Gelijktijdige visualisatie van de dynamica van crosslinked en enkele microtubuli in vitro door TIRF-microscopie
Summary
Hier wordt een op TIRF-microscopie gebaseerde in vitro reconstitutietest gepresenteerd om tegelijkertijd de dynamiek van twee microtubulipopulaties te kwantificeren en te vergelijken. Er wordt een methode beschreven om tegelijkertijd de collectieve activiteit van meerdere microtubule-geassocieerde eiwitten op verknoopte microtubulibundels en enkele microtubuli te bekijken.
Abstract
Microtubuli zijn polymeren van αβ-tubuline heterodimeren die zich organiseren in verschillende structuren in cellen. Op microtubule gebaseerde architecturen en netwerken bevatten vaak subsets van microtubule-arrays die verschillen in hun dynamische eigenschappen. In delende cellen bestaan bijvoorbeeld stabiele bundels van verknoopte microtubuli naast elkaar in de nabijheid van dynamische niet-gekruiste microtubuli. Tirf-microscopie-gebaseerde in vitro reconstitutiestudies maken de gelijktijdige visualisatie van de dynamiek van deze verschillende microtubule arrays mogelijk. In deze test wordt een beeldvormingskamer geassembleerd met aan het oppervlak geïmmobiliseerde microtubuli, die ofwel aanwezig zijn als afzonderlijke filamenten of georganiseerd in verknoopte bundels. Introductie van tubuline, nucleotiden en eiwitregulatoren maakt directe visualisatie van geassocieerde eiwitten en van dynamische eigenschappen van enkele en verknoopte microtubuli mogelijk. Bovendien kunnen veranderingen die optreden als dynamische enkele microtubuli zich in bundels organiseren, in realtime worden gevolgd. De hier beschreven methode maakt een systematische evaluatie van de activiteit en lokalisatie van individuele eiwitten mogelijk, evenals synergetische effecten van eiwitregulatoren op twee verschillende microtubbule-subsets onder identieke experimentele omstandigheden, waardoor mechanistische inzichten worden verkregen die ontoegankelijk zijn door andere methoden.
Introduction
Microtubuli zijn biopolymeren die structurele steigers vormen die essentieel zijn voor meerdere cellulaire processen, variërend van intracellulair transport en organelpositionering tot celdeling en elongatie. Om deze diverse functies uit te voeren, worden individuele microtubuli georganiseerd in arrays ter grootte van micron, zoals mitotische spindels, ciliaire axonemen, neuronale bundels, interfase-arrays en plantaardige corticale arrays. Een alomtegenwoordig architectonisch motief dat in deze structuren wordt aangetroffen, is een bundel microtubuli die over hun lengtes zijn verknoopt1. Een intrigerend kenmerk van verschillende op microtubuli gebaseerde structuren is het naast elkaar bestaan van gebundelde microtubuli en niet-verknoopte enkele microtubuli in de nabijheid van ruimte. Deze subpopulaties van microtubuli kunnen sterk verschillende polymerisatiedynamieken van elkaar vertonen, afhankelijk van wat nodig is voor hun juiste functie2,3,4,5. Binnen de mitotische spil zijn bijvoorbeeld stabiele verknoopte bundels en dynamische enkele microtubuli aanwezig in een micronschaalgebied in het celcentrum6. Het bestuderen van hoe de dynamische eigenschappen van naast elkaar bestaande microtubulipopulaties worden gespecificeerd, is daarom van cruciaal belang voor het begrijpen van de assemblage en functie van op microtubulen gebaseerde structuren.
Microtubuli zijn dynamische polymeren die fietsen tussen fasen van polymerisatie en depolymerisatie, waarbij wordt geschakeld tussen de twee fasen in gebeurtenissen die bekend staan als catastrofe en redding7. De dynamiek van cellulaire microtubuli wordt gereguleerd door talloze Microtubule Associated Proteins (MAPs) die de snelheden van microtubule polymerisatie en depolymerisatie en de frequenties van catastrofe- en reddingsgebeurtenissen moduleren. Het is een uitdaging om de activiteit van MAPs op ruimtelijk proximale arrays in cellen te onderzoeken, vanwege de beperkingen van de ruimtelijke resolutie in lichtmicroscopie, vooral in regio’s met een hoge microtubuledichtheid. Bovendien belemmert de aanwezigheid van meerdere MAPs in hetzelfde cellulaire gebied de interpretaties van celbiologische studies. In vitro reconstitutietests, uitgevoerd in combinatie met Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopie, omzeilen de uitdagingen van het onderzoeken van mechanismen waarmee specifieke subsets van MAPs de dynamiek van proximale cellulaire microtubule-arrays reguleren. Hier wordt de dynamiek van in vitro geassembleerde microtubuli onderzocht in aanwezigheid van een of meer recombinante MAPs onder gecontroleerde omstandigheden8,9,10. Conventionele reconstitutietests worden echter meestal uitgevoerd op enkele microtubuli of op één type array, waardoor de visualisatie van naast elkaar bestaande populaties wordt uitgesloten.
Hier presenteren we in vitro reconstitutietests die de gelijktijdige visualisatie van twee microtubulipopulaties onder dezelfde oplossingsomstandigheden mogelijk maken11. We beschrijven een methode om tegelijkertijd de collectieve activiteit van meerdere MAPs op enkele microtubuli en op microtubulibundels te bekijken die zijn gekruist door het mitotische spindel-geassocieerde eiwit PRC1. Het eiwit PRC1 bindt bij voorkeur aan de overlap tussen anti-parallelle microtubuli, waardoor ze worden verknoopt9. In het kort bestaat dit protocol uit de volgende stappen: (i) voorbereiding van stamoplossingen en reagentia, (ii) reiniging en oppervlaktebehandeling van coverslips die worden gebruikt om de beeldvormingskamer voor microscopie-experimenten te creëren, (iii) voorbereiding van stabiele microtubuli “zaden” van waaruit polymerisatie wordt gestart tijdens het experiment, (iv) specificatie van TIRF-microscoopinstellingen om microtubulidynamica te visualiseren, (v) immobilisatie van microtubulizaden en generatie van verknoopte microtubulibundels in de beeldvormingskamer, en (vi) visualisatie van microtubuledynamica in de beeldvormingskamer door middel van TIRF-microscopie, na toevoeging van oplosbare tubuline, MAPs en nucleotiden. Deze assays maken de kwalitatieve evaluatie en kwantitatief onderzoek van MAP-lokalisatie en hun effect op de dynamiek van twee microtubulepopulaties mogelijk. Bovendien vergemakkelijken ze de evaluatie van synergetische effecten van meerdere MAPs op deze microtubule-populaties, in een breed scala van experimentele omstandigheden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het hier beschreven experiment breidt de reikwijdte en complexiteit van conventionele microtubule reconstitutietests aanzienlijk uit, die traditioneel worden uitgevoerd op enkele microtubuli of op één type array. De huidige test biedt een methode om tegelijkertijd de regulerende MAP-activiteit op twee populaties te kwantificeren en te vergelijken, namelijk enkele microtubuli en gekruiste bundels. Verder maakt deze test het mogelijk om twee soorten bundels te onderzoeken: bundels die vooraf zijn gevormd uit stabiele zad…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de NIH (nr. 1DP2GM126894-01), en door fondsen van de Pew Charitable Trusts en de Smith Family Foundation aan R.S. De auteurs bedanken Dr. Shuo Jiang voor zijn bijdrage aan de ontwikkeling en optimalisatie van de protocollen.
Materials
| (±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox) | Sigma Aldrich | 238813 | |
| 1,4-piperazinediethanesulfonic acid (PIPES) | Sigma Aldrich | P6757 | |
| 18×18 mm #1.5 coverslips | Electron Microscopy Sciences | 63787 | |
| 2-Mercaptoethanol (BME) | Sigma Aldrich | M-6250 | |
| 24×60 mm #1.5 coverslips | Electron Microscopy Sciences | 63793 | |
| 405/488/560/647 nm Laser Quad Band | Chroma | TRF89901-NK | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 320110 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma Aldrich | A7699-5G | |
| Avidin, NeutrAvidin® Biotin-binding Protein (Molecular Probes®) | Thermo Fischer Scientific | A2666 | |
| Bath sonicator: Branson 2800 Cleaner | Branson | CPX2800H | |
| Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 11 x 34 mm | Beckman-Coulter | 343778 | |
| Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 8 x 34 mm | Beckman-Coulter | 343776 | |
| Biotin-PEG-SVA, MW 5,000 | Laysan Bio | #Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | 2905 | |
| Catalase | Sigma Aldrich | C40 | |
| Corning LSE Mini Microcentrifuge, AC100-240V | Corning | 6670 | |
| Delicate Task Wipes | Kimtech | 34120 | |
| Dithiothreitol (DTT) | GoldBio | DTT10 | |
| Emission filter | Chroma | ET610/75m | |
| Ethanol (200-proof) | Decon Labs | 2705 | |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | Sigma Aldrich | 3777 | |
| Glucose Oxidase | Sigma Aldrich | G2133 | |
| GMPCPP | Jena Bioscience | NU-405 | |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate (GTP) | Sigma Aldrich | G8877 | |
| Hellmanex III detergent | Sigma Aldrich | Z805939 | |
| Immersion oil, Type A | Fisher Scientific | 77010 | |
| Kappa-casein | Sigma Aldrich | C0406 | |
| Lanolin | Fisher Scientific | S25376 | |
| Lens Cleaning Tissue | ThorLabs | MC-5 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma Aldrich | M9272 | |
| Methylcellulose | Sigma Aldrich | M0512 | |
| Microfuge 16 Benchtop Centrifuge | Beckman-Coulter | A46474 | |
| Microscope Slides, Diamond White Glass, 25 x 75mm, 90° Ground Edges, WHITE Frosted | Globe Scientific | 1380-50W | |
| mPEG-Succinimidyl Valerate, MW 5,000 | Laysan Bio | #NH2-PEG-VA-5K | |
| Optima™ Max-XP Tabletop Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | 393315 | |
| Paraffin | Fisher Scientific | P31-500 | |
| PELCO Reverse (self-closing), Fine Tweezers | Ted Pella | 5377-NM | |
| Petrolatum, White | Fisher Scientific | 18-605-050 | |
| Plasma Cleaner, 115V | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma Aldrich | 221473 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| Thermal-Lok 1-Position Dry Heat Bath | USA Scientific | 2510-1101 | |
| Thermal-Lok Block for 1.5 and 2.0 mL Tubes | USA Scientific | 2520-0000 | |
| Thermo Scientific™ Pierce™ Bond-Breaker™ TCEP Solution, Neutral pH; 500mM | Thermo Fischer Scientific | PI-77720 | |
| TIRF 100X NA 1.49 Oil Objective | Nikon | CFI Apochromat TIRF 100XC Oil | |
| TIRF microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| TLA 120.1 rotor | Beckman-Coulter | 362224 | |
| TLA 120.2 rotor | Beckman-Coulter | 357656 | |
| Tubulin protein (>99% pure): porcine brain | Cytoskeleton | T240 | |
| Tubulin Protein (Biotin): Porcine Brain | Cytoskeleton | T333P | |
| Tubulin protein (fluorescent HiLyte 647): porcine brain | Cytoskeleton | TL670M | |
| Tubulin protein (X-rhodamine): bovine brain | Cytoskeleton | TL620M | |
| VECTABOND® Reagent, Tissue Section Adhesion | Vector Biolabs | SP-1800-7 | |
| VWR® Personal-Sized Incubator, 120V, 50/60Hz, 0.6A | VWR | 97025-630 | |
References
- Subramanian, R., Kapoor, T. M. Building complexity: insights into self-organized assembly of microtubule-based architectures. Developmental Cell. 23 (5), 874-885 (2012).
- Baas, P. W., Rao, A. N., Matamoros, A. J., Leo, L. Stability properties of neuronal microtubules. Cytoskeleton (Hoboken). 73 (9), 442-460 (2016).
- Bitan, A., Rosenbaum, I., Abdu, U. Stable and dynamic microtubules coordinately determine and maintain Drosophila bristle shape. Development. 139 (11), 1987-1996 (2012).
- Foe, V. E., von Dassow, G. Stable and dynamic microtubules coordinately shape the myosin activation zone during cytokinetic furrow formation. The Journal of Cell Biology. 183 (3), 457-470 (2008).
- Pous, C., et al. Functional specialization of stable and dynamic microtubules in protein traffic in WIF-B cells. The Journal of Cell Biology. 142 (1), 153-165 (1998).
- Uehara, R., Goshima, G. Functional central spindle assembly requires de novo microtubule generation in the interchromosomal region during anaphase. The Journal of Cell Biology. 191 (2), 259-267 (2010).
- Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).
- Bieling, P., et al. Reconstitution of a microtubule plus-end tracking system in vitro. Nature. 450 (7172), 1100-1105 (2007).
- Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps. Cell. 142 (3), 420-432 (2010).
- Shimamoto, Y., Forth, S., Kapoor, T. M. Measuring pushing and braking forces generated by ensembles of Kinesin-5 crosslinking two microtubules. Developmental Cell. 34 (6), 669-681 (2015).
- Mani, N., Jiang, S., Neary, A. E., Wijeratne, S. S., Subramanian, R. Differential regulation of single microtubules and bundles by a three-protein module. Nature Chemical Biology. 17 (9), 964-974 (2021).
- Hyman, A. A., Salser, S., Drechsel, D., Unwin, N., Mitchison, T. J. Role of GTP hydrolysis in microtubule dynamics: information from a slowly hydrolyzable analogue, GMPCPP. Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1155-1167 (1992).
- Subramanian, R., et al. Insights into antiparallel microtubule crosslinking by PRC1, a conserved nonmotor microtubule binding protein. Cell. 142 (3), 433-443 (2010).
- Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
- Wijeratne, S., Subramanian, R. Geometry of antiparallel microtubule bundles regulates relative sliding and stalling by PRC1 and Kif4A. eLife. 7, 32595 (2018).
- Mani, N., Wijeratne, S. S., Subramanian, R. Micron-scale geometrical features of microtubules as regulators of microtubule organization. eLife. 10, 63880 (2021).
- Freal, A., et al. Feedback-driven assembly of the axon initial segment. Neuron. 104 (2), 305-321 (2019).
- Ledbetter, M., Porter, K. A "microtubule" in plant cell fine structure. The Journal of Cell Biology. 19 (1), 239-250 (1963).
- Wijeratne, S. S., Marchan, M. F., Tresback, J. S., Subramanian, R. Atomic force microscopy reveals distinct protofilament-scale structural dynamics in depolymerizing microtubule arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 119 (2022).
