TIRF 현미경에 의한 시험관 내에서 가교 및 단일 미세 소 관 의 역학의 동시 시각화
Summary
여기서, TIRF 현미경 기반 시험관내 재구성 분석법이 제시되어 두 미세소관 집단의 역학을 동시에 정량화하고 비교한다. 가교된 미세소관 다발 및 단일 미세소관 상에서 다수의 미세소관-관련 단백질의 집단 활성을 동시에 보는 방법이 기술된다.
Abstract
미세소관은 세포에서 별개의 구조로 조직되는 αβ-튜불린 이종이량체의 중합체이다. 미세소관 기반 아키텍처 및 네트워크에는 종종 동적 특성이 다른 미세소관 어레이의 하위 집합이 포함되어 있습니다. 예를 들어, 분열 세포에서, 가교결합된 미세소관의 안정한 다발은 동적 비가교된 미세소관에 근접하여 공존한다. TIRF-현미경-기반 시험관 내 재구성 연구는 이들 상이한 미세소관 어레이의 역학의 동역학의 동시 시각화를 가능하게 한다. 이 분석에서, 이미징 챔버는 단일 필라멘트로 존재하거나 가교된 다발로 조직되는 표면 고정화된 미세소관으로 조립된다. 튜불린, 뉴클레오티드 및 단백질 조절제의 도입은 관련 단백질 및 단일 및 가교된 미세소관의 동적 특성의 직접적인 시각화를 가능하게 한다. 또한, 동적 단일 미세소관이 번들로 구성될 때 발생하는 변화를 실시간으로 모니터링할 수 있습니다. 여기에 설명 된 방법은 개별 단백질의 활성 및 국소화에 대한 체계적인 평가뿐만 아니라 동일한 실험 조건 하에서 두 개의 서로 다른 미세 소관 하위 집합에 대한 단백질 조절제의 상승 효과를 허용하여 다른 방법으로는 접근 할 수없는 기계론적 통찰력을 제공합니다.
Introduction
미세소관은 세포 내 수송 및 소기관 위치에서부터 세포 분열 및 신장에 이르기까지 여러 세포 과정에 필수적인 구조적 스캐폴드를 형성하는 바이오 폴리머입니다. 이러한 다양한 기능을 실행하기 위해 개별 미세 소관은 유사분열 스핀들, 섬모 축삭, 뉴런 번들, 상 간 배열 및 식물 피질 배열과 같은 미크론 크기의 배열로 구성됩니다. 이 구조에서 발견되는 유비쿼터스 건축 모티프는 길이를 따라 가교 된 미세 소관 묶음입니다1. 몇몇 미세소관-기반 구조의 흥미로운 특징은 번들링된 미세소관과 비가교된 단일 미세소관이 가까운 공간적 근접성에서 공존한다는 것이다. 이러한 미세소관 하위집단은 적절한 기능을 위해 필요에 따라 서로 뚜렷하게 다른 중합 역학을 나타낼 수 있습니다2,3,4,5. 예를 들어, 유사분열 스핀들 내에서, 안정한 가교결합된 다발과 동적 단일 미세소관은 세포 중심6에서 미크론 스케일 영역 내에 존재한다. 따라서 공존하는 미세 소관 집단의 동적 특성이 어떻게 지정되는지를 연구하는 것은 미세 소관 기반 구조물의 조립과 기능을 이해하는 데 핵심입니다.
미세소관은 중합과 탈중합의 단계 사이를 순환하는 역동적인 중합체로, 재앙과 구조7로 알려진 사건에서 두 단계 사이를 전환합니다. 세포 미세 소관의 역학은 미세 소관 중합 및 탈중합 속도와 재앙 및 구조 사건의 빈도를 조절하는 무수한 미세 소관 관련 단백질 (MAPs)에 의해 조절됩니다. 세포의 공간적으로 근위 배열에 대한 MAP의 활성을 조사하는 것은 어려운 일이며, 특히 미세 소관 밀도가 높은 영역에서 광 현미경 검사에서 공간 분해능의 한계 때문입니다. 또한, 동일한 세포 영역에 여러 MAP가 존재하면 세포 생물학적 연구의 해석을 방해합니다. TIRF(Total Internal Reflection Fluorescence) 현미경과 함께 수행되는 시험관내 재구성 분석은 MAP의 특정 하위 집합이 근위 세포 미세소관 어레이의 역학을 조절하는 검사 메커니즘의 과제를 회피합니다. 여기서, 시험관내에서 조립된 미세소관의 역학은 조절된 조건하에서 하나 이상의 재조합 MAPs의 존재 하에 검사된다8,9,10. 그러나, 종래의 재구성 분석은 전형적으로 단일 미세소관 또는 한 유형의 어레이에서 수행되어, 공존하는 집단의 시각화를 배제한다.
여기에서, 우리는 동일한 용액 조건 하에서 두 개의 미세소관 집단의 동시 시각화를 가능하게 하는 시험관내 재구성 검정을 제시한다11. 우리는 단일 미세 소관과 유사분열 스핀들 관련 단백질 PRC1에 의해 가교 된 미세 소관 다발에서 여러 MAP의 집단 활동을 동시에 보는 방법을 설명합니다. 단백질 PRC1은 항평행 미세소관 사이의 중첩에서 우선적으로 결합하고, 이들을 가교결합시킨다9. 간략하게, 이 프로토콜은 (i) 스톡 용액 및 시약의 제조, (ii) 현미경 실험용 이미징 챔버를 만드는 데 사용되는 커버슬립의 세척 및 표면 처리, (iii) 실험 중에 중합이 개시되는 안정적인 미세소관 “종자”의 제조, (iv) 미세소관 역학을 시각화하기 위한 TIRF 현미경 설정의 사양, (v) 미세소관 종자의 고정화 및 가교된 미세소관 번들의 생성 이미징 챔버에서, 및 (vi) TIRF 현미경을 통해 이미징 챔버 내의 미세소관 역학의 시각화는, 가용성 튜불린, MAPs, 및 뉴클레오티드의 첨가시. 이러한 분석은 MAP 국소화의 정성적 평가 및 정량적 검사와 두 개의 미세 소관 집단의 역학에 미치는 영향을 가능하게합니다. 또한, 그들은 광범위한 실험 조건에 걸쳐 이러한 미세 소관 집단에 대한 여러 MAP의 상승 효과의 평가를 용이하게합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명 된 실험은 전통적으로 단일 미세 소관 또는 한 유형의 어레이에서 수행되는 기존의 미세 소관 재구성 분석의 범위와 복잡성을 크게 확장합니다. 현재의 분석은 두 집단, 즉 단일 미세소관 및 가교결합된 다발에 대한 조절 MAP 활성을 동시에 정량화하고 비교하는 방법을 제공한다. 또한,이 분석은 두 가지 유형의 번들을 검사 할 수 있습니다 : 역학이 시작되기 전에 안정적인 씨앗으로 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 사업은 NIH (No. 1DP2GM126894-01)의 보조금과 퓨 자선 신탁 및 스미스 가족 재단의 기금으로 R.S.에 지원되었습니다. 저자들은 프로토콜의 개발 및 최적화에 기여한 Shuo Jiang 박사에게 감사드립니다.
Materials
| (±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox) | Sigma Aldrich | 238813 | |
| 1,4-piperazinediethanesulfonic acid (PIPES) | Sigma Aldrich | P6757 | |
| 18×18 mm #1.5 coverslips | Electron Microscopy Sciences | 63787 | |
| 2-Mercaptoethanol (BME) | Sigma Aldrich | M-6250 | |
| 24×60 mm #1.5 coverslips | Electron Microscopy Sciences | 63793 | |
| 405/488/560/647 nm Laser Quad Band | Chroma | TRF89901-NK | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 320110 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma Aldrich | A7699-5G | |
| Avidin, NeutrAvidin® Biotin-binding Protein (Molecular Probes®) | Thermo Fischer Scientific | A2666 | |
| Bath sonicator: Branson 2800 Cleaner | Branson | CPX2800H | |
| Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 11 x 34 mm | Beckman-Coulter | 343778 | |
| Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 8 x 34 mm | Beckman-Coulter | 343776 | |
| Biotin-PEG-SVA, MW 5,000 | Laysan Bio | #Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | 2905 | |
| Catalase | Sigma Aldrich | C40 | |
| Corning LSE Mini Microcentrifuge, AC100-240V | Corning | 6670 | |
| Delicate Task Wipes | Kimtech | 34120 | |
| Dithiothreitol (DTT) | GoldBio | DTT10 | |
| Emission filter | Chroma | ET610/75m | |
| Ethanol (200-proof) | Decon Labs | 2705 | |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | Sigma Aldrich | 3777 | |
| Glucose Oxidase | Sigma Aldrich | G2133 | |
| GMPCPP | Jena Bioscience | NU-405 | |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate (GTP) | Sigma Aldrich | G8877 | |
| Hellmanex III detergent | Sigma Aldrich | Z805939 | |
| Immersion oil, Type A | Fisher Scientific | 77010 | |
| Kappa-casein | Sigma Aldrich | C0406 | |
| Lanolin | Fisher Scientific | S25376 | |
| Lens Cleaning Tissue | ThorLabs | MC-5 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma Aldrich | M9272 | |
| Methylcellulose | Sigma Aldrich | M0512 | |
| Microfuge 16 Benchtop Centrifuge | Beckman-Coulter | A46474 | |
| Microscope Slides, Diamond White Glass, 25 x 75mm, 90° Ground Edges, WHITE Frosted | Globe Scientific | 1380-50W | |
| mPEG-Succinimidyl Valerate, MW 5,000 | Laysan Bio | #NH2-PEG-VA-5K | |
| Optima™ Max-XP Tabletop Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | 393315 | |
| Paraffin | Fisher Scientific | P31-500 | |
| PELCO Reverse (self-closing), Fine Tweezers | Ted Pella | 5377-NM | |
| Petrolatum, White | Fisher Scientific | 18-605-050 | |
| Plasma Cleaner, 115V | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma Aldrich | 221473 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| Thermal-Lok 1-Position Dry Heat Bath | USA Scientific | 2510-1101 | |
| Thermal-Lok Block for 1.5 and 2.0 mL Tubes | USA Scientific | 2520-0000 | |
| Thermo Scientific™ Pierce™ Bond-Breaker™ TCEP Solution, Neutral pH; 500mM | Thermo Fischer Scientific | PI-77720 | |
| TIRF 100X NA 1.49 Oil Objective | Nikon | CFI Apochromat TIRF 100XC Oil | |
| TIRF microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| TLA 120.1 rotor | Beckman-Coulter | 362224 | |
| TLA 120.2 rotor | Beckman-Coulter | 357656 | |
| Tubulin protein (>99% pure): porcine brain | Cytoskeleton | T240 | |
| Tubulin Protein (Biotin): Porcine Brain | Cytoskeleton | T333P | |
| Tubulin protein (fluorescent HiLyte 647): porcine brain | Cytoskeleton | TL670M | |
| Tubulin protein (X-rhodamine): bovine brain | Cytoskeleton | TL620M | |
| VECTABOND® Reagent, Tissue Section Adhesion | Vector Biolabs | SP-1800-7 | |
| VWR® Personal-Sized Incubator, 120V, 50/60Hz, 0.6A | VWR | 97025-630 | |
References
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