeduid als dynamische instabiliteit, resulteert in een repetitief proces van redding en catastrofe³. MT’s vertonen focale domeinen met gelokaliseerde variaties in dynamische instabiliteit, waaronder stabiele en labiele domeinen⁴.

Nauwkeurige controle van de dynamische instabiliteit van MT’s is cruciaal voor tal van cellulaire functies, met name in neuronen die worden gekenmerkt door ingewikkelde morfologieën. Het aanpassingsvermogen en de duurzaamheid van MT’s spelen een cruciale rol bij de ontwikkeling en het goed functioneren van zenuwcellen ^5,6,7. De dynamische instabiliteit van MT’s blijkt geassocieerd te zijn met verschillende posttranslationele modificaties (PTM’s) van tubuline, zoals acetylering, fosforylering, palmitoylering, detyrosinatie, delta 2, polyglutamine-oxidatie en polyglycylering. Bovendien dient de binding van microtubuli-geassocieerde eiwitten (MAP’s) als een regulerend mechanisme⁸. PTM’s, met uitzondering van acetylering, komen voornamelijk voor in het tubuline-carboxy-terminale gebied dat zich aan de buitenkant van MT’s bevindt. Deze modificaties creëren verschillende oppervlaktecondities op MT’s, beïnvloeden hun interactie met MAP’s en bepalen uiteindelijk de stabiliteit van MT’s⁹. De aanwezigheid van een carboxy-terminaal tyrosineresidu in α-tubuline is een indicatie van dynamische MT’s, die snel worden vervangen door de vrije tubulinepool. Omgekeerd duiden detyrosinatie van het carboxy-eindpunt en acetylering van Lys40 op stabiele MT’s met verminderde dynamische instabiliteit ^9,10.

De PTM’s van tubuline zijn uitgebreid gebruikt in experimenten om de dynamiek en stabiliteit van MT’s 5,7,11,12,13,14,15 te beoordelen. In celkweekstudies kunnen tubulines bijvoorbeeld worden gescheiden in twee pools: de vrije tubulinepool en de MT-pool. Dit wordt bereikt door vrije tubuline vrij te geven door celpermeabilisatie voordat de resterende MT’s 15,16,17,18,19 worden gefixeerd. Biochemische methoden omvatten het gebruik van chemische MT-stabilisatoren die MT’s beschermen tegen catastrofe, waardoor de scheiding van MT’s en vrije tubuline mogelijk wordt door middel van centrifugatie^20,21,22. Deze procedures maken echter geen onderscheid tussen stabiele en minder stabiele (labiele) MT’s, waardoor het onmogelijk wordt om MT’s of oplosbare tubuline in weefsels zoals de hersenen te kwantificeren. Bijgevolg is het evalueren van MT-stabiliteit in organismen onder fysiologische en pathologische omstandigheden een uitdaging gebleken. Om deze experimentele beperking aan te pakken, hebben we een nieuwe techniek ontwikkeld voor het nauwkeurig scheiden van MT’s en vrije tubuline in muizenweefsel²³.

Deze unieke MT-fractioneringsmethode omvat weefselhomogenisatie onder omstandigheden die de tubulinestatus in weefsels behouden en centrifugatie in twee stappen om stabiele MT’s, labiele MT’s en vrije tubuline te scheiden. Deze eenvoudige procedure kan worden toegepast op brede studies, waaronder fundamenteel onderzoek naar MT’s en MAP’s in levende organismen, fysiologische en pathologische analyses van gezondheid en ziekten die verband houden met MT-stabiliteit, en het ontwikkelen van geneesmiddelen en andere therapieën die gericht zijn op MT’s.

Protocol

1. MT-fractioneringsmethode OPMERKING: Alle experimenten die in deze studie zijn uitgevoerd, zijn goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van de Doshisha University. C57BL/6J muizen van beide geslachten, 3-4 maanden oud, werden hier gebruikt. In dit protocol werden ontlede weefsels, bijvoorbeeld hersenen, lever of thymus, onmiddellijk gehomogeniseerd in ijskoude microtubuli-stabiliserende buffer (MSB), die Taxol (MT-stabilisator) bevatte in een concentratie die niet alleen d…

Representative Results

Kwantificering van tubuline in de P2-, P3- en S3-fracties uit muizenhersenen door de MT-fractioneringsmethodeTubuline in muizenweefsel werd gescheiden in de P2-, P3- en S3-fracties door de MT-fractioneringsmethode en gekwantificeerd door Western blotting (Figuur 1A). Het neerslag van MT’s dat gedurende 20 minuten in de P2-fractie bleef door ultracentrifugatie bij 100.000 × g was goed voor 34,86% ± 1,68% van de totale tubuline in een muizenbrein. Het supernatan…

Discussion

De belangrijkste taak bij het onderzoeken van de status van tubuline in weefsel van levende organismen is het voorkomen van accidentele MT-polymerisatie of depolymerisatie tijdens de bereiding. De stabiliteit van MT’s in monsters wordt beïnvloed door factoren zoals de concentratie van Taxol in MSB, de verhouding tussen de hoeveelheid weefsel en de buffer en de temperatuur tijdens het proces van weefselverwijdering tot homogenisatie en centrifugatie. Daarom werden de omstandigheden in elke stap van het protocol geoptimal…

Materials

1.5 ML TUBE CASE OF 500	Beckman Coulter	357448
1A2	Sigma-Aldrich	T9028	1:5,000 dilution
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)	Nacalai Tesque	02442-44
300 kDa ultrafiltration spin column	Aproscience	PT-1013
6-11B1	Sigma-Aldrich	T7451	1:5,000 dilution
AKTA prime plus	Cytiva
anti-mouse IgG	Jackson ImmunoResearch	115-035-146	1:5,000 dilution
antipain	Peptide Institute Inc.	4062
aprotinin	Nacalai Tesque	03346-84
Chemi-Lumi One L	Nacalai Tesque	07880-54
Corning bottle-top vacuum filter system	Corning	430758	0.22µm 33.2cm² Nitrocellulose membrane
DIFP	Sigma-Aldrich	55-91-4
DIGITAL HOMOGENIZER		AS ONE	HOM
DM1A	Sigma-Aldrich	T9026	1:5,000 dilution
DTT	Nacalai Tesque	14128-46
EGTA	Nacalai Tesque	37346-05
FluoroTrans W 3.3 Meter Roll	Pall Corporation	BSP0161
glycerol	Nacalai Tesque	17018-25
GTP		Nacalai Tesque	17450-61
HIGH SPEED REFRIGERATIOED MICRO CENTRIFUGE Kitman		TOMY
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg column	Cytiva	28-9893-35
Image Gauge Software	FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation
ImmunoStar LD	FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation	292-69903
KMX-1	Millipore	MAB3408	1:5,000 dilution
LAS-4000 luminescent image analyzer	FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation
leupeptin	Peptide Institute Inc.	43449-62
MgSO4	Nacalai Tesque	21003-75
Na3VO4	Nacalai Tesque	32013-92
NaF	Nacalai Tesque	31420-82
okadaic acid	LC Laboratories	O-2220
OPTIMA MAX-XP	Beckman Coulter	393315
pepstatin	Nacalai Tesque	26436-52
PMSF	Nacalai Tesque	27327-81
Polycarbonate Centrifuge Tubes for TLA120.2	Beckman Coulter	343778
Protease inhibitor cocktail (cOmplete, EDTA-free)		Roche	5056489001
Purified tubulin	Cytoskeleton	T240
QSONICA Q55	QSonica	Q55
Taxol		LC Laboratories	P-9600
TLA-120.2 rotor	Beckman Coulter	357656
TLA-55 rotor	Beckman Coulter	366725
TLCK	Nacalai Tesque	34219-94
Triton X-100	Nacalai Tesque	12967-45
β-glycerophosphate	Sigma-Aldrich	G9422