טכניקת שבירת מיקרוטובולים כמותית להפרדת מיקרוטובולים יציבים, מיקרוטובולים לאביליים וטובולין חופשי ברקמות עכבר
Summary
מיקרוטובולים, שהם פולימרי טובולין, ממלאים תפקיד מכריע כמרכיב שלד ציטוקריוטי בתאים אאוקריוטים וידועים בחוסר היציבות הדינמי שלהם. מחקר זה פיתח שיטה להפרדת מיקרוטובולים כדי להפריד אותם למיקרוטובולים יציבים, מיקרוטובולים שפתיים וטובולין חופשי כדי להעריך את יציבותם של מיקרוטובולים ברקמות עכבר שונות.
Abstract
מיקרוטובולים, המורכבים מדימרים α/β-טובולין, הם מרכיב חיוני של שלד הציטו-שלד בתאים איקריוטים. פולימרים דמויי צינור אלה מפגינים חוסר יציבות דינמית כאשר תת-יחידות הטרודימר טובולין עוברות פילמור חוזר ונשנה ודה-פולימריזציה. בקרה מדויקת של יציבות ודינמיקה של מיקרוטובולים, המושגת באמצעות שינויים לאחר תרגום טובולין וחלבונים הקשורים למיקרוטובול, חיונית לתפקודים תאיים שונים. תפקוד לקוי במיקרוטובולים מעורב מאוד בפתוגנזה, כולל הפרעות נוירודגנרטיביות. המחקר המתמשך מתמקד בחומרים טיפוליים ממוקדי מיקרוטובולים המווסתים את היציבות, ומציעים אפשרויות טיפול פוטנציאליות למחלות וסוגי סרטן אלה. כתוצאה מכך, הבנת המצב הדינמי של מיקרוטובולים חיונית להערכת התקדמות המחלה וההשפעות הטיפוליות.
באופן מסורתי, דינמיקה של מיקרוטובולים הוערכה במבחנה או בתאים בתרבית באמצעות שבירה גסה או אימונואסיה, תוך שימוש בנוגדנים המכוונים לשינויים שלאחר תרגום של טובולין. עם זאת, ניתוח מדויק של מצב טובולין ברקמות באמצעות הליכים כאלה מציב אתגרים. במחקר זה פיתחנו שיטה פשוטה וחדשנית להפרדת מיקרוטובולים יציבים, מיקרוטובולים לאביליים וטובולין חופשי ברקמות עכבר.
ההליך כלל הומוגניזציה של רקמות עכבר מנותחות במאגר מייצב מיקרוטובול ביחס נפח של 19:1. לאחר מכן חולקו ההומוגנטים בתהליך אולטרה-צנטריפוגה דו-שלבי לאחר צנטריפוגה איטית ראשונית (2,400 × גרם) כדי לפנות פסולת. שלב האולטרה-צנטריפוגה הראשון (100,000 × גרם) זירז מיקרוטובולים יציבים, בעוד שהסופרנאטנט שהתקבל היה נתון לשלב אולטרה-צנטריפוגה שני (500,000 × גרם) לשבר מיקרוטובולים לאביליים ודימרים מסיסים. שיטה זו קבעה את הפרופורציות של טובולין המהווה microtubules יציב או labile במוח העכבר. בנוסף, נצפו שינויים ברורים ברקמה ביציבות המיקרוטובולים שהיו בקורלציה עם יכולת ההתרבות של התאים המרכיבים. ממצאים אלה מדגישים את הפוטנציאל המשמעותי של שיטה חדשנית זו לניתוח יציבות מיקרוטובולים במצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים.
Introduction
מיקרוטובולים (MTs) הם מבנים צינוריים מוארכים הכוללים פרוטופילמנטים המורכבים מתת-יחידות הטרודימר α/β-טובולין. הם ממלאים תפקידים חיוניים בתהליכים תאיים שונים כגון חלוקת תאים, תנועתיות, תחזוקת צורה והובלה תוך-תאית, מה שהופך אותם למרכיבים אינטגרליים של שלד התא האיקריוטי1. הקצה המינוס של MTs, שבו תת-היחידה α-טובולין נחשפת, יציב יחסית, ואילו ה-plus-end, שבו תת-היחידה β-טובולין נחשפת, עובר דה-פולימריזציה דינמית ופילמור2. מחזור מתמשך זה של חיבור דימר טובולין ודיסוציאציה בקצה הפלוס, המכונה חוסר יציבות דינמי, גורם לתהליך חוזר ונשנה של הצלה וקטסטרופה3. MTs מציגים תחומי מוקד עם וריאציות מקומיות באי יציבות דינמית, כולל תחומים יציבים ושפתיים4.
בקרה מדויקת של חוסר היציבות הדינמית של MTs חיונית לתפקודים תאיים רבים, במיוחד בתאי עצב המאופיינים במורפולוגיות מורכבות. יכולת ההסתגלות והעמידות של MTs ממלאים תפקיד חיוני בהתפתחות ובתפקוד תקין של תאי עצב 5,6,7. חוסר היציבות הדינמי של MTs נמצא קשור לשינויים שונים לאחר תרגום (PTM) של טובולין, כגון אצטילציה, זרחון, פלמיטוילציה, דטרוזינציה, דלתא 2, חמצון פוליגלוטמין ופוליגליצילציה. בנוסף, קשירת חלבונים הקשורים למיקרוטובולים (MAPs) משמשת כמנגנון ויסות8. PTMs, למעט אצטילציה, מתרחשים בעיקר באזור מסוף קרבוקסי טובולין הממוקם על פני השטח החיצוניים של MTs. שינויים אלה יוצרים תנאי שטח מגוונים ב- MTs, משפיעים על האינטראקציה שלהם עם MAPs ובסופו של דבר שולטים ביציבות MT9. נוכחותם של שאריות טירוזין מסוף קרבוקסי ב-α-טובולין מעידה על MTs דינמיים, המוחלפים במהירות על ידי בריכת טובולין חופשית. לעומת זאת, דה-טירוזינציה של מסוף הקרבוקסי ואצטילציה של Lys40 מסמנים MTs יציבים עם פחות יציבות דינמית 9,10.
PTMs של טובולין שימשו באופן נרחב בניסויים כדי להעריך את הדינמיקה והיציבות של MTs 5,7,11,12,13,14,15. לדוגמה, במחקרי תרביות תאים, ניתן להפריד טובולינים לשתי בריכות: בריכת טובולין חופשית ובריכת MT. זה מושג על ידי שחרור טובולין חופשי דרך חדירת תאים לפני תיקון MTs 15,16,17,18,19 הנותרים. שיטות ביוכימיות כוללות שימוש במייצבי MT כימיים המגינים על MTs מפני אסון, ומאפשרים הפרדה של MTs וטובולין חופשי באמצעות צנטריפוגה20,21,22. עם זאת, הליכים אלה אינם מבדילים בין MTs יציבים ופחות יציבים (labile), ובכך הופכים את זה לבלתי אפשרי לכמת MTs או טובולין מסיס ברקמות כמו המוח. כתוצאה מכך, הערכת יציבות MT באורגניזמים בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים הוכחה כמאתגרת. כדי להתמודד עם מגבלה ניסיונית זו, פיתחנו טכניקה חדשנית להפרדה מדויקת של MTs וטובולין חופשי ברקמת עכבר23.
שיטת שבירת MT ייחודית זו כוללת הומוגניזציה של רקמות בתנאים השומרים על מצב טובולין ברקמות וצנטריפוגה דו-שלבית להפרדת MTs יציבים, MTs labile וטובולין חופשי. הליך פשוט זה יכול להיות מיושם במחקרים רחבים, כולל מחקר בסיסי על MTs ו- MAPs באורגניזמים חיים, ניתוחים פיזיולוגיים ופתולוגיים של בריאות ומחלות הקשורות ליציבות MT, ופיתוח תרופות וטיפולים אחרים המכוונים ל- MTs.
Protocol
Representative Results
Discussion
המשימה המשמעותית ביותר בעת חקירת מצב טובולין ברקמה מאורגניזמים חיים היא מניעת פילמור MT בשוגג או דה-פולימריזציה במהלך ההכנה. יציבות MTs בדגימות מושפעת מגורמים כגון ריכוז טקסול ב- MSB, שיעור כמות הרקמה לחיץ, והטמפרטורה בתהליך מהסרת רקמות להומוגניזציה וצנטריפוגה. לכן, התנאים היו אופטימליים בכל…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי JST הקמת מלגות אוניברסיטאיות ליצירת חדשנות טכנולוגית מדעית (A.HT.; JPMJFS2145), JST אביב (A.HT.; JPMJSP2129), מענק סיוע לעמיתי JSPS (A.HT; 23KJ2078), מענק סיוע למחקר מדעי (B) JSPS KAKENHI (22H02946 עבור מדיטציה טרנסנדנטלית), מענק סיוע למחקר מדעי בתחומים חדשניים שכותרתו “הזדקנות חלבון המוח ובקרת דמנציה” מ-MEXT (TM; 26117004), ומלגת מחקר של Uehara מקרן הזיכרון של אואהארה (TM; 202020027). המחברים מצהירים כי אין אינטרסים כלכליים מתחרים.
Materials
| 1.5 ML TUBE CASE OF 500 | Beckman Coulter | 357448 | |
| 1A2 | Sigma-Aldrich | T9028 | 1:5,000 dilution |
| 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Nacalai Tesque | 02442-44 | |
| 300 kDa ultrafiltration spin column | Aproscience | PT-1013 | |
| 6-11B1 | Sigma-Aldrich | T7451 | 1:5,000 dilution |
| AKTA prime plus | Cytiva | ||
| anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | 1:5,000 dilution |
| antipain | Peptide Institute Inc. | 4062 | |
| aprotinin | Nacalai Tesque | 03346-84 | |
| Chemi-Lumi One L | Nacalai Tesque | 07880-54 | |
| Corning bottle-top vacuum filter system | Corning | 430758 | 0.22µm 33.2cm² Nitrocellulose membrane |
| DIFP | Sigma-Aldrich | 55-91-4 | |
| DIGITAL HOMOGENIZER | AS ONE | HOM | |
| DM1A | Sigma-Aldrich | T9026 | 1:5,000 dilution |
| DTT | Nacalai Tesque | 14128-46 | |
| EGTA | Nacalai Tesque | 37346-05 | |
| FluoroTrans W 3.3 Meter Roll | Pall Corporation | BSP0161 | |
| glycerol | Nacalai Tesque | 17018-25 | |
| GTP | Nacalai Tesque | 17450-61 | |
| HIGH SPEED REFRIGERATIOED MICRO CENTRIFUGE Kitman | TOMY | ||
| HiLoad 16/600 Superdex 200 pg column | Cytiva | 28-9893-35 | |
| Image Gauge Software | FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation | ||
| ImmunoStar LD | FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation | 292-69903 | |
| KMX-1 | Millipore | MAB3408 | 1:5,000 dilution |
| LAS-4000 luminescent image analyzer | FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation | ||
| leupeptin | Peptide Institute Inc. | 43449-62 | |
| MgSO4 | Nacalai Tesque | 21003-75 | |
| Na3VO4 | Nacalai Tesque | 32013-92 | |
| NaF | Nacalai Tesque | 31420-82 | |
| okadaic acid | LC Laboratories | O-2220 | |
| OPTIMA MAX-XP | Beckman Coulter | 393315 | |
| pepstatin | Nacalai Tesque | 26436-52 | |
| PMSF | Nacalai Tesque | 27327-81 | |
| Polycarbonate Centrifuge Tubes for TLA120.2 | Beckman Coulter | 343778 | |
| Protease inhibitor cocktail (cOmplete, EDTA-free) | Roche | 5056489001 | |
| Purified tubulin | Cytoskeleton | T240 | |
| QSONICA Q55 | QSonica | Q55 | |
| Taxol | LC Laboratories | P-9600 | |
| TLA-120.2 rotor | Beckman Coulter | 357656 | |
| TLA-55 rotor | Beckman Coulter | 366725 | |
| TLCK | Nacalai Tesque | 34219-94 | |
| Triton X-100 | Nacalai Tesque | 12967-45 | |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 |
References
- Janke, C., Magiera, M. M. The tubulin code and its role in controlling microtubule properties and functions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (6), 307-326 (2020).
- Conde, C., Caceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites. Nature Reviews Neuroscience. 10 (5), 319-332 (2009).
- Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).
- Baas, P. W., Rao, A. N., Matamoros, A. J., Leo, L. Stability properties of neuronal microtubules. Cytoskeleton (Hoboken). 73 (9), 442-460 (2016).
- Challacombe, J. F., Snow, D. M., Letourneau, P. C. Dynamic microtubule ends are required for growth cone turning to avoid an inhibitory guidance cue. Journal of Neuroscience. 17 (9), 3085-3095 (1997).
- Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. Building the neuronal microtubule cytoskeleton. Neuron. 87 (3), 492-506 (2015).
- Leo, L., et al. Vertebrate fidgetin restrains axonal growth by severing labile domains of microtubules. Cell Reports. 12 (11), 1723-1730 (2015).
- Janke, C. The tubulin code: molecular components, readout mechanisms, and functions. Journal of Cell Biology. 206 (4), 461-472 (2014).
- Wloga, D., Joachimiak, E., Fabczak, H. Tubulin post-translational modifications and microtubule dynamics. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), 2207 (2017).
- Baas, P. W., Black, M. M. Individual microtubules in the axon consist of domains that differ in both composition and stability. Journal of Cell Biology. 111 (2), 495-509 (1990).
- Cartelli, D., et al. Microtubule alterations occur early in experimental parkinsonism and the microtubule stabilizer epothilone D is neuroprotective. Scientific Reports. 3, 1837 (2013).
- Zhang, B., et al. Microtubule-binding drugs offset tau sequestration by stabilizing microtubules and reversing fast axonal transport deficits in a tauopathy model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (1), 227-231 (2005).
- Zhang, F., et al. Post-translational modifications of alpha-tubulin in Alzheimer disease. Translational Neurodegeneration. 4, 9 (2015).
- Miyasaka, T., et al. Curcumin improves tau-induced neuronal dysfunction of nematodes. Neurobiology of Aging. 39, 69-81 (2016).
- Fujiwara, H., et al. Inhibition of microtubule assembly competent tubulin synthesis leads to accumulation of phosphorylated tau in neuronal cell bodies. Biochemical and Biophysical Research Communications. 521 (3), 779-785 (2020).
- Vielkind, U., Swierenga, S. H. A simple fixation procedure for immunofluorescent detection of different cytoskeletal components within the same cell. Histochemistry. 91 (1), 81-88 (1989).
- Kanai, Y., et al. Expression of multiple tau isoforms and microtubule bundle formation in fibroblasts transfected with a single tau cDNA. Journal of Cell Biology. 109 (3), 1173-1184 (1989).
- Brown, A., Li, Y., Slaughter, T., Black, M. M. Composite microtubules of the axon: quantitative analysis of tyrosinated and acetylated tubulin along individual axonal microtubules. Journal of Cell Science. 104 (2), 339-352 (1993).
- Black, M. M., Slaughter, T., Moshiach, S., Obrocka, M., Fischer, I. Tau is enriched on dynamic microtubules in the distal region of growing axons. Journal of Neuroscience. 16 (11), 3601-3619 (1996).
- Caron, J. M., Jones, A. L., Kirschner, M. W. Autoregulation of tubulin synthesis in hepatocytes and fibroblasts. Journal of Cell Biology. 101 (5), 1763-1772 (1985).
- Merrick, S. E., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. Selective destruction of stable microtubules and axons by inhibitors of protein serine/threonine phosphatases in cultured human neurons. Journal of Neuroscience. 17 (15), 5726-5737 (1997).
- Miyasaka, T., Sato, S., Tatebayashi, Y., Takashima, A. Microtubule destruction induces tau liberation and its subsequent phosphorylation. FEBS Letters. 584 (14), 3227-3232 (2010).
- Hagita, A., et al. Quantitative fractionation of tissue microtubules with distinct biochemical properties reflecting their stability and lability. Biochemical and Biophysical Research Communications. 560, 186-191 (2021).
- Montecinos-Franjola, F., Chaturvedi, S. K., Schuck, P., Sackett, D. L. All tubulins are not alike: Heterodimer dissociation differs among different biological sources. Journal of Biological Chemistry. 294 (26), 10315-10324 (2019).
- Vallee, R. B. A taxol-dependent procedure for the isolation of microtubules and microtubule-associated proteins (MAPs). Journal of Cell Biology. 92 (2), 435-442 (1982).
- Bartolo, M. E., Carter, J. V. Effect of microtubule stabilization on the freezing tolerance of mesophyll cells of spinach. Plant Physiology. 97 (1), 182-187 (1991).
- Strang, K. H., Golde, T. E., Giasson, B. I. MAPT mutations, tauopathy, and mechanisms of neurodegeneration. Laboratory Investigation. 99 (7), 912-928 (2019).
- Fourel, G., Boscheron, C. Tubulin mutations in neurodevelopmental disorders as a tool to decipher microtubule function. FEBS Letters. 594 (21), 3409-3438 (2020).
- Terry, R. D., Gonatas, N. K., Weiss, M. Ultrastructural studies in Alzheimer’s presenile dementia. The American Journal of Pathology. 44 (2), 269-297 (1964).
- Yoshida, H., Ihara, Y. Tau in paired helical filaments is functionally distinct from fetal tau: assembly incompetence of paired helical filament-tau. Journal of Neurochemistry. 61 (3), 1183-1186 (1993).
- Cash, A. D., et al. Microtubule reduction in Alzheimer’s disease and aging is independent of tau filament formation. The American Journal of Pathology. 162 (5), 1623-1627 (2003).
- Hempen, B., Brion, J. P. Reduction of acetylated alpha-tubulin immunoreactivity in neurofibrillary tangle-bearing neurons in Alzheimer’s disease. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 55 (9), 964-972 (1996).
- Miyasaka, T., et al. Imbalanced expression of tau and tubulin induces neuronal dysfunction in C. elegans models of tauopathy. Frontiers in Neuroscience. 12, 415 (2018).
- Boiarska, Z., Passarella, D. Microtubule-targeting agents and neurodegeneration. Drug Discovery Today. 26 (2), 604-615 (2021).
