הדמיה סימולטנית של הדינמיקה של מיקרוטובולים מקושרים ובודדים במבחנה על ידי מיקרוסקופיה TIRF
Summary
כאן, בדיקת שחזור במבחנה מבוססת מיקרוסקופיה TIRF מוצגת כדי לכמת ולהשוות בו זמנית את הדינמיקה של שתי אוכלוסיות microtubule. שיטה מתוארת כדי להציג בו זמנית את הפעילות הקולקטיבית של חלבונים מרובים הקשורים microtubule הקשורים על חבילות microtubule מקושרים ו microtubules יחיד.
Abstract
Microtubules הם פולימרים של הטרודימרים αβ-tubulin המארגנים למבנים נפרדים בתאים. ארכיטקטורות ורשתות מבוססות Microtubule מכילות לעתים קרובות תת-קבוצות של מערכי מיקרוטובולים השונים במאפייניהם הדינמיים. לדוגמה, בתאים מתחלקים, חבילות יציבות של מיקרוטובולות מקושרות מתקיימות בסמיכות למיקרוטובולות דינמיות שאינן מקושרות. מחקרי שחזור במבחנה מבוססי מיקרוסקופיה TIRF מאפשרים הדמיה סימולטנית של הדינמיקה של מערכי מיקרוטובולה שונים אלה. בבדיקה זו, תא הדמיה מורכב עם microtubules משותק פני השטח, אשר נמצאים גם חוטים בודדים או מאורגן לתוך חבילות מוצלבות. המבוא של טובולין, נוקלאוטידים, ויסותים חלבון מאפשר הדמיה ישירה של חלבונים הקשורים ושל תכונות דינמיות של microtubules יחיד מוצלב. יתר על כן, שינויים המתרחשים כמו microtubules יחיד דינמי לארגן לתוך חבילות ניתן לפקח בזמן אמת. השיטה המתוארת כאן מאפשרת הערכה שיטתית של הפעילות והלוקליזציה של חלבונים בודדים, כמו גם השפעות סינרגטיות של רגולטורים של חלבונים על שתי תתי-קבוצות מיקרוטובולה שונות בתנאים ניסיוניים זהים, ובכך מספקת תובנות מכאניסטיות שאינן נגישות בשיטות אחרות.
Introduction
מיקרוטובולים הם ביופולימרים היוצרים פיגומים מבניים החיוניים לתהליכים תאיים מרובים, החל מתחבורה תאית ומיצוב אברונים ועד לחלוקת תאים והתארכות. כדי לבצע פונקציות מגוונות אלה, microtubules בודדים מאורגנים לתוך מערכים בגודל מיקרון, כגון צירים מיטוטיים, אקסונמים ciliary, חבילות עצביות, מערכים אינטרפאזי, ומערכים קליפת המוח הצמחית. מוטיב אדריכלי הנמצא בכל מקום במבנים אלה הוא צרור של מיקרוטובולים המקושרים לאורכם1. מאפיין מסקרן של מספר מבנים מבוססי מיקרוטובולה הוא הדו-קיום של מיקרוטובולים ארוזים ומיקרוטובולות בודדות שאינן מקושרות בקרבה מרחבית קרובה. תת-אוכלוסיות מיקרוטובולות אלה יכולות להציג דינמיקת פילמור שונה בתכלית זו מזו, לפי הצורך לתפקודן התקין 2,3,4,5.5. לדוגמה, בתוך הציר המיטוטי, חבילות מקושרות יציבות ומיקרוטובולות בודדות דינמיות נמצאות בתוך אזור בקנה מידה מיקרוני במרכז התא6. לימוד האופן שבו המאפיינים הדינמיים של אוכלוסיות מיקרוטובולות מתקיימות יחד מצוין הוא, אם כן, מרכזי להבנת ההרכבה והתפקוד של מבנים מבוססי מיקרוטובולה.
מיקרוטובולים הם פולימרים דינמיים העוברים בין שלבי פילמור ודה-פילמור, ועוברים בין שני השלבים באירועים המכונים קטסטרופה והצלה7. הדינמיקה של מיקרוטובולים תאיים מוסדרת על ידי חלבונים נלווים Microtubule רבים (MAPs) המווסתים את שיעורי פילמור microtubule ו depolymerization ואת התדרים של קטסטרופה ואירועי הצלה. זה מאתגר לחקור את הפעילות של MAPs על מערכים פרוקסימליים מרחביים בתאים, בשל המגבלות של רזולוציה מרחבית במיקרוסקופיה קלה, במיוחד באזורים של צפיפות microtubule גבוהה. יתר על כן, נוכחותם של מספר MAPs באותו אזור תאי מעכבת פרשנויות של מחקרים ביולוגיים של התא. בדיקות שיחזור במבחנה, המבוצעות בשילוב עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית השתקפות פנימית כוללת (TIRF), עוקפות את האתגרים של בחינת מנגנונים שבאמצעותם תת-קבוצות ספציפיות של MAPs מווסתות את הדינמיקה של מערכי מיקרוטובולה תאיים פרוקסימליים. כאן, הדינמיקה של microtubules מורכב במבחנה נבדקים בנוכחות אחד או יותר MAPs רקומביננטי בתנאים מבוקרים8,9,10. עם זאת, בדיקות שיקום קונבנציונליות מבוצעות בדרך כלל על מיקרוטובולות בודדות או על סוג אחד של מערך, ומונעות הדמיה של אוכלוסיות דו-קיום.
כאן, אנו מציגים בדיקות שיחזור במבחנה המאפשרות הדמיה סימולטנית של שתי אוכלוסיות microtubule תחת אותם תנאי פתרון11. אנו מתארים שיטה כדי להציג בו זמנית את הפעילות הקולקטיבית של MPs מרובים על microtubules יחיד ועל חבילות microtubule מוצלב על ידי ציר מיטואטי הקשורים חלבון PRC1. החלבון PRC1 נקשר באופן מועדף בחפיפה בין מיקרוטובולות אנטי-מקביליות, ומקשר אותן 9. בקצרה, פרוטוקול זה מורכב מהשלבים הבאים: (1) הכנת פתרונות מלאי ורגנטים, (ii) ניקוי וטיפול על פני השטח של כיסויים המשמשים ליצירת תא ההדמיה לניסויים במיקרוסקופיה, (iii) הכנת “זרעים” מיקרוטובוליים יציבים שמהם מתבצעת פילמור במהלך הניסוי, (4) מפרט של הגדרות מיקרוסקופ TIRF להדמיית דינמיקת מיקרוטובולה, (v) הטמעת זרעי מיקרוטובולה ויצירת חבילות מיקרוטובולה מקושרות בתא ההדמיה, ו-(vi) הדמיה של דינמיקת מיקרוטובול בתא ההדמיה באמצעות מיקרוסקופיה TIRF, בתוספת טובולין מסיס, MAPs ונוקלאוטידים. בדיקות אלה מאפשרות הערכה איכותית ובדיקה כמותית של לוקליזציה MAP והשפעתן על הדינמיקה של שתי אוכלוסיות מיקרוטובולות. בנוסף, הם מאפשרים את ההערכה של השפעות סינרגטיות של MAPs מרובים על אוכלוסיות microtubule אלה, על פני מגוון רחב של תנאים ניסיוניים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הניסוי המתואר כאן מרחיב באופן משמעותי את ההיקף והמורכבות של בדיקות שיקום מיקרוטובולות קונבנציונליות, המבוצעות באופן מסורתי על מיקרוטובולות בודדות או על סוג אחד של מערך. הבדיקה הנוכחית מספקת שיטה לכמת ולהשוות בו זמנית את פעילות MAP הרגולטורית על שתי אוכלוסיות, כלומר מיקרוטובולות בודדות וח…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מטעם NIH (מס ‘ 1DP2GM126894-01), ועל ידי כספים מקרנות הצדקה של פיו וקרן משפחת סמית ל- R.S. המחברים מודים לד”ר שו ג’יאנג על תרומתו לפיתוח ואופטימיזציה של הפרוטוקולים.
Materials
| (±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox) | Sigma Aldrich | 238813 | |
| 1,4-piperazinediethanesulfonic acid (PIPES) | Sigma Aldrich | P6757 | |
| 18×18 mm #1.5 coverslips | Electron Microscopy Sciences | 63787 | |
| 2-Mercaptoethanol (BME) | Sigma Aldrich | M-6250 | |
| 24×60 mm #1.5 coverslips | Electron Microscopy Sciences | 63793 | |
| 405/488/560/647 nm Laser Quad Band | Chroma | TRF89901-NK | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 320110 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma Aldrich | A7699-5G | |
| Avidin, NeutrAvidin® Biotin-binding Protein (Molecular Probes®) | Thermo Fischer Scientific | A2666 | |
| Bath sonicator: Branson 2800 Cleaner | Branson | CPX2800H | |
| Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 11 x 34 mm | Beckman-Coulter | 343778 | |
| Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 8 x 34 mm | Beckman-Coulter | 343776 | |
| Biotin-PEG-SVA, MW 5,000 | Laysan Bio | #Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | 2905 | |
| Catalase | Sigma Aldrich | C40 | |
| Corning LSE Mini Microcentrifuge, AC100-240V | Corning | 6670 | |
| Delicate Task Wipes | Kimtech | 34120 | |
| Dithiothreitol (DTT) | GoldBio | DTT10 | |
| Emission filter | Chroma | ET610/75m | |
| Ethanol (200-proof) | Decon Labs | 2705 | |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | Sigma Aldrich | 3777 | |
| Glucose Oxidase | Sigma Aldrich | G2133 | |
| GMPCPP | Jena Bioscience | NU-405 | |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate (GTP) | Sigma Aldrich | G8877 | |
| Hellmanex III detergent | Sigma Aldrich | Z805939 | |
| Immersion oil, Type A | Fisher Scientific | 77010 | |
| Kappa-casein | Sigma Aldrich | C0406 | |
| Lanolin | Fisher Scientific | S25376 | |
| Lens Cleaning Tissue | ThorLabs | MC-5 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma Aldrich | M9272 | |
| Methylcellulose | Sigma Aldrich | M0512 | |
| Microfuge 16 Benchtop Centrifuge | Beckman-Coulter | A46474 | |
| Microscope Slides, Diamond White Glass, 25 x 75mm, 90° Ground Edges, WHITE Frosted | Globe Scientific | 1380-50W | |
| mPEG-Succinimidyl Valerate, MW 5,000 | Laysan Bio | #NH2-PEG-VA-5K | |
| Optima™ Max-XP Tabletop Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | 393315 | |
| Paraffin | Fisher Scientific | P31-500 | |
| PELCO Reverse (self-closing), Fine Tweezers | Ted Pella | 5377-NM | |
| Petrolatum, White | Fisher Scientific | 18-605-050 | |
| Plasma Cleaner, 115V | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma Aldrich | 221473 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| Thermal-Lok 1-Position Dry Heat Bath | USA Scientific | 2510-1101 | |
| Thermal-Lok Block for 1.5 and 2.0 mL Tubes | USA Scientific | 2520-0000 | |
| Thermo Scientific™ Pierce™ Bond-Breaker™ TCEP Solution, Neutral pH; 500mM | Thermo Fischer Scientific | PI-77720 | |
| TIRF 100X NA 1.49 Oil Objective | Nikon | CFI Apochromat TIRF 100XC Oil | |
| TIRF microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| TLA 120.1 rotor | Beckman-Coulter | 362224 | |
| TLA 120.2 rotor | Beckman-Coulter | 357656 | |
| Tubulin protein (>99% pure): porcine brain | Cytoskeleton | T240 | |
| Tubulin Protein (Biotin): Porcine Brain | Cytoskeleton | T333P | |
| Tubulin protein (fluorescent HiLyte 647): porcine brain | Cytoskeleton | TL670M | |
| Tubulin protein (X-rhodamine): bovine brain | Cytoskeleton | TL620M | |
| VECTABOND® Reagent, Tissue Section Adhesion | Vector Biolabs | SP-1800-7 | |
| VWR® Personal-Sized Incubator, 120V, 50/60Hz, 0.6A | VWR | 97025-630 | |
References
- Subramanian, R., Kapoor, T. M. Building complexity: insights into self-organized assembly of microtubule-based architectures. Developmental Cell. 23 (5), 874-885 (2012).
- Baas, P. W., Rao, A. N., Matamoros, A. J., Leo, L. Stability properties of neuronal microtubules. Cytoskeleton (Hoboken). 73 (9), 442-460 (2016).
- Bitan, A., Rosenbaum, I., Abdu, U. Stable and dynamic microtubules coordinately determine and maintain Drosophila bristle shape. Development. 139 (11), 1987-1996 (2012).
- Foe, V. E., von Dassow, G. Stable and dynamic microtubules coordinately shape the myosin activation zone during cytokinetic furrow formation. The Journal of Cell Biology. 183 (3), 457-470 (2008).
- Pous, C., et al. Functional specialization of stable and dynamic microtubules in protein traffic in WIF-B cells. The Journal of Cell Biology. 142 (1), 153-165 (1998).
- Uehara, R., Goshima, G. Functional central spindle assembly requires de novo microtubule generation in the interchromosomal region during anaphase. The Journal of Cell Biology. 191 (2), 259-267 (2010).
- Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).
- Bieling, P., et al. Reconstitution of a microtubule plus-end tracking system in vitro. Nature. 450 (7172), 1100-1105 (2007).
- Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps. Cell. 142 (3), 420-432 (2010).
- Shimamoto, Y., Forth, S., Kapoor, T. M. Measuring pushing and braking forces generated by ensembles of Kinesin-5 crosslinking two microtubules. Developmental Cell. 34 (6), 669-681 (2015).
- Mani, N., Jiang, S., Neary, A. E., Wijeratne, S. S., Subramanian, R. Differential regulation of single microtubules and bundles by a three-protein module. Nature Chemical Biology. 17 (9), 964-974 (2021).
- Hyman, A. A., Salser, S., Drechsel, D., Unwin, N., Mitchison, T. J. Role of GTP hydrolysis in microtubule dynamics: information from a slowly hydrolyzable analogue, GMPCPP. Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1155-1167 (1992).
- Subramanian, R., et al. Insights into antiparallel microtubule crosslinking by PRC1, a conserved nonmotor microtubule binding protein. Cell. 142 (3), 433-443 (2010).
- Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
- Wijeratne, S., Subramanian, R. Geometry of antiparallel microtubule bundles regulates relative sliding and stalling by PRC1 and Kif4A. eLife. 7, 32595 (2018).
- Mani, N., Wijeratne, S. S., Subramanian, R. Micron-scale geometrical features of microtubules as regulators of microtubule organization. eLife. 10, 63880 (2021).
- Freal, A., et al. Feedback-driven assembly of the axon initial segment. Neuron. 104 (2), 305-321 (2019).
- Ledbetter, M., Porter, K. A "microtubule" in plant cell fine structure. The Journal of Cell Biology. 19 (1), 239-250 (1963).
- Wijeratne, S. S., Marchan, M. F., Tresback, J. S., Subramanian, R. Atomic force microscopy reveals distinct protofilament-scale structural dynamics in depolymerizing microtubule arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 119 (2022).
