TIRF माइक्रोस्कोपी द्वारा विट्रो में क्रॉसलिंक्ड और एकल सूक्ष्मनलिकाएं की गतिशीलता का एक साथ विज़ुअलाइज़ेशन
Summary
यहाँ, एक TIRF माइक्रोस्कोपी आधारित इन विट्रो पुनर्गठन परख एक साथ मात्रा निर्धारित करने के लिए प्रस्तुत किया जाता है और दो सूक्ष्मनलिकाएं आबादी की गतिशीलता की तुलना. एक विधि को एक साथ क्रॉसलिंक किए गए सूक्ष्मनलिकाएं बंडलों और एकल सूक्ष्मनलिकाएं पर कई सूक्ष्मनलिकाएं-संबद्ध प्रोटीन की सामूहिक गतिविधि को देखने के लिए वर्णित किया गया है।
Abstract
सूक्ष्मनलिकाएं απ-ट्यूबुलिन हेटरोडिमर के पॉलिमर हैं जो कोशिकाओं में अलग-अलग संरचनाओं में व्यवस्थित होते हैं। सूक्ष्मनलिकाएं-आधारित आर्किटेक्चर और नेटवर्क में अक्सर सूक्ष्मनलिकाएं सरणियों के सबसेट होते हैं जो उनके गतिशील गुणों में भिन्न होते हैं। उदाहरण के लिए, विभाजित कोशिकाओं में, क्रॉसलिंक्ड सूक्ष्मनलिकाएं के स्थिर बंडल गतिशील गैर-क्रॉसलिंक्ड सूक्ष्मनलिकाएं के करीब निकटता में सह-अस्तित्व में रहते हैं। TIRF-माइक्रोस्कोपी-आधारित इन विट्रो पुनर्गठन अध्ययन इन विभिन्न सूक्ष्मनलिकाएं सरणियों की गतिशीलता के एक साथ विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम करते हैं। इस परख में, एक इमेजिंग कक्ष सतह-immobilized सूक्ष्मनलिकाएं, जो या तो एकल फिलामेंट्स के रूप में मौजूद हैं या crosslinked बंडलों में आयोजित कर रहे हैं के साथ इकट्ठा किया जाता है. ट्यूबुलिन, न्यूक्लियोटाइड्स और प्रोटीन नियामकों का परिचय संबंधित प्रोटीन के प्रत्यक्ष विज़ुअलाइज़ेशन और एकल और क्रॉसलिंक्ड सूक्ष्मनलिकाएं के गतिशील गुणों की अनुमति देता है। इसके अलावा, गतिशील एकल सूक्ष्मनलिकाएं बंडलों में व्यवस्थित होने के रूप में होने वाले परिवर्तनों को वास्तविक समय में मॉनिटर किया जा सकता है। यहां वर्णित विधि व्यक्तिगत प्रोटीन की गतिविधि और स्थानीयकरण के व्यवस्थित मूल्यांकन के साथ-साथ समान प्रयोगात्मक परिस्थितियों में दो अलग-अलग सूक्ष्मनलिकाएं सबसेट पर प्रोटीन नियामकों के सहक्रियात्मक प्रभावों की अनुमति देती है, जिससे यांत्रिक अंतर्दृष्टि प्रदान की जाती है जो अन्य तरीकों से दुर्गम हैं।
Introduction
सूक्ष्मनलिकाएं बायोपॉलिमर हैं जो कई सेलुलर प्रक्रियाओं के लिए आवश्यक संरचनात्मक मचान बनाते हैं, जो इंट्रासेल्युलर परिवहन और ऑर्गेनेल पोजिशनिंग से लेकर सेल डिवीजन और बढ़ाव तक होते हैं। इन विविध कार्यों को निष्पादित करने के लिए, व्यक्तिगत सूक्ष्मनलिकाएं माइक्रोन-आकार की सरणियों में व्यवस्थित की जाती हैं, जैसे कि माइटोटिक स्पिंडल, सिलियरी एक्सोनेम्स, न्यूरोनल बंडल, इंटरफेज सरणियां और प्लांट कॉर्टिकल सरणियां। इन संरचनाओं में पाया जाने वाला एक सर्वव्यापी वास्तुशिल्प आकृति सूक्ष्मनलिकाएं का एक बंडल है जो उनकी लंबाई के साथ क्रॉसलिंक किया गया है1। कई सूक्ष्मनलिकाएं-आधारित संरचनाओं की एक पेचीदा विशेषता बंडल सूक्ष्मनलिकाएं और निकट स्थानिक निकटता में गैर-क्रॉसलिंक्ड एकल सूक्ष्मनलिकाएं का सह-अस्तित्व है। ये सूक्ष्मनलिकाएं उप-आबादी एक-दूसरे से बिल्कुल अलग पोलीमराइजेशन गतिशीलता प्रदर्शित कर सकती हैं, जैसा कि उनके उचित कार्य 2,3,4,5 के लिए आवश्यक है। उदाहरण के लिए, माइटोटिक स्पिंडल के भीतर, स्थिर क्रॉसलिंक्ड बंडल और गतिशील एकल सूक्ष्मनलिकाएं सेल सेंटर 6 पर एक माइक्रोन-स्केल क्षेत्र के भीतर मौजूद हैं। अध्ययन कैसे coexisting सूक्ष्मनलिकाएं आबादी के गतिशील गुणों को निर्दिष्ट कर रहे हैं, इसलिए, सूक्ष्मनलिकाएं आधारित संरचनाओं की विधानसभा और कार्य को समझने के लिए केंद्रीय है।
सूक्ष्मनलिकाएं गतिशील पॉलिमर हैं जो पोलीमराइजेशन और डीपोलीमराइजेशन के चरणों के बीच चक्र करती हैं, जो आपदा और बचाव 7 के रूप में जानी जाने वाली घटनाओं में दो चरणों के बीच स्विच करती हैं। सेलुलर सूक्ष्मनलिकाएं की गतिशीलता असंख्य सूक्ष्मनलिकाएं एसोसिएटेड प्रोटीन (एमएपी) द्वारा विनियमित की जाती हैं जो सूक्ष्मनलिकाएं पोलीमराइजेशन और डीपोलीमराइजेशन की दरों और तबाही और बचाव की घटनाओं की आवृत्तियों को संशोधित करती हैं। प्रकाश माइक्रोस्कोपी में स्थानिक संकल्प की सीमाओं के कारण, कोशिकाओं में स्थानिक रूप से समीपस्थ सरणियों पर एमएपी की गतिविधि की जांच करना चुनौतीपूर्ण है, विशेष रूप से उच्च सूक्ष्मनलिका घनत्व वाले क्षेत्रों में। इसके अलावा, एक ही सेलुलर क्षेत्र में कई एमएपी की उपस्थिति सेल जैविक अध्ययन की व्याख्याओं में बाधा डालती है। कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (TIRF) माइक्रोस्कोपी के साथ संयोजन के रूप में प्रदर्शन इन विट्रो पुनर्गठन assays, तंत्र की जांच करने की चुनौतियों को दरकिनार करता है जिसके द्वारा एमएपी के विशिष्ट सबसेट समीपस्थ सेलुलर सूक्ष्मनलिकाएं सरणियों की गतिशीलता को विनियमित करते हैं। यहां, विट्रो में इकट्ठे हुए सूक्ष्मनलिकाएं की गतिशीलता की जांच नियंत्रित परिस्थितियों में एक या एक से अधिक पुनः संयोजक एमएपी की उपस्थिति में की जाती है8,9,10। हालांकि, पारंपरिक पुनर्गठन assays आमतौर पर एकल सूक्ष्मनलिकाएं या एक प्रकार की सरणी पर किया जाता है, जो सह-अस्तित्व वाली आबादी के विज़ुअलाइज़ेशन को पूर्वनिर्धारित करता है।
यहां, हम इन विट्रो पुनर्गठन assays में प्रस्तुत करते हैं जो एक ही समाधान की स्थिति के तहत दो सूक्ष्मनलिकाएं आबादी के एक साथ विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम करते हैं11। हम एक साथ एकल सूक्ष्मनलिकाएं पर कई एमएपी की सामूहिक गतिविधि को देखने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं और माइटोटिक स्पिंडल से जुड़े प्रोटीन पीआरसी 1 द्वारा क्रॉसलिंक किए गए सूक्ष्मनलिकाएं बंडलों पर। प्रोटीन PRC1 अधिमानतः विरोधी समानांतर सूक्ष्मनलिकाएं के बीच ओवरलैप पर बांधता है, उन्हें क्रॉसलिंकिंग 9। संक्षेप में, इस प्रोटोकॉल में निम्नलिखित चरण शामिल हैं: (i) स्टॉक समाधान और अभिकर्मकों की तैयारी, (ii) माइक्रोस्कोपी प्रयोगों के लिए इमेजिंग चैंबर बनाने के लिए उपयोग किए जाने वाले कवरलिप्स की सफाई और सतह उपचार, (iii) स्थिर सूक्ष्मनलिकाएं “बीज” की तैयारी जिसमें से प्रयोग के दौरान पोलीमराइजेशन शुरू किया जाता है, (iv) सूक्ष्मनलिकाएं गतिशीलता की कल्पना करने के लिए टीआईआरएफ माइक्रोस्कोप सेटिंग्स का विनिर्देशन, (v) सूक्ष्मनलिकाएं बीजों का स्थिरीकरण और क्रॉसलिंक्ड सूक्ष्मनलिकाएं बंडलों का उत्पादन इमेजिंग कक्ष में, और (vi) घुलनशील ट्यूबुलिन, एमएपी और न्यूक्लियोटाइड्स के अलावा, टीआईआरएफ माइक्रोस्कोपी के माध्यम से इमेजिंग चैंबर में सूक्ष्मनलिकाएं गतिशीलता का विज़ुअलाइज़ेशन। ये assays गुणात्मक मूल्यांकन और MAP स्थानीयकरण के मात्रात्मक परीक्षा और दो सूक्ष्मनलिकाएं आबादी की गतिशीलता पर उनके प्रभाव को सक्षम करते हैं। इसके अतिरिक्त, वे प्रयोगात्मक स्थितियों की एक विस्तृत श्रृंखला में इन सूक्ष्मनलिकाएं आबादी पर कई एमएपी के सहक्रियात्मक प्रभावों के मूल्यांकन की सुविधा प्रदान करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां वर्णित प्रयोग पारंपरिक सूक्ष्मनलिकाएं पुनर्गठन assays के दायरे और जटिलता का काफी विस्तार करता है, जो पारंपरिक रूप से एकल सूक्ष्मनलिकाएं या एक प्रकार की सरणी पर किया जाता है। वर्तमान परख एक साथ मात्र?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को एनआईएच (संख्या 1DP2GM126894-01) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, और प्यू चैरिटेबल ट्रस्ट और स्मिथ फैमिली फाउंडेशन से आर.एस. लेखकों ने प्रोटोकॉल के विकास और अनुकूलन की दिशा में उनके योगदान के लिए डॉ शुओ जियांग को धन्यवाद दिया।
Materials
| (±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox) | Sigma Aldrich | 238813 | |
| 1,4-piperazinediethanesulfonic acid (PIPES) | Sigma Aldrich | P6757 | |
| 18×18 mm #1.5 coverslips | Electron Microscopy Sciences | 63787 | |
| 2-Mercaptoethanol (BME) | Sigma Aldrich | M-6250 | |
| 24×60 mm #1.5 coverslips | Electron Microscopy Sciences | 63793 | |
| 405/488/560/647 nm Laser Quad Band | Chroma | TRF89901-NK | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 320110 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma Aldrich | A7699-5G | |
| Avidin, NeutrAvidin® Biotin-binding Protein (Molecular Probes®) | Thermo Fischer Scientific | A2666 | |
| Bath sonicator: Branson 2800 Cleaner | Branson | CPX2800H | |
| Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 11 x 34 mm | Beckman-Coulter | 343778 | |
| Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 8 x 34 mm | Beckman-Coulter | 343776 | |
| Biotin-PEG-SVA, MW 5,000 | Laysan Bio | #Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | 2905 | |
| Catalase | Sigma Aldrich | C40 | |
| Corning LSE Mini Microcentrifuge, AC100-240V | Corning | 6670 | |
| Delicate Task Wipes | Kimtech | 34120 | |
| Dithiothreitol (DTT) | GoldBio | DTT10 | |
| Emission filter | Chroma | ET610/75m | |
| Ethanol (200-proof) | Decon Labs | 2705 | |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | Sigma Aldrich | 3777 | |
| Glucose Oxidase | Sigma Aldrich | G2133 | |
| GMPCPP | Jena Bioscience | NU-405 | |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate (GTP) | Sigma Aldrich | G8877 | |
| Hellmanex III detergent | Sigma Aldrich | Z805939 | |
| Immersion oil, Type A | Fisher Scientific | 77010 | |
| Kappa-casein | Sigma Aldrich | C0406 | |
| Lanolin | Fisher Scientific | S25376 | |
| Lens Cleaning Tissue | ThorLabs | MC-5 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma Aldrich | M9272 | |
| Methylcellulose | Sigma Aldrich | M0512 | |
| Microfuge 16 Benchtop Centrifuge | Beckman-Coulter | A46474 | |
| Microscope Slides, Diamond White Glass, 25 x 75mm, 90° Ground Edges, WHITE Frosted | Globe Scientific | 1380-50W | |
| mPEG-Succinimidyl Valerate, MW 5,000 | Laysan Bio | #NH2-PEG-VA-5K | |
| Optima™ Max-XP Tabletop Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | 393315 | |
| Paraffin | Fisher Scientific | P31-500 | |
| PELCO Reverse (self-closing), Fine Tweezers | Ted Pella | 5377-NM | |
| Petrolatum, White | Fisher Scientific | 18-605-050 | |
| Plasma Cleaner, 115V | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma Aldrich | 221473 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| Thermal-Lok 1-Position Dry Heat Bath | USA Scientific | 2510-1101 | |
| Thermal-Lok Block for 1.5 and 2.0 mL Tubes | USA Scientific | 2520-0000 | |
| Thermo Scientific™ Pierce™ Bond-Breaker™ TCEP Solution, Neutral pH; 500mM | Thermo Fischer Scientific | PI-77720 | |
| TIRF 100X NA 1.49 Oil Objective | Nikon | CFI Apochromat TIRF 100XC Oil | |
| TIRF microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| TLA 120.1 rotor | Beckman-Coulter | 362224 | |
| TLA 120.2 rotor | Beckman-Coulter | 357656 | |
| Tubulin protein (>99% pure): porcine brain | Cytoskeleton | T240 | |
| Tubulin Protein (Biotin): Porcine Brain | Cytoskeleton | T333P | |
| Tubulin protein (fluorescent HiLyte 647): porcine brain | Cytoskeleton | TL670M | |
| Tubulin protein (X-rhodamine): bovine brain | Cytoskeleton | TL620M | |
| VECTABOND® Reagent, Tissue Section Adhesion | Vector Biolabs | SP-1800-7 | |
| VWR® Personal-Sized Incubator, 120V, 50/60Hz, 0.6A | VWR | 97025-630 | |
References
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